专利名称：一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法在食品工业中，各类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题，据估计，我国每年约有20% 30%的食物因食物腐败而遭到严重的损失。食品腐败变质不仅降低食品的营养价值，严重时还会造成食物中毒。食品腐败的原因有多方面，包括物理、化学、酶及微生物四个方面的因素，其中微生物作用最为严重。食品在加工、保藏、消费过程中容易受到细菌、酵母菌、霉菌等一系列微生物的侵染，这就决定了食品防腐剂在食品工业中将发挥至关重要的作用。通过防腐剂抑制或杀灭微生物，可以起到阻止、延缓食品的变质，甚至提高食品的品质的作用。为了延长食品的保藏期限，人们在食品加工过程中采用不同的手段使微生物丧失活性，延缓或阻止其生长。添加防腐剂是其中一种使用方便、非常有效的食品防腐方法，因而被普遍采用。食品防腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂，过去人们大都使用合成防腐剂，如苯甲酸、山梨酸及其盐类、对羟基苯甲酸脂类等。而人工合成的防腐剂具有诱发癌症的发生、致使出现畸形婴幼儿和引起食物中毒等问题，同时人工防腐剂中的苯甲酸盐能够引起食物中毒，而亚硝酸盐和硝酸盐容易造成癌症的发生。随着生活水平的提高，人们对防腐剂的要求也越来越高，不但要求防腐剂安全、无毒，而且要求防腐剂营养化和功能化。天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性及热稳定性好、作用范围广等优点，而且还具有一定的营养价值，但是目前天然防腐剂的合成方法复杂，不易合成。抗菌肽是生物在长期进化过程中为适应环境、求得生存而产生的免疫活性分子， 具有选择性效应，分子质量小、无抗原性，被认为是天然免疫的重要介质。抗菌肽在宿主对抗病原入侵的免疫防御中起着极其重要的作用，因此被形象地称为“天然抗菌剂”或“阳离子宿主防御肽”，是重要的分子屏障。发明内容本发明针对上述问题，提供了一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，其制备方法简单，操作方便等优点，保存食品时所需剂量低、效果明显。本发明涉及到以下菌种和试剂巴斯德毕赤酵母X-33菌和大肠杆菌JM109为普通未变异的巴斯德毕赤酵母X-33菌和大肠杆菌JM109，通过实验室提取或市场购买均能得到，而本发明中的巴斯德毕赤酵母 X-33菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心和大肠杆菌JM109购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；所述的载体为酵母表达载体PPICZ-α-A，在市场上即可购买得到，在本发明中酵母表达载体pPICZ- α -A购于上海英俊生物技术有限公司，其产品为(GLD195)；DNA凝胶回收试剂盒购买于碧云天生物技术研究所，该试剂盒中自配有成品的DNA纯化结合液，洗涤液，洗脱液，DNA纯化柱，收集管；限制性内切酶》ιο I、限制性内切酶Xba I、限制性内切酶BamH I缓冲液、T4DNA连接酶、10倍T4DNA连接酶缓冲液、限制性内切酶勒·/ II、10倍限制性内切酶勒·/ II缓冲液、限制性内切酶Mc I和10倍限制性内切酶Mc I缓冲液购买于大连宝生物工程有限公司；浓度为2. 5mmol的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、10倍PCR缓冲液、浓度为25mmol Mg2+ 的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶购买于上海生工生物工程技术服务有限公司；通用鉴定引物5’ AOX和引物3’ AOX购买于上海生工生物工程技术服务有限公司；
一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，
步骤一、抗菌肽Metnikowin- II H基因的设计与合成
1)根据全球公共序列数据库Genebank中记载序列号为P80409的抗菌肽 Metnikowin- II的核苷酸序列为模板，在抗菌肽Metni kowin- II的核苷酸序列后端加入6个组氨酸，即加入6个cat的核苷酸序列，形成抗菌肽Metnikowin- II H，以抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列为模板，依据毕赤酵母的偏嗜性，分别在抗菌肽 Metnikowin- II H基因的前端加入限制性内切酶xho 的酶切位点，后端加入限制性内切酶 Xba I的酶切位点，并在限制性内切酶)(ba I的酶切位点前端加入终止密码子UAA，将设计好的核苷酸序列进行合成；
其中抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列为
GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat 将抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸翻译为氨基酸，抗菌肽Metnikowin- II H的氨基酸序列为
VDKPDLRPRPffPRPNHHHHHH
步骤二、抗菌肽Metnikowin- II H基因的酶切、回收
1)酶切体系的配制在0.5ml离心管a中加入8. Ομ 抗菌肽Metnikowin- II H基因、 0. 5μ1限制性内切酶)(ho I、0·5μ1限制性内切酶)(ba 1,2. Ομ 限制性内切酶缓冲液和 9. Ομ 去离子水，混合均勻，形成混合物Α，将混合物A放入37° C水浴锅中，反应3小时，取出，备用；
2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测
利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物Α，在凝胶成像系统中确认混合物A中含有酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因的目的基因；
3)用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的抗菌肽Metnikowin-II H基因进行回收、纯化 取1. 5ml离心管a并称其重量，在紫外灯下将混合物A从步骤2)中的凝胶上切下，将
切下的混合物A放在已称重的1. 5ml离心管a中，称取1. 5ml离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，将1. 5ml离心管a中的混合物A捣碎，按每g混合物A 加入ImlDNA纯化结合液的比例加入DNA纯化结合液，混合均勻，将1. 5ml离心管a放置在 50° C水浴中加热至混合物A完全融解，得到混合液A，将混合液A加入到DNA纯化柱a上， DNA纯化柱a位于收集管a内，将收集管a置于21°C条件下放置1分钟，后将收集管a放到离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入700 μ 1洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，将收集管a在21°C条件下放置1分钟，后将收集管a送入离心机中，转速为12000转/分钟， 离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入500 μ 1洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，后将收集管a放入离心机中，转速为 12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a中的液体后， 将DNA纯化柱a置于收集管a内，再将收集管a放入离心机内，转速13000转/分钟，离心 1分钟，取出DNA纯化柱a将其放置于1. 5ml离心管b中，后在DNA纯化柱a上加入30 μ 1 洗脱液，使1. 5ml离心管b在21°C条件下放置1分钟，后放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到1. 5ml离心管中b中的液体，该液体就是酶切、回收并纯化后的抗菌肽Metnikowin- II H基因，存储于_20°C条件下，备用；步骤三、酵母表达载体PPICZ- α -A酶切、回收1)酶切体系的配制在0.5ml离心管b中加入8. Ομ 酵母表达载体pPICZ- α -Α、0. 5μ1 限制性内切酶》ιο I、0. 5μ1限制性内切酶)(ba Ι、2. Ομ 限制性内切酶缓冲液和9. Ομ 去离子水，混合均勻，形成混合物B，将混合物B放入37° C水浴锅中，反应3小时，取出，备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物B进行检测利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中确认混合物B中含有酶切后的酵母表达载体PPICZ- α -A ；3)用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α -A进行回收、纯化依据步骤二中对混合物B即酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因进行回收与纯化的方法对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收与纯化，将回收、纯化后的酶切酵母表达载体pPICZ-α-A，存储于_20°C条件下，备用；步骤四、抗菌肽Metnikowin- II H基因和酵母表达载体pPICZ-α -A的连接连接体系的配制在0. 