蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途[0001]【技术领域】: 本发明属于医药【技术领域】，涉及蟾饲五谷虫抗菌肽的新用途，具体涉及蟾饲五谷虫抗菌肽在制备抑菌剂中的应用。[0002] 蟾饲五谷虫是以蟾蜍科属中华大蟾蜍(Bufobufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蛛(B.melanostictus Schneider)等尸体为培养基质,人工培养的丽蝇科昆虫大头金蝇或其近缘昆虫的干燥幼虫。主产于华中、华东地区，我国各地区均有分布，一年四季均可采收。蟾饲五谷虫含蛋白质质量分数为62.70%、脂肪质量分数为11.20%、几丁聚糖质量分数为16%，氨基酸18种，含抗菌肽质量分数为0.264%。另外还含有华蟾蜍毒基和羟基华蟾蜍毒基等成分。[0003]抗菌肽(antibacterial peptides)广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽(Prates MV, Sforca ML, Regis ffc,The NWR-derived solution structure of a new cationic antimicrobial peptidesfrom the skin secretion of the anuran Hyla Punctana [J].J Biol Chem.2004,279(13):13018-13026.) 。抗菌肽广泛存在于动物的免疫细胞(如吞噬细胞)、各种脏器的粘膜、皮肤以及植物的花、果、叶中。抗菌肽也被成为生物的第二防御体系，家蝇抗菌肽的产生是由于外界环境的干扰，或者经过免疫诱导等方式，让家蝇体内产生一种免疫小分子即抗菌肽，但是免疫方式操作繁琐，工作量 大。[0004]不同的抗菌肽抑菌种类和抑菌效果往往不尽相同，因此可以采用不同的受试菌研究蟾饲五谷虫抗菌肽的抑菌结果，选择抑菌活性较强的受试菌，从而使其更有效地得以利用。[0005]

[0006]本发明所解决的技术问题是提供蟾饲五谷虫抗菌肽的新用途，具体涉及其在制备抑菌剂中的应用。
[0007]本发明是通过如下技术方案实现的:
蟾饲五谷虫抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌，志贺杆菌具有抑制作用，尤其针对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。
[0008]其中，蟾饲五谷虫抗菌肽通过如下方法获得:
(I)提取
蟾饲五谷虫为沸水处理过的干燥虫体，称取50g两份，一份用磷酸盐缓冲溶液溶剂(0.05mol/L 的 NaH2P04 81.7 ml 与 0.05mol/L Na2HP04 12.3ml，调 PH 为 6)处理，另一份用0.05mol/L乙酸铵溶剂(用乙酸调节PH为5)处理。样品干燥虫体和溶剂比为1:2，用匀浆机搅拌半个小时，放置一个晚上，样品液分别记号为I号和2号。放置过夜的样品，将I号液采用低速离心机以5000r/min的速度离心15min，得上清液，除去大颗粒杂质，将上清液继续用0.22um的滤膜减压过滤,得到的滤液用高速离心机15000r/min的速度离心30min,除去细胞器杂质等物质，滤液继续用0.22um的滤膜过滤的滤液，得到的I号澄清滤液。2号样品液仍然采用相同的处理方法。即得到2号澄清样品液。
[0009](2)样品的除脂
以2号液磷酸盐缓冲溶液所提样品进行除脂处理，首先用相同体积的正己烷萃取12h，，然后得到的水层采用相同体积的乙酸乙酯液离心。离心后得到的水层采用4摄氏度冰箱保存。
[0010](3)样品的浓缩
盐析，是在蛋白质溶液中加入中性盐，破坏蛋白质的水化膜，而达到使蛋白质沉淀的作用，常用的中性盐有氯化钠，硫酸铵，由于硫酸铵在水溶液中溶解度大，且比较容易除去，所以我们采用硫酸铵盐析的方式。
[0011]实验中我们以80%的硫酸铵沉淀，慢慢的加入硫酸铵，防止局部过浓，引起蛋白质变性，I号和2号液均采取这样的方式处理，盐析半个小时。
[0012](4)样品的再溶解 盐析过的I号和2号蛋白液,利用高速离心机,15000r/min离心15min,除去上清液,I号采用磷酸盐缓冲溶液溶解，2号采用乙酸铵缓冲溶液溶解,溶解液备用。
[0013](5)样品溶液除菌
在无菌操作台下，用可以灭菌的0.22um的滤膜，用无菌的注射器，吸取I号和2号溶液，过滤膜，得到样品无菌液。
[0014]蟾饲五谷虫抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌，志贺杆菌具有抑制作用，尤其针对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。
[0015]试验结果表明，蟾饲五谷虫抗菌肽可以用于制备抑菌剂。
[0016]



