专利名称：一种抗菌肽、其制备方法和用途的制作方法由于抗生素药物的广泛使用已经造成许多致病菌产生抗性，目前生物医药界将越来越多的精力投入到新概念药物——抗菌肽领域。抗菌肽是在整个生物界内广泛存在的一类双亲性小分子碱性多肽，其可见于各种生物体内，例如细菌、真菌、植物、昆虫、鱼类、鸟类、甲壳动物、两栖动物和哺乳动物等。目前已有抗菌肽超过750种之多，其中绝大部分为阳离子抗菌肽，也有少量阴离子抗菌肽。抗菌肽表现出广谱抗微生物活性，并对细菌毒素有中和作用，其作用机制独特，不易产生耐药性，而且某些抗菌肽只对原核生物和突变细胞起作用，对真核生物无害，因而在许多致病菌产生了明显耐药性的情况下，抗菌肽的发现和深入研究为开发全新的抗菌药物提供了可能。然而，虽然抗菌肽可以作为一类具有广谱高效抑菌效果、致病菌很难产生耐性的新概念药物，但是，天然抗菌肽来源极为有限，在抗菌肽作为新药研究和开发中，抗菌肽的获得也是亟待解决的问题。
本发明的目的在于提供一种新型抗菌肽。本发明的另一个目的是提供所述抗菌肽的制备方法。此外，本发明的有一个目的是提供所述抗菌肽在制备抗菌药物中的用途。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一方面，本发明提供一种抗菌肽，所述抗菌肽包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。优选地，所述抗菌肽为SEQ ID NO : I所示氨基酸序列的肽。其中，所述抗菌肽分离自长角血蜱，分子量为5. 3kDa，等电点为8. 68。另一方面，本发明提供制备上述抗菌肽的方法，所述方法包括1)收集长角血蜱的唾液；2)将步骤I)中收集到的唾液进行超速离心过滤；以及3)将步骤2)中得到的滤液组分进行凝胶过滤层析。此外，上述制备方法进一步包括4)将步骤3)中通过凝胶过滤层析得到的洗脱液通过HPLC反相高效液相色谱进行纯化。优选地，上述方法的步骤I)包括兔血饲喂长角血蝶使之体重达200-300 μ g,然后将该血蝶清洁干净,使用唾液分泌诱导剂诱导血蜱分泌唾液，当观察到血蜱开始分泌唾液后，将血蜱放在34. 5-35. 5°C、优选35°C的盒子中2-3小时，之后收集该长角血蜱分泌的唾液并于_70°C储存备用；优选地，所述唾液分泌诱导剂为毛果芸香碱，诱导剂量为每只长角血蜱O.8-1. I μ g、优选Iyg的毛果芸香碱，初次给至血蝶后每隔20分钟添加O. 5 μ g毛果芸香碱，直到观察到血蜱分泌少量唾液为止。上述方法的步骤2)优选包括取200_300μ I步骤I)中收集到的长角血蜱唾液，使用截留分子量为IOkDa的 ΥΜ-10滤膜和截留分子量为3kDa的YM-3滤膜于4°C超速离心，得到组分II，即分子量在 3-10kDa之间的滤液。上述方法的步骤3)优选包括将步骤2)中得到的组分II加到Superdex Peptide 10/300凝胶过滤层析柱上， 柱子规格IOmmX 300mm，并且过滤柱用30% (体积比v/v)的乙腈甲醇溶液(乙腈为溶质， 甲醇为溶剂)和0.1% (体积比v/v)甲酸(甲酸溶于水)预平衡，然后以5 μ 1/min的流速收集第3个洗脱峰的洗脱液。上述方法的步骤4)优选包括采用O. 3mmX 150mm C8磁性柱、ABI 140D泵和785A紫外检测仪，以2或5 μ 1/min 的速度灌柱；溶液A为含10%甲醇和O. 1%甲酸的水溶液(体积比v/v)，溶液B组分为30% (体积比v/v)乙腈甲醇溶液和0.1% (体积比v/v)甲酸溶液；色谱柱用前用溶液A预平衡，柱子平衡后将步骤3)中得到的第3个峰的洗脱液加到柱子上，然后再以梯度10% -95%加入溶液B，流速控制在5 μ 1/min，持续20min，然后流速调整到2 μ 1/min，然后用馏分收集器每隔Imin收集一次洗脱液。又一方面，本发明提供上述抗菌肽在制备抗菌药物中的用途。以下是本发明的详细描述根据本发明的一个，采用下述步骤获得目标抗菌肽I)从森林捕捉野生的长角血蝶(Haemaphysalis Iongicornis),在试验条件下通过新西兰大白兔进行饲养。在收集血蜱唾液前,让血蜱在兔耳朵吸血120小时以上，血蜱体重达到 200-300 μ g。2)长角血蜱的唾液的收集将体重达到200-300 μ g的血蝶用纯净水冲洗干净,放在洁净的载玻片上,然后用一个干净的玻璃毛细管放到血蜱的口下板准备收集唾液，使用唾液分泌诱导剂毛果芸香碱 (又称匹鲁卡品)滴加到蜱口下板从而诱导血蜱分泌唾液，诱导剂剂量为2 μ I的O. 5mg/ml 毛果芸香碱乙醇溶液(5mg毛果芸香碱,用IOOml 95%乙醇溶液配制)。每隔20min添加 I μ I毛果芸香碱乙醇溶液，直到观察到血蜱分泌少量唾液为止。然后，将血蜱放在35°C的湿盒子中2-3小时。然后取出毛细管，察看唾液量。