5ml离心管c中加入2. Ομ 酶切酵母表达载体pPICZ-α -Α、 6. Ομ 酶切抗菌肽 Metnikowin- II H 基因、1. Ομ 的 Τ4 DNA 连接酶和 1. 0 μ 110 倍 Τ4 DNA 连接酶缓冲液，混合均勻，后将0. 5ml离心管c放在4°C条件下，放置12小时，形成混合物 C，备用；步骤五、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化均在无菌条件下操作，大肠杆菌JM109感受态细胞的制备1)在IOml离心管a中加入5mlLB液体培养基和一个大肠杆菌JM109单菌落，混合均勻，转速为200转/分钟，37°C条件下，培养12小时，形成混合菌液I，备用；2)在150ml三角瓶中加入Iml混合菌液I和IOOmlLB液体培养基，混合均勻，形成混合菌液II，转速为200转/分钟，37°C条件下进行培养，待混合菌液II的0D600=0. 4时停止培养，后将含有混合菌液II的150ml三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置10分钟，备用；3)在1.5ml离心管c中加入步骤2)中放置后的混合菌液II 1ml，将1. 5ml离心管c送入4°C离心机内，转速为4000转/分钟，离心5分钟，弃去1. 5ml离心管c内沉淀上层的液体，后在1. 5ml离心管c内加入500μ1的4°C CaCl2溶液，浓度为0. lmol/L,混合均勻，后将1. 5ml离心管c置于0°C冰水混合物中，放置30分钟，然后1. 5ml离心管c送入4°C离心机内，转速为4000转/分钟，离心1分钟，弃去1. 5ml离心管c内沉淀上层的液体，再加入 200μ1的4°C CaCl2溶液，浓度为0. lmol/L，混合均勻，置于4°C条件下，放置12小时，形成大肠杆菌JM109感受态细胞，备用；
大肠杆菌JM109感受态细胞的转化
1)在1.5ml离心管d中加入200 μ 1大肠杆菌JM109感受态细胞和10 μ 1步骤四中的混合物C，混合均勻，将1. 5ml离心管d置于0°C冰水混合物中，放置30分钟，后取出将1. 5ml 离心管d置于42°C的水浴锅内，放置90秒，取出，再将1. 5ml离心管d置于0°C冰水混合物中，放置5分钟后，取出，备用；
2)在步骤1)的1.5ml离心管d内加入800 μ ILB液体培养基，混合均勻，送入37°C摇床内，转速为150转/分钟，离心45分钟，后送入离心机内，转速为300转/分钟，离心30 秒，弃去1. 5ml离心管d内沉淀上层的液体，得到沉淀物I，备用；
3)取200μ 1步骤2)中的沉淀物I，并涂布于含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB固体培养基上，放置20分钟，后置于37°C条件下，培养16小时，形成培养菌落，备用；
步骤六、重组质粒的筛选和酶切鉴定
1)在50ml离心管a中加入45ml含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB液体培养基和步骤五中的一个培养菌落，混合均勻，在37°C条件下，培养12小时，后将50ml离心管a送入离心机内，转速为300转/分钟，离心3秒，弃去50ml离心管a内沉淀上层的液体，得到沉淀物II，备用；
2)在0.5ml离心管d中加入5. Oug沉淀物II、0. 5 μ 1限制性酶切酶々§·_/ II、2. 0 μ 1的 10倍限制性酶切酶ife·/ II缓冲液和12. 5 μ 1去离子水，混合均勻，形成混合物D，后将0. 5ml 离心管d送入37°C水浴锅内，放置3小时，备用；
3)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物D进行检测
利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物D，在凝胶成像系统中确认混合物D中含有酶切后的重组质粒 pPICZ- α -Metnikowin- II H ；
将酶切后的重组质粒pPICZ-α -Metnikowin- II H进行序列测定，测序完成后利用生物软件DNAstar进行碱基序列比对、同源性分析；
步骤七、重组质粒pPICZ-α -Metnikowin- II H的线性化
1)在0.5ml离心管e中加入混合物D即酶切后的20ug重组质粒 pPICZ-α-Metnikowin- II Η、5μ 1限制性酶切酶&ic I、20μ 1的10倍限制性酶切酶&ic I 缓冲液和175 μ 1去离子水，混合均勻，形成混合物Ε，后将0. 5ml离心管e置于37°C水浴锅内，放置4小时，备用；
2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物E进行检测
利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物E，在凝胶成像系统中确认混合物E中含有线性化后的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin- II H，其线性化后的目的片段为3600bp，备用；
3)在1.5ml离心管e中加入190μ 1混合物E即线性化的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin- II H、200 μ 1去离子水和390 μ 1苯酚，混合均勻，形成混合物F，后将1. 5ml离心管e送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上层澄清液体I，在1. 5ml 离心管f中加入200 μ 1上层澄清液体I和200 μ 1酚与氯仿混合液，混合均勻，后将1. 5ml 离心管f送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上层澄清液体II，在1. 5ml 离心管g中加入200 μ 1上层澄清液体II、20 μ 1浓度为3mol且pH为5. 2的NaAC和500 μ 1 的0°C无水乙醇，混合均勻，在_20°C条件下放置1小时，然后将1. 5ml离心管g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1. 5ml离心管g内沉淀上层的液体，在含有沉淀的1. 5ml离心管g内加入500 μ 1浓度为70%的乙醇，混合均勻，然后将1. 5ml离心管 g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1. 5ml离心管g内沉淀上层的液体，后1. 5ml离心管g内加入500 μ 1浓度为70%的乙醇，混合均勻，后将1. 5ml离心管g 送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1. 5ml离心管g内沉淀上层的液体，得到沉淀物III，在含有沉淀物III的1. 5ml离心管g中加入去离子水，形成浓度为Ιμβ/μ1 的 pPICZ- α -Metnikowin- II H 溶液，备用；步骤八、酵母菌Χ-33感受态细胞的制备1)巴斯德毕赤酵母Χ-33菌的活化在YPDS固体培养基中接种巴斯德毕赤酵母X-33菌，将YPDS固体培养基置于30°C 条件下培养72小时，观察到白色单个菌落，备用；2)在无菌条件下制备巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞①在IOml离心管b中加入5ml的YPDS液体培养基和一个巴斯德毕赤酵母X_33菌的单菌落，混合均勻，形成混合菌液III，30°C条件下培养12小时，备用；②在250ml三角瓶中加入0.5ml混合菌液III和50mlYPDS液体培养基，混合均勻，形成混合菌液IV，30°C条件下进行培养，待混合菌液IV的0D600=1. 5时停止培养，形成混合液B， 在50ml离心管b中加入45ml混合液B，将50ml离心管b送入4°C离心机内，转速为2500 转/分钟，离心5分钟，弃去50ml离心管b内沉淀上层的液体，后在50ml离心管b中加入 45ml去离子水，混合均勻，将50ml离心管b送入4°C离心机内，转速为1500转/分钟，离心 5分钟，得到沉淀，在含有沉淀的50ml离心管b内再次加入45ml去离子水，混合均勻，然后将50ml离心管b送入4°C离心机内，转速为1500转/分钟，离心5分钟，得到沉淀物V，备用；③重复步骤②的方法一次，后在含有沉淀物V的50ml离心管b中加入IOml浓度为 Imol的0°C D-山梨醇，混合均勻，将50ml离心管b送入4°C离心机内，转速为1500转/分钟，离心5分钟，得到沉淀物VI，备用；④在含有沉淀物VI的50ml离心管b内加入浓度为Imol的D-山梨醇，得到0D600=1. 0 的巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞，备用；步骤九、阳性重组子的制备及筛选1)在細1离心管中加入步骤七中10 μ 1浓度为l^g/的pPICZ-α - Metnikowin- II H 溶液和80 μ 10D600=1. 0的巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞，混合均勻，形成混合液C，备用；2 )在0° C条件下，将电击杯放于浓度为70%的乙醇中，浸泡30分钟后，取出，在电击杯内加入120 μ 1混合液C，将电击杯放置5分钟，后将电击杯放到电转化仪内，进行电击，电脉冲为25微法，电压为1. 5千伏，电阻为200欧姆，电击时间为0. 05秒，电击结束后，取出含有混合液C的电击杯，后在电击杯内加入ImlD-山梨醇，混合均勻，得到混合物G，将混合物G加到1. 5ml离心管h中，将1. 5ml离心管h送入30° C摇床中，转速为225转/分钟，培养2小时后，取100 μ 1培养后的混合物G，并将其涂布于含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的 YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30° C培养箱内，培养4天，得到白色单菌落，备用；4)将步骤3)中得到的全部白色单菌落接种到MM固体培养基上，然后将接种后的MM固体培养基置于30° C的培养箱内，培养3天，观察并得到巴斯德毕赤酵母Mut+菌落，备用；
