专利名称：蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及其抗菌药品制备方法蟾蜍是一种两栖类动物，皮肤长期裸露，为抵御外部微生物及各种病原菌的侵袭， 它们的身体逐渐形成防御机制，其皮肤分泌产生了大量能有效杀灭微生物、抵御有害环境 因子侵袭的物质，分泌物的主要成份是多肽，Zasloff从非洲爪蟾皮肤上发现了爪蟾抗菌肽 Magainin, Gibson等人从蟾皮肤分离得到Bombinir like家族抗菌肽，从澳州当地的蛙类 皮肤分泌物中陆续提取到Citropin家族，Caerin家族，Maculatin家族及Uperin家族的各 种抗菌肽，赖仞等人从大蹼铃蟾的皮肤分泌物中提取了一种抗菌肽MSP VII，徐兴军等人从 中华蟾蜍皮肤提取了抗菌肽，CN200410013742. 4公开了采用中药培育蟾蜍蛆虫的方法，可 以大批量工业化生产蟾蜍蛆虫。原则上，前述提取的各种抗菌肽都有一定的抗菌活性，但是在药品生产中需要活 性较高、来源丰富、性能稳定、成份明确、质量可控的原料。
本发明的目的是提供蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及其抗菌药品制备方法，提取纯度 蟾肽抗生素含量达到98. 2% -98. 9%，用此纯度蟾肽抗生素制备各种剂型的药品，产品成 份明确、质量可控、性能稳定，对多种疾病疗效好并且原料来源广泛。本发明的目的是通过如下方案实现的以蟾蜍蛆虫为原料，采用水溶剂萃取法或 稀碱溶液萃取法或稀醇溶液萃取法，结合离子交换树脂吸附法，超滤及微滤、凝胶色谱，超 声驻波液相制备色谱等工艺中的一种或者多种工艺，再冷冻干燥制备成蟾肽抗生素，将蟾 肽抗生素作为药用活性成分与适宜的赋形剂相结合、制成片剂、胶囊剂、栓剂、软膏剂、酊 剂、糊剂、糊膜剂及肠溶剂等剂型用于治疗多种疾病。分离纯化的蟾肽抗生素用高效液相色 谱(RP-HPLC)测定组分含量。集上清液。③将收集的上清液泵入HD-8强酸离子交换树脂柱中，静止30min-300min，饱和 树脂先用0. 5mol/LHCl-NH4Cl溶液洗涤，再用纯净水洗脱0. 5h_2h，用0. 01mol/L-0. 5mol/4LNH4OH 洗脱。④洗脱液泵入错流微滤器中，微滤膜孔径为0. 1 μ m-o. 8 μ m操作压力 0. OlMpa-O. 5Mpa连续微滤处理成微滤处理液。⑤微滤处理液溶于由正丁醇-20mOl/L-100mOl/L三氟乙酸水溶液(1 1)组成的 溶剂体系中，注入到超声驻波液相制备色谱中，声强0. lKw-50kw、流速50ml/L-500ml/L、紫 外检测器220mm检测，连续分离出蟾肽抗生素，收率达2. 0% -2. 8%。⑥分离出的蟾肽抗生素用RP-HPLC测定，色谱柱YMC-pack polymerc. 8150mmX4. 6mmLD.流动基金动相A.乙腈QO % ) +水(80 % ) +三氟乙酸 (0. 05% )，B.乙腈(45% ) +水(55% ) +三氟乙酸(0.05%，梯度条件:0-30min, 0-100 % B，流速1. Oml/min-5. Oml/min，检测器:UV，220nm，柱温 30°C _50°C，进样量:10 μ 1-30 μ 1， 测定结果显示纯度为98. 2% -98. 9%。2、①将IOOOg蟾蜍蛆虫用10L-100L的纯净水并加 入0. 02-0. IOmol/L磷酸-磷酸氢二钾缓冲液加热至35°C -90°C、保持30min-300min并且 进行搅拌，提取出蟾肽抗生素的粗品；②加入提取液体积5倍-10倍的乙醇或甲醇，常温下 静止沉淀lh-24h，然后用分离机在SOOr/min-ieOOOr/min条件下将多糖类及蛋白质分离； ③分离液泵入HD-8酸性阳离子交换树脂柱内，常温下放置lh-24h，然后用Imol/L-lOmol/ L氨水溶液洗脱收集蟾肽抗生素部分；④将收集的蟾肽抗生素部分溶解于由氯仿-乙 醇-水(5 3 4)组成的溶剂体系中用超声驻波液相制备色谱以声强0.2kw-5.0kw，流 速0. lml/min-lOOOml/min、紫外检测器波长220nm检测条件下分离纯化蟾肽抗生素；⑤将 纯化的蟾肽抗生素用真空冷冻干燥机在-10°C -50°C、真空度0. OlMpa-O. IMpa条件下干燥 ^!!