每个血蜱大约能够采集15-30 μ I的唾液，然后将这些唾液富集起来，放在_70°C备用。3)抗菌肽的纯化将收集到的200-300 μ I的血蜱唾液，于4 °C超速离心，离心条件为20000rpm， 20min，离心时使用YM-10 (截留分子量为IOkDa)和YM-3的滤膜(截留分子量为3kDa)过滤。滤液用于检测抗菌活性。再将富集浓缩的抗菌组分通过连续的Superdex Peptide 10/300凝胶过滤层析柱分离，最后得到纯化的抗菌肽成分。简言之,将血蝶唾液中含抗菌肽的滤液加到Superdex Peptide 10/300凝胶过滤层析柱上，柱子规格10mmX300mm。用前，过滤柱用30%的乙腈甲醇溶液和O. 1%甲酸预平衡，然后以O. 25ml/min的流速收集洗脱液。洗脱液在215nm监测吸光度值，收集所有峰值的洗脱液，并用微量真空离心浓缩洗脱液，浓缩后的洗脱液用于检测抗菌活性。将上述具有较高抗菌活性的洗脱液，进一步通过HPLC反相高效液相色谱系统再次纯化。HPLC色谱柱的规格0. 3mmX 150mm C8磁性柱。通过ABI 140D泵和785A紫外检测仪以2或5 μ 1/min的速度灌柱。溶液A组分为O. I %甲酸溶液，溶液B组分为30%乙腈甲醇溶液和O. 1%甲酸溶液。色谱柱用前用10%甲醇溶液和O. 1%甲酸溶液平衡,柱子平衡后将样品加到柱子上，然后再以梯度10% -95%加入溶液B，流速控制在5 μ 1/min，持续 20min，然后流速调整到2μ 1/min。然后用吉尔森203B馏分收集器，每隔Imin收集一次洗脱液。然后用纳米Drop UV/vis光谱仪测定蛋白质值，并检测这些馏分的抗菌活性。4)质谱检测抗菌肽的分子量用MALDI/T0F-MS质谱分析仪对上述纯化的抗菌肽分子量进行测定。基质溶液为 I-氰基-4-轻基酸(Sigma公司)100%乙腈溶液(分析纯)。5)氨基酸序列分析上述抗菌肽用Edman降解法测定N-末端氨基酸顺序。用脉冲自动测序仪检测乙内酰苯硫脲衍生物。将该抗菌肽的氨基酸序列通过NCBI的BLASTP和NR数据库进行比对。综上所述，本发明提供了一种从长角血蜱的唾液中分离的抗菌肽，该抗菌肽具有5.3kDa的分子量，等电点为8. 68，并且其氨基酸序列如SEQ IDNO : I所示，由19个氨基酸残基组成。实验证明，本发明提供的抗菌肽具有较为广泛的抗菌性能，并且溶血实验证明该抗菌肽不表现显著的溶血活性，对细胞毒性低，在研究和开发全新的抗菌药物中具有较大的潜力。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图I为组分II的凝胶层析色谱分析结果；图2为图I中峰3的HPLC的色谱分析结果；图3为本发明的抗菌肽的质谱分析结果；图4为本发明的抗菌肽在长角血蜱不同组织的表达情况，其中1.标准蛋白低分子量；2.脂肪体；3.血细胞；4.唾液腺；5.肠。

7.G1808，)，枯草芽孢杆菌(B. subtilis)(菌株保藏号CCTCC AB205127，)，金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(菌株保藏号 NKCCMR NK 7. G1758)；革兰氏阴性菌大肠杆菌EDL933(菌株保藏号GMl. 299)和大肠杆菌MG/655 (菌株保藏号GMl. 215)。检测方法如下将上述细菌培养在Luria-Bertain(LB)培养液中，当生长到OD6tltlnm值为O. 8时，取 10 μ I菌液加入到8ml新鲜的含O. 7%琼脂LB培养基中，然后将上述稀释后的菌液倒到盛有25ml含有I. 5%琼脂LB培养基的直径90mm的皮氏培养皿。待上层琼脂凝固后，将20 μ I 检测样品涂擦到上层琼脂表面，晾干后于37°C培养过夜。抗菌活性的判定观察细菌生长培养基表面形成一个明确的区域的大小，代表检测样品的抑菌程度。最小抑菌浓度(MIC)是指检测样品没有出现明显的细菌生长的最低浓度。检测样品的浓度测定用215nm和225nm的紫外吸光度值来计算，公式为浓度(mg/ml) =(A215-A225nm) X0. 144。每个样品做3个重复。对分离自长角血蜱唾液的3个组分进行了上述抑菌活性的检测，结果表明血蜱唾液的三组分的抗菌活性存在差异(见表I)，其中抗菌活性最高的为组分II，最小抑菌浓度为 3. 5 μ g/mlo表I各个组分的抗大肠杆菌EDL933的活性


本发明提供了一种新型抗菌肽，所述抗菌肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。所述多肽是一个分子量为5.3kDa的长角血蜱分泌蛋白，pI为8.68，这个蛋白有19个氨基酸，不含保守的结构域，并且具有较为广泛的抗菌活性。此外，本发明还提供了所述抗菌肽的制备方法及其用途。