5)取步骤4)中的一个巴斯德毕赤酵母Mut+菌落，并将其接种到含有浓度为IOOOPg/ ml博来霉素的YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30°C的培养箱内，培养3天，观察到单个菌落，即得到的阳性重组子，备用；
步骤十、对阳性重组子进行检测
1)在1.5ml离心管i中加入一个阳性重组子和100 μ 1的pH为8. 0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，形成混合液D，在1. 5ml离心管j中加入100 μ 1混合液D，混合均勻，将1. 5ml离心管j送入离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去 1. 5ml离心管j内沉淀上层的液体，在1. 5ml离心管j内加入500μ 1的PBS溶液，混合均勻， 将1. 5ml离心管j送入离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去1. 5ml离心管j 内沉淀上层的液体，在1. 5ml离心管j内加入100 μ 1 pH为8. 0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，后将1. 5ml离心管j置于100°C沸水中，加热10分钟，后将加热后的1. 5ml离心管j置于_80°C条件下，放置30分钟，取出，再将1. 5ml离心管j置于100°C 沸水中，加热10分钟，取出，将1. 5ml离心管j送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心 5分钟，得到上层液体，即得到酵母基因组DNA，备用；
2)利用通用鉴定引物5，AOX和3，AOX对步骤7)中的酵母基因组DNA进行PCR鉴定
PCR反应液的配制在0. 5ml离心管f中加入2. 5 μ 1酵母基因组DNA,2. 5 μ LlO倍PCR
缓冲液、1 μ 1浓度为2. 5mmol的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、1. 5 μ 1浓度为25mmol Mg2+的 PCR缓冲液、0. 25 μ 1的引物5，Α0Χ,0. 25 μ 1的引物3，Α0Χ,0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶禾口 16. 75 μ 1去离子水，混合均勻，PCR反应液，备用；
PCR程序将PCR反应液放入PCR仪内，PCR扩增共30个循环，先94°C预变性5分钟， 后94°C变性30秒、56°C退火30秒和72°C延伸45秒为一个循环，完成30个循环后，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物；
利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像系统中确认PCR产物中含有酵母基因组DNA目的片段，表明抗菌肽Metnikowin- II H基因己整合到酵母菌基因组内，即得到含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，备用；
步骤十一、阳性酵母重组子的诱导表达
1)取含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，将其接种到5ml含有浓度为IOOPg/ ml博来霉素的YPDS液体培养基上，混合均勻，形成培养菌液a，将培养菌液a置于30° C条件下培养12小时，在50ml离心管c中加入IOml BMGY液体培养基和0. 2ml培养后的培养菌液a，混合均勻，形成培养菌液b，将培养菌液b置于30° C条件下，培养至培养菌液b的 0D600=5时，将50ml离心管c送入离心机内，转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到沉淀物VL在50ml离心管d中加入30mlBMMY液体培养基和IOml沉淀物VL混合均勻，形成培养菌液c，将培养菌液c置于C条件下培养96小时，在培养过程中每隔M小时添加2ml浓度为0. 5%的甲醇，培养结束后，将50ml离心管d送入离心机内，转速为8000转/分钟，离心10分钟，得到上层澄清液体，即为表达后的抗菌肽Metnikowin- II H;
所述的载体为酵母表达载体PPICZ- α -A其产品为(GLD195)购于上海英俊生物技术有限公司；所述的含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB固体培养基的组成成份按重量百分比培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博来霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉，余量为水；所述的含有浓度为50μβ/πι1博来霉素的LB液体培养基的组成成份按重量百分比培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博来霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；所述的LB固体培养基的组成成份按重量百分比LB固体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉，余量为水；所述的LB液体培养基的组成成份按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；所述PBS溶液组成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化钠、0. 024%的磷酸二氢钾、0. 02%的氯化钾、0. 144%的磷酸氢二钠，余量为水；所述三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的组成成份每升三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的DNA纯化结合液的组成成份每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的洗涤液的组成成份按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的洗脱液的组成成份按重量百分比洗脱液中含有40%的浓度lOmol/L的乙酸钠、 8. 5%的冰醋酸，余量为水；所述的YPDS固体培养基的组成成份按重量百分比YPDS固体培养基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；所述的YPDS液体培养基的组成成份按重量百分比YPDS液体培养基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖，余量为水；所述的含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的YPDS固体培养基的组成成份按重量百分比培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博来霉素、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；所述的含有浓度为lOOOPg/ml博来霉素的YPDS固体培养基的组成成份按重量百分比培养基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、10%的博来霉素、洲的葡萄糖、洲的琼脂粉，余量为水；所述的含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的YPDS液体培养基的组成成份按重量百分比培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博来霉素、2%的葡萄糖，余量为水；所述的BMMY液体培养基的组成成份按重量百分比BMMY液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的无氨基酸酵母氮源、0. 4%生物素、0. 5%甲醇、1. 0%的磷酸盐缓冲液，余量为水；所述的BMGY液体培养基的组成成份按重量百分比BMGY液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的无氨基酸酵母氮源、0. 4%生物素、1%甘油、1. 0%的磷酸盐缓冲液，余量为水；14所述的MM固体培养基的组成成份按重量百分比MM固体培养基中含有1. 34%的无氨基酸酵母氮源、4xl0_5 %生物素、0. 5%甲醇、1. 5%的琼脂粉，余量为水；
