专利名称：基于STAT3和NF-κB双信号通路为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型及其构建和应用的制作方法在许多肿瘤细胞中，特别像结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤细胞、肺癌等细胞中，都有持续活化的STAT3 (信号转导及转录激活因子3)和NF-kB (核因子-κ B)活性。NF-κ B 家族主要包括以下成员，具体为RelA (p65)、RelB、c-Rel、p50和p52，通常NF-kB以同源或者异源二聚体的形式存在，其中p65/p50 二聚体是哺乳动物中最常见的NF-kB形式。正常情况下，NF-kB 二聚体由于结合了其抑制蛋白lKBdnhibitor of NF-κ B)而主要滞留在细胞质中，外加刺激或病理情况下由于IkB被过量降解而导致NF-KB活化入核行使一系列功能。而STAT3作为STATs分子家族的一员，受到上游信号细胞因子刺激或在某些酪氨酸激酶持续活化的状态下，其C端705位酪氨酸被磷酸化而形成二聚体， 进而入核调节转录。STAT3和NF-kB入核之后都能结合特异的核酸序列调节转录(在启动子区域一般为增强下游基因的转录);NF-κ B的结合序列通常为列5’-GGGRNNYYCC-3’ (R 代表嘌呤，Y代表嘧啶，N代表任意四种碱基之一)，而STAT3的结合序列为5’ -TT (C/A) CNNNAA-3’(N为任意四种碱基之一 )。NF-kB和STAT3的活化所调控的下游基因往往都与抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和转移相关。大量证据表明，抑制上述两种转录因子的活性或其上下游信号都将极大的抑制肿瘤细胞的生存、增殖和迁移(Wang等人=Science 1996 ； mi 等人EMB0 J 1996 ；Wang 等人Nat Med 1999 ； Ni 等人Cancer Res 2000 ； Leong 等入Proc Natl Acad Sci 2003 ； Barton ^A Mol Cancer Ther 2004 ； Kortylewski φ 人Nat Med 2005 ； Xin 等人Cancer Res 2009)。目前越来越多研究者意识到以STAT3和NF-kB为信号通路进行抗肿瘤药物筛选的可行性，并开始尝试相关的方法，但基于STAT3和NF-kB信号通路为靶点的筛药系统由于所选用的细胞系本身的STAT3或NF-kB活性比较低，筛选特异性抑制剂时，往往需要事先外加细胞因子刺激细胞，再进行化合物筛选，细胞因子的使用不仅使成本大大提高， 且筛药体系每增加一步将大大增加系统的不稳定性；同时外加的刺激并不能完全模拟肿瘤细胞实际具有较高STAT3或NF-kB活性的状态。另外，最近的研究表明，在众多肿瘤细胞中，STAT3和NF-kB信号转导分子还存在相互结合、共同作用促进肿瘤相关基因表达和肿瘤发生、发展的现象(Yang J等人=Cancer Res 2005 ； Yang J等人=Genes & Dev 2007 ； Torres J等人Nat Cell Biol 2008 ；Lee H等人=Cancer Cell 2009 ；Yu H等人:Nat Rev Cancer 2009)
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种基于STAT3和NF-KB 双信号通路为靶点的高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型。本发明的另一目的是提供一种基于STAT3和NF-KB双信号通路为靶点的高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法。本发明还有一个目的，就是提供一种基于STAT3和NF-KB双信号通路为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型在筛选抗肿瘤药物中的应用。(一)基于STAT3和NF-κΒ双信号通路为靶点的高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型本发明基于STAT3和NF-kB双信号通路为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型，采用 STAT3特异性结合序列与NF-kB特异性结合序列组合，建立报告系统载体；结合具有组成型NF-kB和STAT3的活性细胞，构建成稳定易用的高通量抗肿瘤药物筛药模型。STAT3特异性结合序列与NF-KB特异性结合序列组合，建立的报告系统载体对上述两信号通路的激活都能有显著的响应，能同时表征STAT3和/或NF-KB活性变化； 利用具有组成型NF-KB和STAT3的活性细胞构建的药物筛选模型，使整个报告系统载体达到理想的活化状态，并且单独抑制一个信号通路时在荧光水平上都能有显著的变化， 最终使得该系统能够灵敏地用于高通量药物筛选。所述NF-κΒ特异性结合序列为5’ -GGGRNNYYCC-3’，其中R为嘌呤，Y为嘧啶，N 为碱基。优选序列为5，-GGGAATTTCC-3，(简称κ B)。所述STAT3的特异性结合序列为5’ -TT(C/A)CNNNAA-3’，N为碱基。优选序列为5，-TTCCCGTAA-3，或 / 禾口 5，-TTCCTGTAA-3，(统称 SIE)。