-川！！，含量达日日.〗1^ ；⑥纯化的蟾肽抗生素粉碎过100目-200目筛收集粉末。3、①将IOOOg蟾蜍蛆虫用5L-10L的纯净水并加入10% -20%乙醇，在超声波 提取罐中以Ikw-IOkw声强超声波常温条件下提取10min-120min，提取出蟾肽抗生素粗 品溶液；②提取液中加入5倍-10倍的乙醇，常温下，静止沉淀lh-Mh，用分离机SOOr/ min-16000r/min连续分离上述溶液成分离液；③用真空蒸发器在真空度0. OlMpa-O. 5Mpa、 温度10°C -50°C条件下浓缩分离液至原体积的10% -1. 0%成浓缩液；④将浓缩液泵入 HZ001酸性阳离子交换树脂柱中，用0. lmol/L-1. 0mol/L NaOH溶液洗脱，收集蟾肽抗生素 部分；⑤收集的蟾肽抗生素部分溶解到由氯仿-乙醇-水(5 4 3)组成的溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱以声强0. lkw-5. Okw、流速0. lml/min-lOOOml/min、紫外检测器 波长220nm检测条件下连续分离纯化；⑥分离纯化的蟾肽抗生素在温度-10°C --50°C、真空 度0. OlMpa-O. IMpa、真空冷冻干燥Ih-IOh成粉末状蟾肽抗生素，纯化后的蟾肽抗生素含量 达 98. 9%。4、①取IOOOg蟾蜍蛆虫与10L-100L0. 01 % -10 %的乙醇稀溶液混合，加热 500C -180°C，时间 10min-60min，然后冷却至 10°C _20°C、加入 0. lmol/L-5. 0ml/L (NH4)2SO4 溶液，放置30min-300min、用离心机以800r/min-16000r/min连续离心分离出分离液 ’② 分离液注入到错流微滤器中，以孔径0. 1μπι-0. 8μπκ压力0. OlMpa-O. 5Mpa、流速100ml/ min-10L/min连续微滤处理成微滤处理液；③微滤处理液注入到平板错流超滤器中，以孔 径2nm-10nm、压力0. 5Mpa_l. OMpa、流速5. 0L/min_50L/min连续超滤处理成超滤处理液；④ 超滤处理液真空冷冻干燥处理，冷冻干燥温度-10°C —50°C、真空度0. OlMpa-O. 5Mpa、时间 0. 5h-5h冷冻干燥成粉状；⑤上述粉状物用溶于PH4. 0-0. lmol/L-0. 05mol/L, HAC-NaAC缓冲液中、配制0. lg-100g/L溶液，注入到有kphaeryIs-IOOHR的色谱柱中，在PH3-PH14、压 力 0. IMpa-O. 5Mpa、流速 10cm/h-条件下、用 PH4. 0,0. 01mol/L HAC-NaAC 缓冲液、以 0. OlL/ min-0. 5L/min流速洗脱、220nm检测并收集组分；⑥组分真空冷冻干燥温度-10°C -50、V 真空度0. OlMpa-O. IMpa、时间0. ^i_3h，制备成蟾肽抗生素冻干粉，收率2. 0% -2. 8%。5、蟾肽抗生素的体外抑菌与杀菌实验采用《全国临床检验操作规程》的方法，用 Img蟾肽抗生素冻干粉溶解于纯净水中稀释成10yg/ml的溶液备用，取对数生长期的五 种菌类的常规培养液分别加到含有不同浓度蟾肽抗生素的肉汤培养基试管中，每毫升活菌 数为1X505CFU，在培养箱中保持温度37°C，培养Mh，观察各试管溶液的浊度。溶液澄清 无菌生长的蟾肽抗生素浓度为最低抑菌浓度(MIC)，分别吸取上述试管无菌生长的培养基 50 μ 1，接种于无菌琼脂培养基平板，37°C培养24h仍无菌类生长，其中的最低浓度则是蟾 肽抗生素的最低杀菌浓度(MBC)。蟾肽抗生素对不同菌类的MIC和MBC(y g/ml)
本发明蟾蜍蛆虫分离蟾肽抗生素及其抗菌药品制备方法，它以蟾蜍蛆虫为原料，采用溶剂萃取法离子交换树脂吸附法，超滤及微滤，凝胶色谱分离，超声驻波液相制备色谱等工艺，再冷冻干燥制备成蟾肽抗生素，并用此活性成分与适宜的赋形剂相结合，制成片剂、胶囊剂、栓剂、软膏剂及肠溶剂等剂型用于治疗多种疾病。本发明制备的药品抗菌范围广泛，药品成份明确、质量可控、性能稳定，具有工业生产价值。