所述的溶液II的组成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%浓度为lOmmol/L的氢氧化钠、10%的十二烷基磺酸钠，余量为水；
所述的溶液III的组成成份按重量百分比溶液III中含有60%的浓度5 mol/L的乙酸钾、 11. 5%的冰醋酸，余量为水；
所述的酚与氯仿混合液的组成成分按体积比酚与氯仿混合液中含有25份的酚和M 份的氯仿。有益效果
本发明提供的新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，该方法制备的食品防腐剂抗菌肽方法简单，便于操作，能够广泛的应用于市场，合成速度快，提高了生产成本，提高经济效益。利用本发明的制备防腐剂抗菌肽的方法所制的防腐剂抗菌肽，应用基因工程方法制备的抗菌肽Metnikowin- II H，与常用的化学防腐剂相比，安全性高，易溶于水，减少细菌感染的几率，不被细菌所利用，热稳定性好，PH值稳定性好，不易挥发。利用本发明的制备防腐剂抗菌肽的方法所制得的防腐剂抗菌肽，在人体内能够被人体内自身的酶降解、消化，在人体内不产生残留；本发明所制得的防腐剂抗菌肽可以降低灭菌时的温度、减少热处理时间，改善食品的营养价值、风味、结构、颜色等理化性状，从而可以降低生产成本；本发明所制得的防腐剂抗菌肽，其酸性、热稳定性和低温贮藏性能稳定，是一种良好的天然食品防腐保鲜剂。


图1为表达产物抗菌肽Metnikowin- II H的SDS-PAGE电泳图； 图2为表达产物抗菌肽Metnikowin- II H的热稳定性能检测曲线图； 图3为表达产物抗菌肽Metnikowin- II H的pH性能值检测曲线图4为表达产物抗菌肽Metnikowin- II H的苹果果汁抑菌活性检测图； 图中标号=Marker为14. 4kD、检测样品为表达产物抗菌肽Metnikowin- II H分子量为 2. 67kD、bl为试验样品s、Id2为试验样品t、b3为试验样品u、b4为浓度为0. 05%的山梨酸钾。

1)根据全球公共序列数据库Genebank中记载序列号为P80409的抗菌肽 Metnikowin- II,MET2的核苷酸序列为模板，在抗菌肽Metnikowin- II,MET2的核苷酸序列后端加入6个组氨酸，即加入6个cat的核苷酸序列，利用抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列为模板，依据毕赤酵母的偏嗜性，分别在抗菌肽Metnikowin- II H基因的前端加入限制性内切酶xho的酶切位点，后端加入限制性内切酶)(ba I的酶切位点，并在限制性内切酶)(ba I的酶切位点前端加入终止密码子UAA中的任意一种终止密码子，将设计好的核苷酸序列送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成；其中抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列为GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat将抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸翻译为氨基酸，抗菌肽Metnikowin- II H的氨基酸序列为VDKPDLRPRPffPRPNHHHHHH步骤二、抗菌肽Metnikowin- II H基因的酶切、回收1)酶切体系的配制在0.5ml离心管a中加入8. Ομ 抗菌肽Metnikowin- II H基因、 0. 5μ1限制性内切酶)(ho I、0·5μ1限制性内切酶)(ba 1,2. Ομ 限制性内切酶缓冲液和 9. Ομ 去离子水，混合均勻，形成混合物Α，将混合物A放入37°C水浴锅中，反应3小时，取出，备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测称取0. 5克琼脂糖粉末加到含有50毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙锭溶液，混合均勻，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳， 在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5 μ 1的混合物A和2 μ IDNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关， 在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中确认混合物A中含有酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因的目的基因；3)用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的抗菌肽Metnikowin-II H基因进行回收、纯化取1. 5ml离心管a并称其重量，在紫外灯下将混合物A从步骤2)中的凝胶上切下，将切下的混合物A放在已称重的1. 5ml离心管a中，称取1. 5ml离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将1. 5ml离心管a中的混合物A捣碎，加入与混合物 A等体积的DNA纯化结合液，混合均勻，将1. 5ml离心管a放置在50° C水浴中加热至混合物 A完全融解，得到混合液A，将混合液A加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a 内，将收集管a置于21°C条件下放置1分钟，后将收集管a放到离心机中，转速为12000转/ 分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱 a上加入700 μ 1洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，将收集管a在21°C条件下放置1 分钟，后将收集管a送入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的 DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入500 μ 1洗涤液，将DNA纯化柱 a置于收集管a内，后将收集管a放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a中的液体后，将DNA纯化柱a置于收集管a内，再将收集管a放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a将其放置于1. 5ml离心管b中，后在DNA纯化柱a上加入30 μ 1洗脱液，使1. 5ml离心管b在21°C条件下放置1分钟，后放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到1. 5ml离心管中b中的液体，该液体就是酶切、回收并纯化后的抗菌肽Metnikowin- II H 基因，存储于_20°C条件下，备用；步骤三、酵母表达载体PPICZ- α -A酶切、回收1)酶切体系的配制在0. 5ml离心管b中加入8. Ομ 酵母表达载体pPICZ- α -Α、0. 5μ1 限制性内切酶》ιο I、0. 5μ1限制性内切酶)(ba Ι、2. Ομ 限制性内切酶缓冲液和9. Ομ 去离子水，混合均勻，形成混合物B，将混合物B放入37° C水浴锅中，反应3小时，取出，备用；
2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物B进行检测
依据步骤二中对酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因进行琼脂糖凝胶电泳检测的方法对酶切后的酵母表达载体PPICZ-α-A进行琼脂糖凝胶电泳检测，最后在凝胶成像系统中确认混合物B中含有酶切后的酵母表达载体pPICZ- α -A ；
3)用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α -A进行回收、纯化
依据步骤二中对酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因进行回收与纯化的方法对酶
切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收与纯化，将回收、纯化后的酶切酵母表达载体 pPICZ-α -A，存储于_20°C条件下，备用；
步骤四、抗菌肽Metnikowin- II H基因和酵母表达载体pPICZ-α-A的连接
连接体系的配制在0. 5ml离心管c中加入2. Ομ 酶切酵母表达载体pPICZ-α-A、 6. Ομ 酶切抗菌肽 Metnikowin- II H 基因、1. Ομ 的 Τ4 DNA 连接酶和 1. O μ 110 倍 Τ4 DNA 连接酶缓冲液，混合均勻，后将0. 5ml离心管c放在4°C条件下，放置12小时，形成混合物 C，备用；
步骤五、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化均在无菌条件下操作大肠杆菌JM109感受态细胞的制备
1)在IOml离心管a中加入5mlLB液体培养基和一个大肠杆菌JM109单菌落，混合均勻，形成混合菌液I，转速为200转/分钟，37°C条件下，培养12小时，备用；