[0017]图1为甲型沙门伤寒杆菌抑菌结果；
图2为志贺杆囷的抑囷结果；
图3为甲型沙门杆菌的抑菌结果；
图4为对照组抑菌结果；
图5为肠炎沙门杆菌的抑菌结果；
图6为金黄色葡萄球菌的抑菌结果；
图7为大肠杆菌的抑菌结果；
图8为枯草杆菌的抑菌结果；
图9为苏云金芽孢杆菌的抑菌结果；
图10为苏云金芽孢杆菌亚型的抑菌结果；
图11为阴沟肠杆菌抑菌结果。[0018]

[0019]实施例1:
蟾饲五谷虫抗菌肽的制备:
(I)提取
蟾饲五谷虫为沸水处理过的干燥虫体，称取50g两份，一份用磷酸盐缓冲溶液溶剂(0.05mol/L 的 NaH2P04 81.7 ml 与 0.05mol/L Na2HP04 12.3ml，调 PH 为 6)处理，另一份用0.05mol/L乙酸铵溶剂(用乙酸调节PH为5)处理。样品干燥虫体和溶剂比为1:2，用匀衆机搅拌半个小时，放置一个晚上，样品液分别记号为I号和2号。
[0020]放置过夜的样品，将I号液采用低速离心机以5000r/min的速度离心15min，得上清液，除去大颗粒杂质，将上清液继续用0.22um的滤膜减压过滤，得到的滤液用高速离心机15000r/min的速度离心30min,除去细胞器杂质等物质,滤液继续用0.22um的滤膜过滤的滤液，得到的I号澄清滤液。2号样品液仍然采用相同的处理方法。即得到2号澄清样品液。[0021](2)样品的除脂
以2号液磷酸盐缓冲溶液所提样品进行除脂处理，首先用相同体积的正己烷萃取12h，，然后得到的水层采用相同体积的乙酸乙酯液离心。离心后得到的水层采用4摄氏度冰箱保存。
[0022](3)样品的浓缩
盐析，是在蛋白质溶液中加入中性盐，破坏蛋白质的水化膜，而达到使蛋白质沉淀的作用，常用的中性盐有氯化钠，硫酸铵，由于硫酸铵在水溶液中溶解度大，且比较容易除去，所以我们采用硫酸铵盐析的方式。
[0023]实验中我们以80%的硫酸铵沉淀，慢慢的加入硫酸铵，防止局部过浓，引起蛋白质变性，I号和2号液均采取这样的方式处理，盐析半个小时。
[0024](4)样品的再溶解
盐析过的I号和2号蛋白液,利用高速离心机,15000r/min离心15min,除去上清液,I号采用磷酸盐缓冲溶液溶解，2号采用乙酸铵缓冲溶液溶解,溶解液备用。
[0025](5)样品溶液除菌
在无菌操作台下，用可以灭菌的0.22um的滤膜，用无菌的注射器，吸取I号和2号溶液，过滤膜，得到样品无菌液。
[0026]实施例2:
抑菌试验:
(1)抑菌试验的前处理
抑菌试验所需的培养皿，移液管，三角爬，接种针，琼脂片都需要灭菌，我们设置灭菌锅温度为121.3 C，灭圃30rnin.(2)培养基的配置:
配置固体培养基，牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCL5g,琼脂15g，水1000ml，用NaOH调节PH7.0-7.2，配置完的固体培养基倒入250ml锥形瓶中，密封瓶口，放入灭菌锅中和其它仪器一起灭菌。灭菌条件同上。
[0027](3)抗菌肽溶液浓度的测定
采用考马斯亮兰法(Bradofrd法)，蛋白标液:准确称取结晶牛血清白蛋白50mg,用
0.9 %NaCL溶液配成浓度为400ug/mL的溶液。显色液:称取考斯亮兰G250400mg，置于玻璃研钵中,加入0.5mL高氯酸研磨约30分钟后，再加入1.0mL高氯酸，继续充分研磨至完全溶解。加入约194mL水4.5mL高氯酸，混匀，用三角漏斗过滤。以3%的高氯酸溶液将滤液在465nm处的吸光度调至1.3 — 1.5之间(Icm比色杯)。避光存放显色液。
[0028]标准曲线的制作:取6支洁净试管，分别按下表加入试剂，各管混匀后，以蒸馏水作参比，测定各管在波长595nm和波长465nm处吸光度A值。计Ai=0D595/0D465之值，以Ai’ = Ai — Al为纵坐标,蛋白浓度为横坐标,绘制蛋白浓度标准曲线。并计算Ai’ =Ai 一Al，于标准曲线上查出对应蛋白浓度。
[0029]