所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3特异性结合序列与NF-κΒ特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。
所述报告系统载体中，STAT3特异性结合序列与NF-κΒ特异性结合序列以任何方式组合。为了达到最优的筛选效果，所述STAT3特异性结合序列与NF-κΒ特异性结合序列的组合方式为结合序列包含η个STAT3特异性结合序列与m个NF-K B特异性结合序列，且n:m=l:广16:1，两种序列可以前后组合，也可以嵌套组合。
所述具有组成型NF-κΒ和STAT3的活性细胞为DU145前列腺癌细胞、H印G2人肝癌细胞、H1299人肺癌细胞、A549人肺癌细胞、HCT119人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、 MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞或MDA-MB-231人乳腺癌细胞。
(二)基于STAT3和NF- κ B双信号通路为靶点的高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建本发明基于STAT3和NF-κΒ双信号通路为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建，具体包括以下工艺步骤(1)报告系统载体构建利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3特异性结合序列与NF-κΒ特异性结合序列以及3’端含有 TATA盒序列的DNA片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。
上述STAT3特异性结合序列与NF- κ B特异性结合序列包含有η个STAT3特异性结合序列与m个NF-κΒ特异性结合序列，且n:m=l:广16:1。
插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当STAT3和/或NF-K B活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；抑制STAT3和/或NF-kB活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都降低，也就抑制细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就减弱。(2)细胞模型的构建将报告系统载体转染同时具有组成型STAT3和NF-K B活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对STAT3和NF-κ B信号抑制剂有响应的克隆， 即为基于STAT3和NF-kB双信号通路为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型。
在同时具有组成型STAT3和NF-K B活性的细胞中，报告系统载体能很好地被活化，当使用STAT3和/或NF-K B信号通路抑制剂时即可使荧光被显著抑制，构建的细胞模型也就无需在外源刺激下灵敏地用于高通量药物筛选。
(三)基于STAT3和NF-κ B双信号通路为靶点的高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型的应用本发明基于STAT3和NF-kB双信号通路为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型用于筛选治疗STAT3和/或NF-kB持续活化造成的细胞癌变、STAT3与NF-κ B相互结合、相互促进引起的细胞癌变的药物。具体筛选方法如下(1)将所述抗肿瘤药物筛选细胞模型用100ml培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30% 40% ；(2)培养基中加入待筛选化合物0.1m广anl，继续培养对小时；(3)在96孔板中加入50ml稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；(4)以化合物细胞毒性实验消除化合物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率达仍在 40%以上得到复筛产物，即为以STAT3和/或NF-κ B信号通路为靶点的肿瘤抑制药物。