2)在150ml三角瓶中加入Iml混合菌液I和IOOmlLB液体培养基，混合均勻，形成混合菌液II，转速为200转/分钟，37°C条件下，培养3小时，检测混合菌液II的0D600值，待混合菌液II的0D600=0. 4时，后将含有混合菌液II的150ml三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置10分钟，备用；
3)在1.5ml离心管c中加入步骤2)中放置后的混合菌液II 1ml，将1. 5ml离心管c送入4°C离心机内，转速为4000转/分钟，离心5分钟，弃去1. 5ml离心管c内沉淀上层的液体，后在1. 5ml离心管c内加入500μ1的4°C CaCl2溶液，浓度为0. lmol/L，混合均勻，后将1. 5ml离心管c置于0°C冰水混合物中，放置30分钟，然后1. 5ml离心管c送入4°C离心机内，转速为4000转/分钟，离心1分钟，弃去1. 5ml离心管c内沉淀上层的液体，再加入 200μ1的4°C CaCl2溶液，浓度为0. lmol/L，混合均勻，置于4°C条件下，放置12小时，形成大肠杆菌JM109感受态细胞，备用；
大肠杆菌JM109感受态细胞的转化
1)在1.5ml离心管d中加入200 μ 1大肠杆菌JM109感受态细胞和10 μ 1步骤四中的混合物C，混合均勻，将1. 5ml离心管d置于0°C冰水混合物中，放置30分钟，后取出将1. 5ml 离心管d置于42°C的水浴锅内，放置90秒，取出，再将1. 5ml离心管d置于0°C冰水混合物中，放置5分钟后，取出，备用；
2)在步骤1)的1.5ml离心管d内加入800 μ ILB液体培养基，混合均勻，送入37°C摇床内，转速为150转/分钟，离心45分钟，后送入离心机内，转速为300转/分钟，离心30 秒，弃去1. 5ml离心管d内沉淀上层的液体，得到沉淀物I，备用；
3)取200μ 1步骤2)中的沉淀物I，并涂布于含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB固体培养基上，放置20分钟，后置于37°C条件下，培养16小时，形成培养菌落，备用；步骤六、重组质粒的筛选和酶切鉴定1)在50ml离心管a中加入45ml含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB液体培养基和步骤五中的一个培养菌落，混合均勻，在37°C条件下，培养12小时，后将50ml离心管a送入离心机内，转速为300转/分钟，离心3秒，弃去50ml离心管a内沉淀上层的液体，得到沉淀物II，备用；2)在0.5ml离心管d中加入5. Oug沉淀物II、0. 5 μ 1限制性酶切酶々§·_/ II、2. 0 μ 1的 10倍限制性酶切酶ife·/ II缓冲液和12. 5 μ 1去离子水，混合均勻，形成混合物D，后将0. 5ml 离心管d送入37°C水浴锅内，放置3小时，备用；3)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物D进行检测称取0. 5克琼脂糖粉末加到含有50毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙锭溶液，混合均勻，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳， 在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5 μ 1的混合物D和2 μ IDNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关， 在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中确认混合物D中含有酶切后的重组质粒pPICZ-α -Metnikowin- II H ；将酶切后的重组质粒pPICZ-α-Metnikowin- II H送至上海英俊生物技术有限公司序列测定，测序完成后利用生物软件DNAstar进行碱基序列比对、同源性分析；步骤七、重组质粒pPICZ-α -Metnikowin- II H的线性化1)在0.5ml离心管e中加入20ug重组质粒pPICZ- α -Metnikowin- II Η、5 μ 1限制性酶切酶Me I、20 μ 1的10倍限制性酶切酶Me I缓冲液和175 μ 1去离子水，混合均勻，形成混合物Ε，后将0. 5ml离心管e置于37°C水浴锅内，放置4小时，备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物E进行检测称取0. 5克琼脂糖粉末加到含有50毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙锭溶液，混合均勻，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳， 在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5 μ 1的混合物E和2 μ IDNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关， 在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中确认混合物E中含有线性化后的重组质粒pPICZ- α -Metnikowin- II H，其线性化后的目的片段为3600bp，备用；3)在1.5ml离心管e中加入190 μ 1线性化的重组质粒pPICZ- α - Metnikowin- II H、 200 μ 1去离子水和390 μ 1苯酚，混合均勻，形成混合物F，后将1. 5ml离心管e送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上层澄清液体I，在1. 5ml离心管f中加入200 μ 1上层澄清液体I和200 μ 1酚与氯仿混合液，混合均勻，后将1. 5ml离心管f送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上层澄清液体II，在1. 5ml离心管g 中加入200 μ 1上层澄清液体II、20 μ 1浓度为3mol的NaAC，pH为5. 2和500 μ 1的0°C无水乙醇，混合均勻，在-20°C条件下放置1小时，然后将1. 5ml离心管g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1.5ml离心管i内沉淀上层的液体，在含有沉淀的 1. 5ml离心管g内加入500 μ 1浓度为70%的乙醇，混合均勻，然后将1. 5ml离心管g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1. 5ml离心管g内沉淀上层的液体， 后1. 5ml离心管g内加入500 μ 1浓度为70%的乙醇，混合均勻，后将1. 5ml离心管g送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心10分钟，弃去1. 5ml离心管g内沉淀上层的液体， 得到沉淀物III，在含有沉淀物III的1. 5ml离心管g中加入去离子水，形成浓度为Ιμβ/μ1的 pPICZ-α -Metnikowin- II H 溶液，备用；
步骤八、酵母菌Χ-33感受态细胞的制备
1)巴斯德毕赤酵母Χ-33菌的活化
在YPDS固体培养基中接种3ug巴斯德毕赤酵母X-33菌，将YPDS固体培养基置于30°C 条件下培养72小时，观察到白色单个菌落，备用；
2)在无菌条件下制备巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞
①在IOml离心管b中加入5ml的YPDS液体培养基和一个巴斯德毕赤酵母X_33菌的单菌落，混合均勻，形成混合菌液III，30°C条件下培养12小时，备用；
②在250ml三角瓶中加入0.5ml混合菌液III和50mlYPDS液体培养基，混合均勻，形成混合菌液IV，30°C条件下培养3小时，检测混合菌液IV的0D600值，待0D600=1. 5时，形成混合液B，在50ml离心管b中加入45ml混合液B，将50ml离心管b送入4°C离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去50ml离心管b内沉淀上层的液体，后在50ml离心管b 中加入45ml去离子水，混合均勻，将50ml离心管b送入4°C离心机内，转速为1500转/分钟，离心5分钟，得到沉淀物V，备用；
③重复步骤②的方法一次，后在含有沉淀的50ml离心管b中加入IOml浓度为Imol的 O0C D-山梨醇，混合均勻，将50ml离心管b送入4°C离心机内，转速为1500转/分钟，离心 5分钟，得到沉淀物VI，备用；
④在含有沉淀物VI的50ml离心管b内加入浓度为Imol的D-山梨醇，得到0D600=1. 0 的巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞，备用；
步骤九、阳性重组子的制备及筛选
1)在4ml离心管中加入步骤七中10 μ 1浓度为 μδ/μ1的pPICZ-α -Metnikowin- II H 溶液和80 μ 10D600=1. 0的巴斯德毕赤酵母X-33菌感受态细胞，混合均勻，形成混合液C，备用；
2 )在0° C条件下，将电击杯放于浓度为70%的乙醇中，浸泡30分钟后，取出，在电击杯内加入120 μ 1混合液C，将电击杯放置5分钟，后将电击杯放到电转化仪内，进行电击，电脉冲为25微法，电压为1. 5千伏，电阻为200欧姆，电击时间为0. 05秒，电击结束后，取出含有混合液C的电击杯，后在电击杯内加入ImlD-山梨醇，混合均勻，得到混合物G，将混合物G加到1. 5ml离心管h中，将1. 5ml离心管h送入30°C摇床中，转速为225转/分钟，培养2小时后，取100 μ 1培养后的混合物G，并将其涂布于含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的 YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30°C培养箱内，培养4天，得到白色单菌落，备用；
4)将步骤3)中的得到全部白色单菌落接种到MM固体培养基上，然后将接种后的MM固体培养基置于30° C的培养箱内，培养3天，观察并得到巴斯德毕赤酵母Mut+菌落，备用；5)取步骤4)中的一个巴斯德毕赤酵母Mut+菌落，并将其接种到含有浓度为IOOOPg/ ml博来霉素的YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30°C的培养箱内，培养3天，观察到单个菌落，即得到的阳性重组子，备用； 步骤十、对阳性重组子进行检测1)在1.5ml离心管i中加入一个阳性重组子和100 μ 1的pH为8. 0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，形成混合液D，在1. 5ml离心管j中加入100 μ 1混合液D，混合均勻，将1. 5ml离心管j送入离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去 1. 5ml离心管j内沉淀上层的液体，在1. 5ml离心管j内加入500μ 1的PBS溶液，混合均勻， 将1. 5ml离心管j送入离心机内，转速为2500转/分钟，离心5分钟，弃去1. 5ml离心管j 内沉淀上层的液体，在1. 5ml离心管j内加入100 μ 1 pH为8. 0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，后将1. 5ml离心管j置于100°C沸水中，加热10分钟，后将加热后的1. 5ml离心管j置于_80°C条件下，放置30分钟，取出，再将1. 5ml离心管j置于100°C 沸水中，加热10分钟，取出，将1. 5ml离心管j送入离心机内，转速为12000转/分钟，离心 5分钟，得到上层液体，即得到酵母基因组DNA，备用；2)利用通用鉴定引物5，AOX和3，AOX对步骤7)中的酵母基因组DNA进行PCR鉴定 PCR反应液的配制在0. 5ml离心管f中加入2. 5 μ 1酵母基因组DNA,2. 5 μ LlO倍PCR缓冲液、1 μ 1浓度为2. 5mmol的三磷酸脱氧核糖核苷混合液、1. 5 μ 1浓度为25mmol Mg2+的 PCR缓冲液、0. 25 μ 1的引物5，Α0Χ,0. 25 μ 1的引物3，Α0Χ,0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶禾口 16. 75 μ 1去离子水，混合均勻，PCR反应液，备用；PCR程序将PCR反应液放入PCR仪内，PCR扩增共30个循环，先94°C预变性5分钟， 后94°C变性30秒、56°C退火30秒和72°C延伸45秒为一个循环，完成30个循环后，72°C再次延伸10分钟，形成PCR产物；称取0. 5克琼脂糖粉末加到含有50毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙锭溶液，混合均勻，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳， 在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入5 μ 1的PCR产物和2 μ IDNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关， 在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳30分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中确认 PCR产物中含有酵母基因组DNA目的片段，表明抗菌肽Metnikowin- II H基因己整合酵母菌基因组内，即得到含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，备用； 步骤十一、阳性重组子的诱导表达1)取含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，将其接种到5ml含有浓度为IOOPg/ ml博来霉素的YPDS液体培养基上，混合均勻，形成培养菌液a，将培养菌液a置于30° C条件下培养12小时，在50ml离心管c中加入IOml BMGY液体培养基和0. 2ml培养后的培养菌液a，混合均勻，形成培养菌液b，将培养菌液b置于30° C条件下，培养至培养菌液b的 0D600=5时，将50ml离心管c送入离心机内，转速为1000转/分钟，离心3分钟，得到沉淀物VL在50ml离心管d中加入30mlBMMY液体培养基和IOml沉淀物VL混合均勻，形成培养菌液c，将培养菌液c置于C条件下培养96小时，在培养过程中每隔M小时添加2ml浓度为0. 5%的甲醇，培养结束后，将50ml离心管d送入离心机内，转速为8000转/分钟，离20心10分钟，得到上层澄清液体，即为表达产物抗菌肽Metnikowin- II H;
步骤十二、对表达产物抗菌肽Metnikowin- II H进行聚丙烯酰胺电泳检测和抑菌活性
测定
1)聚丙烯酰胺电泳检测
试剂配制在IOOml去离子水中加入48g的丙烯酰胺和1. 5g的甲叉双丙烯酰胺，混合均勻，形成30%丙烯酰胺储存液，备用；
在IOOml去离子水中加入47g的丙烯酰胺和2. 5g的甲叉双丙烯酰胺，混合均勻，形成 50%丙烯酰胺储存液，备用；
在400ml去离子水中加入121. 14g的三羟甲基氨基甲烷，混合均勻，用盐酸将其pH值调至8. 9，定容至500ml，形成10倍正极缓冲液，备用；
在500ml去离子水中加入60. 55g的三羟甲基氨基甲烷，89. 58gN_三(羟甲基)甲基甘氨酸和5g的十二烷基磺酸钠，混合均勻，形成10倍负极缓冲液，备用；
在400ml去离子水中加入18. 15g的三羟甲基氨基甲烷和1. 5g的十二烷基磺酸钠，混合均勻，用盐酸将其PH值调至8. 45，定容至500ml，形成3倍凝胶缓冲液，备用；
取0. 5ml的3倍凝胶缓冲液、0. 16ml的30%的丙烯酰胺储存液、0. 01的10%过硫酸铵、 0. OOlml N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺和1. 34ml去离子水，混合均勻，制的浓缩胶，备用；
取Iml的3倍凝胶缓冲液、0. 61ml的30%的丙烯酰胺储存液、0. 01的10%过硫酸铵、 0. OOlml N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺和1. 39ml去离子水，混合均勻，制的夹层胶，备用；
取2ml的3倍凝胶缓冲液、2ml的60%的丙烯酰胺储存液、2. 19g的尿素、0. 01%的10% 过硫酸铵、0. OOlml N, N，N，，N，-四甲基乙二胺和0. 49ml去离子水，混合均勻，制的分离胶，
取IOOmg的考马斯亮兰、50ml的浓度为95%的乙醇和IOOml的浓度为85%的磷酸，混合均勻，用去离子水稀释至IOOOml中，过滤，得到考马斯亮兰染液，备用；
取4 %的十二烷基磺酸钠、12 %的甘油、50mmol/L Tris,2 %的巯基乙醇和0. 05%的溴酚蓝，混合均勻，用盐酸将其PH值调至6. 8，形成样品缓冲液，备用；
取6ul的样品缓冲液和:3ul的表达产物抗菌肽Metnikowin- II H，混合均勻，制的上样液，备用；
聚丙烯酰胺凝胶的配制在安装好的聚丙烯酰胺凝胶制胶板内依次加入分离胶、夹层胶和浓缩胶，插入制胶梳，放置8小时，后凝固的固体称为聚丙烯酰胺凝胶，拔去制胶梳， 在凝胶上出现一排点样孔，后将聚丙烯酰胺凝胶放入含有10倍负极缓冲液的电泳凝胶内盒中，电泳凝胶内盒位于含有10倍正极缓冲液的电泳凝胶外盒内，在凝胶的点样孔中分别加入5 μ 1的上样液和2 μ IDNA分子量标准Marker，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为 100伏特时开始电泳，电泳3小时后关闭电泳仪，后通过考马斯亮兰染液染色30分钟、去离子水水洗脱色，在凝胶成像系统中确认上样液中含有表达产物抗菌肽Metnikowin- II H 的目的片段，表达产物抗菌肽Metnikowin- II H的聚丙烯酰胺凝胶检测电泳图中，Marker 分别为99. 4kD、62. OkD,43. OkD,31. 2kD、20. IkD和14. 4kD，检测样品为表达后的抗菌肽 Metnikowin- II H，其检测分子量为 2. 67kD ；
步骤十三、对表达产物抗菌肽Metnikowin- II H进行His · Bind螯合层析柱纯化 1)在His · Bind螯合层析柱内加入2. 5ml的树脂，通过重力作用使树脂沉降至柱膜表面后，在His -Bind螯合层析柱内依次分别加入7. 5ml的去离子水、12. 5ml的1倍离子化缓冲液和7. 5ml的1倍结合缓冲液，去离子水、1倍离子化缓冲液和1倍结合缓冲液分别经过 His -Bind螯合层析柱柱膜的过滤，当1倍结合缓冲液完全通过His-Bind螯合层析柱的柱膜后，在His .Bind螯合层析柱内加入表达产物抗菌肽Metnikowin- II H，流速为25毫升/ 小时，待表达产物抗菌肽Metnikowin- II H过柱完毕后，用15ml的1倍漂洗缓冲液洗涤一次，再用15ml的1倍洗脱缓冲液洗涤一次，收集洗涤后的1倍洗脱缓冲液，4°C保存，备用； 步骤十四、对纯化后的表达产物抗菌肽Metnikowin- II H进行检测1)对纯化后的表达产物抗菌肽Metnikowin-II H进行热稳定性测定在1. 5ml离心管k、l. 5ml离心管1、1. 5ml离心管m、l. 5ml离心管n、l. 5ml离心管ο 和1.5ml离心管ρ中加入100 μ 1纯化后的表达产物抗菌肽Metnikowin- II H，然后将6个 1. 5ml离心管分别置于100°C的水中，加热，1. 5ml离心管k加热5分钟取出，形成试验样品 a、l. 5ml离心管1加热10分钟取出，形成试验样品b、l. 5ml离心管m加热15分钟取出，形成试验样品c、1.5ml离心管η加热20分钟取出，形成试验样品d、1.5ml离心管ο加热30 分钟取出，形成试验样品e、l. 5ml离心管ρ加热60分钟取出，形成试验样品f，备用；将45°C的琼脂培养基溶液内加入金黄色葡萄球菌，混合均勻，使琼脂培养基溶液内金黄色葡萄球菌的浓度为106CFU/ml，将含有金黄色葡萄球菌的琼脂培养基溶液注入培养皿内，琼脂培养基的厚度为6cm，放置30分钟，制的含有金黄色葡萄球菌的琼脂培养基， 在琼脂培养基上打7个直径为4mm，厚度为5mm的试验孔，分别在7个试验孔内加入试验样品a、试验样品b、试验样品C、试验样品d、试验样品e、试验样品f和表达产物抗菌肽 Metnikowin- II H，将培养基置于37°C培养内，培养12小时，测量7个试验孔四周的抑菌圈， 并绘制抑菌圈变化曲线图；结果显示试验样品e在100°C条件下加热30min时，其抑菌圈为23mm，验样品f在 100°C条件下加热60min时，其抑菌圈为17mm，表明抗菌肽Metnikowin- II H经过100°C加热时有抑菌活性，具有热稳定性；2)对纯化后不同pH值的表达产物抗菌肽Metnikowin-II H进行不同pH值缓冲液稳定性测定分别在11个1. 5ml离心管内加入100 μ 1纯化后的表达产物抗菌肽Metnikowin- II H， 然后在1. 5ml离心管q内加入100 μ 1的pH值为1的PBS溶液，混合均勻，形成试验样品g、 依照试验样品g的制备方法，在剩余的1. 5ml离心管内依次分别加入100 μ 1的pH值为2— 11的PBS溶液，混合均勻，形成试验样品h、试验样品i、试验样品j、试验样品k、试验样品 1、试验样品m、试验样品η、试验样品O、试验样品P、试验样品q，备用；将45。C的琼脂培养基溶液内加入金黄色葡萄球菌，混合均勻，使琼脂培养基溶液内金黄色葡萄球菌的浓度为106CFU/ml，将含有金黄色葡萄球菌的琼脂培养基溶液注入培养皿内，琼脂培养基的厚度为6cm，放置30分钟，制的含有金黄色葡萄球菌的琼脂培养基，在琼脂培养基上打13个直径为4mm，厚度为5mm的试验孔，分别在13个试验孔内加入试验样品 g、试验样品h、试验样品i、试验样品j、试验样品k、试验样品1、试验样品m、试验样品η、试验样品O、试验样品ρ和试验样品q，将培养基置于37°C培养内，培养12小时，测量13个试验孔四周的抑菌圈，并绘制抑菌圈变化曲线图；结果显示试验样品g的抑菌圈为20mm，试验样品k、试验样品1和试验样品m的抑菌22圈均为24mm，试验样品q的抑菌圈为18mm，表明抗菌肽Metnikowin- II H在酸性溶液或是中性溶液中，其抑菌活性高，而碱性溶液其抑菌效果低；
3)对纯化后的表达产物抗菌肽Metnikowin- II H进行抑菌活性测定在纯化后的表达产物抗菌肽Metnikowin- II H中加入苹果果汁，形成含有浓度为 0. 44 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的试验样品s，含有浓度为0. 87 μ g/ml抗菌肽 Metnikowin- II H的试验样品t和含有浓度为1. 74 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的试验样品u和浓度为0. 05%的山梨酸钾，通过平板菌落计数法对试验样品S、试验样品t和试验样品u进行抑菌活性测定，计算抑菌率
结果显示含有浓度为1. 74 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的试验样品u在M小时时的抑菌率在70%，而含有浓度为0. 87 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的试验样品t在M 小时时的抑菌率在60%，而含有浓度为0. 44 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的试验样品t 在M小时时的抑菌率在50%，浓度为0. 05%的山梨酸钾在M小时时的抑菌率在30%，表明浓度为1. 74 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H可以抑制苹果果汁中腐败菌的生长；
在本发明中所述的巴斯德毕赤酵母X-33菌和大肠杆菌JM109为普通未变异的巴斯德毕赤酵母X-33菌和大肠杆菌JM109，通过实验室提取或市场购买均能得到；而本发明中的巴斯德毕赤酵母X-33菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心和大肠杆菌JM109购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；
所述的载体为酵母表达载体PPICZ-α-A，在市场上即可购买得到，在本发明中酵母表达载体pPICZ-α-A购于上海英俊生物技术有限公司，其产品为(GLD195)
所述的含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB培养固体培养基的组成成份按重量百分比含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB培养固体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博来霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉，余量为水；
所述的含有浓度为50μβ/πι1博来霉素的LB液体培养基的组成成份按重量百分比含有浓度为5(^g/ml博来霉素的LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博来霉素、0. 5% 的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；
所述的LB培养固体培养基的组成成份按重量百分比含有浓度为LB培养固体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉，余量为水；
所述的LB液体培养基的组成成份按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；
所述PBS溶液组成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化钠、0. 024%的磷酸二氢钾、0. 02%的氯化钾、0. 144%的磷酸氢二钠，余量为水；
所述三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的组成成份每升三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的DNA纯化结合液的组成成份每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的洗涤液的组成成份按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为
水；
所述的洗脱液的组成成份按重量百分比洗脱液中含有40%的浓度lOmol/L的乙酸钠、8. 5%的冰醋酸，余量为水；
所述的YPDS固体培养基的组成成份按重量百分比YPDS固体培养基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；
所述的YPDS液体培养基的组成成份按重量百分比YPDS液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、2%的葡萄糖，余量为水；
所述的含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的YPDS固体培养基的组成成份按重量百分比含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的YPDS固体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博来霉素、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；
所述的含有浓度为50(^g/ml博来霉素的YPDS固体培养基的组成成份按重量百分比含有浓度为50(^g/ml博来霉素的YPDS固体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、5%的博来霉素、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；
所述的含有浓度为lOOOPg/ml博来霉素的YPDS固体培养基的组成成份按重量百分比含有浓度为lOOOPg/ml博来霉素的YPDS固体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、10%的博来霉素、2%的葡萄糖、2%的琼脂粉，余量为水；
所述的含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的YPDS液体培养基的组成成份按重量百分比含有浓度为lOOPg/ml博来霉素的YPDS液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博来霉素、2%的葡萄糖，余量为水；
所述的MM固体培养基的组成成份按重量百分比MM固体培养基中含有1. 34%的无氨基酸酵母氮源、4xl0_5%的生物素、0. 5%的甲醇、1. 5%的琼脂粉，余量为水；
所述的BMMY液体培养基的组成成份按重量百分比BMMY液体培养基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的无氨基酸酵母氮源、0. 4%的生物素、0. 5%的甲醇、1. 0%的磷酸盐缓冲液，余量为水；
所述的BMGY液体培养基的组成成份按重量百分比BMGY液体培养基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、1. 34%的无氨基酸酵母氮源、0. 4%的生物素、1%的甘油、1. 0%的磷酸盐缓冲液，余量为水；
所述的琼脂培养基的组成成份按重量百分比琼脂培养基中含有1%的蛋白胨0. 3%的牛肉膏、0. 5%的氯化钠、1. 5—2. 0%的琼脂，余量为水；
所述的溶液II的组成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%浓度为lOmmol/L的氢氧化钠、10%的十二烷基磺酸钠，余量为水；
所述的溶液III的组成成份按重量百分比溶液III中含有60%的浓度5 mol/L的乙酸钾、 11. 5%的冰醋酸，余量为水；
所述酚与氯仿混合液的组成成分按体积比酚与氯仿混合液中含有25份的酚和M份的氯仿；
1倍连接缓冲液的组成成分按摩尔比每升1倍连接缓冲液中含有20mmol的三羟甲基氨基甲烷，500mmol的NaCl，5mmol的咪唑，IOmmol的甘油，余量为水；
1倍电极缓冲液的组成成分按摩尔比每升1倍电极缓冲液中含有50mmol的MCl2，余量为水。
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1. 一种新型食品防腐剂抗菌肽的制备方法，其特征在于步骤一、抗菌肽Metnikowin- II H基因的设计与合成1)根据全球公共序列数据库Genebank中记载序列号为P80409的抗菌肽 Metnikowin- II的核苷酸序列为模板，在抗菌肽Metni kowin- II的核苷酸序列后端加入6个组氨酸，即加入6个cat的核苷酸序列，形成抗菌肽Metnikowin- II H，以抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列为模板，依据毕赤酵母的偏嗜性，分别在抗菌肽 Metnikowin- II H基因的前端加入限制性内切酶xho 的酶切位点，后端加入限制性内切酶 Xba I的酶切位点，并在限制性内切酶)(ba I的酶切位点前端加入终止密码子UAA，将设计好的核苷酸序列进行合成；其中抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列为GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat将抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸翻译为氨基酸，抗菌肽Metnikowin- II H的氨基酸序列为VDKPDLRPRPffPRPNHHHHHH步骤二、抗菌肽Metnikowin- II H基因的酶切、回收1)酶切体系的配制在0.5ml离心管a中加入8. Ομ 抗菌肽Metnikowin- II H基因、 0. 5μ1限制性内切酶)(ho I、0·5μ1限制性内切酶)(ba 1,2. Ομ 限制性内切酶缓冲液和 9. Ομ 去离子水，混合均勻，形成混合物Α，将混合物A放入37°C水浴锅中，反应3小时，取出，备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物A，在凝胶成像系统中确认混合物A中含有酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因的目的基因；3)用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的抗菌肽Metnikowin-II H基因进行回收、纯化取1. 5ml离心管a并称其重量，在紫外灯下将混合物A从步骤2)中的凝胶上切下，将切下的混合物A放在已称重的1. 5ml离心管a中，称取1. 5ml离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，将1. 5ml离心管a中的混合物A捣碎，按每g混合物A 加入ImlDNA纯化结合液的比例加入DNA纯化结合液，混合均勻，将1. 5ml离心管a放置在 50° C水浴中加热至混合物A完全融解，得到混合液A，将混合液A加入到DNA纯化柱a上， DNA纯化柱a位于收集管a内，将收集管a置于21°C条件下放置1分钟，后将收集管a放到离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入700 μ 1洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，将收集管a在21°C条件下放置1分钟，后将收集管a送入离心机中，转速为12000转/分钟， 离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a内的液体，向DNA纯化柱a上加入500 μ 1洗涤液，将DNA纯化柱a置于收集管a内，后将收集管a放入离心机中，转速为 12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀的DNA纯化柱a，倒掉收集管a中的液体后， 将DNA纯化柱a置于收集管a内，再将收集管a放入离心机内，转速13000转/分钟，离心 1分钟，取出DNA纯化柱a将其放置于1. 5ml离心管b中，后在DNA纯化柱a上加入30 μ 1 洗脱液，使1. 5ml离心管b在21°C条件下放置1分钟，后放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到1. 5ml离心管中b中的液体，该液体就是酶切、回收并纯化后的抗菌肽Metnikowin- II H基因，存储于_20°C条件下，备用；步骤三、酵母表达载体PPICZ- α -A酶切、回收1)酶切体系的配制在0.5ml离心管b中加入8. Ομ 酵母表达载体pPICZ- α -Α、0. 5μ1 限制性内切酶》ιο I、0. 5μ1限制性内切酶)(ba Ι、2. Ομ 限制性内切酶缓冲液和9. Ομ 去离子水，混合均勻，形成混合物B，将混合物B放入37° C水浴锅中，反应3小时，取出，备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物B进行检测利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中确认混合物B中含有酶切后的酵母表达载体PPICZ- α -A ；3)用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α -A进行回收、纯化依据步骤二中对混合物B即酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因进行回收与纯化的方法对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收与纯化，将回收、纯化后的酶切酵母表达载体pPICZ-α-Α，存储于_20°C条件下，备用；步骤四、抗菌肽Metnikowin- II H基因和酵母表达载体pPICZ-α -A的连接连接体系的配制在0. 5ml离心管c中加入2. Ομ 酶切酵母表达载体pPICZ-α -Α、 6. Ομ 酶切抗菌肽 Metnikowin- II H 基因、1. Ομ 的 Τ4 DNA 连接酶和 1. O μ 110 倍 Τ4 DNA 连接酶缓冲液，混合均勻，后将0. 5ml离心管c放在4°C条件下，放置12小时，形成混合物 C，备用；步骤五、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化均在无菌条件下操作，大肠杆菌JM109感受态细胞的制备1)在IOml离心管a中加入5mlLB液体培养基和一个大肠杆菌JM109单菌落，混合均勻，转速为200转/分钟，37°C条件下，培养12小时，形成混合菌液I，备用；2)在150ml三角瓶中加入Iml混合菌液I和IOOmlLB液体培养基，混合均勻，形成混合菌液II，转速为200转/分钟，370C条件下进行培养，待混合菌液II的0D600=0. 4时停止培养，后将含有混合菌液II的150ml三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置10分钟，备用；3)在1.5ml离心管c中加入步骤2)中放置后的混合菌液II 1ml，将1. 5ml离心管c送入4°C离心机内，转速为4000转/分钟，离心5分钟，弃去1. 5ml离心管c内沉淀上层的液体，后在1.5ml离心管c内加入500μ1的4°C CaCl2溶液，浓度为0. lmol/L，混合均勻，后将1. 5ml离心管c置于0°C冰水混合物中，放置30分钟，然后1. 5ml离心管c送入4°C离心机内，转速为4000转/分钟，离心1分钟，弃去1. 5ml离心管c内沉淀上层的液体，再加入 200μ1的4°C CaCl2溶液，浓度为0. lmol/L，