本发明相对于现有技术具有以下优点以STAT3与NF-K B双信号通路为靶点， 采用基于同时具有组成型STAT3与NF-K B活性的细胞系为策略，使报告系统本身在细胞中处于高度活化状态，无需使用外加刺激物，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选；不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从“细胞培养一激活STAT3和/或 NF-kB —加化合物一检测”简化为“细胞培养一加化合物一检测”，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。此外，本发明能同时筛选治疗STAT3和/或NF-κΒ持续活化造成的细胞癌变，STAT3与NF-κ B相互结合、相互促进引起的细胞癌变的药物，相对于单信号的药物筛选系统，具更高地效率。


图1为使用Western-Blot方法检测本发明所涉及的细胞中STAT3和NF-κ B 活性结果。
图2为使用凝胶电泳阻抑试验(EMSA)检测本发明所涉及的细胞中STAT3活性结^ ο
图3为使用凝胶电泳阻抑试验(EMSA)检测本发明所涉及的细胞中NF-KB活性结果。
图4为本发明所用报告系统的基本原理图。图5为实施列1所用报告载体基本骨架。图6为实施例1所构建的报告系统载体SIE- κ B-Iuc插入序列的测序结果图。图7为实施例1利用细胞检测报告系统载体中两种结合序列的响应能力。图8为实施例1利用ΑΜ9细胞检测报告系统载体启动转录能力。图9为实施例1抗肿瘤药物筛选细胞模型两种稳转细胞株SKA及SKK对STAT3 或NF-κΒ活性升高的响应。图10为实施例1抗肿瘤药物筛选细胞模型两种稳转细胞株SKA及SKK对STAT3 或NF-κΒ活性降低的响应。图11为实施例1所筛选天然产物化合物库中，筛选出的经文献可证的特异性抑制化合物的抑制率。图12为使用Western-Blot方法检测所筛得未知天然产物h31 (10 μ Μ)处理 DU145细胞后其STAT3的活性的抑制效果。图13为实施例2所构建的报告系统载体(SIE-K B)_luc插入序列的测序结果图。图14为实施例2利用293T细胞检测报告系统载体中(SIE- κ B) -Iuc对STAT3 和/或NF- κ B信号通路活化的响应能力。图15为实施例2抗肿瘤药物筛选细胞模型对STAT3或NF-κ B活性降低的响应。图16为实施例3所构建的报告系统载体SIE/ κ B-Iuc插入序列的测序结果图。

仪器PerkinElmer Victor3荧光/化学发光分析仪。试剂萤火虫荧光素酶测定试剂盒，包括普通荧光素酶底物以及稳定型荧光素酶底物(Steady-Glo)购自Promega公司；白细胞介素6 (IL-6)及肿瘤坏死因子α (TNFa ) 购自P印rotech公司；PD180970，TPCA-I以及嘌呤霉素购自Sigma-Aldrich公司；用于筛药的96孔板购自Corning公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自!^rmentas公司；载体提取及DNA产物纯化相关试剂盒，购自天根生化公司；引物合成及测序，上海生工提供；DMEM (高糖)及胎牛血清购自Hyclone (Thermo公司);转染试剂Ger^scort II购自南京慧基生物公司；筛选的化合物由国家小分子化合物资源中心提供；各种抗体购自Cell Signaling Technology 公司。实施例1
1、报告系统载体构建
按图4所示基本原理图，人工构建响应序列，其中包含STAT3结合序列和NF-K B结合序列。STAT3结合序列简称SIE，NF-kB结合序列简称κΒ。这里的STAT3结合序列由5，-TTCCCGTAA-3，和5，-TTCCTGTAA-3，各8个交替串联；NF- κ B结合序列为 5’-GGGAATTTCC-3’ ；将两种结合序列串联在一起，后面加上通用的TATA盒辅助序列 5’ -ΤΑΤΑΤΑΑ-3’，插入到通用的荧光素酶报告载体pBR322-luC-puro，得到重组载体命名为SIE-K B-Iuc ；作为对照，将单独包含STAT3结合序列或NF-κ B结合序列(其余构成一样) 的核酸序列插入荧光素酶报告载体上，分别命名为SIE-Iuc和κΒ-luc。这里两种响应元件序列的比例为16:1，该比例根据构建细胞模型时所用具有组成型NF-kB和STAT3 活性细胞(参见图1，图2，图3)的实际情况以及对报告基因的启动情况调整。荧光素酶报告载体pBR322-luC-puro由pBR322载体Hind III和Ml I之间插入北美萤火虫荧光素酶 (Firefly Luciferase，参见 J R de Wet 等人Mol. Cell. Biol. 1987)报告基因和嘌呤霉素基因(Puromycin，参见 Lacalle RA 等人Gene. 1989，GenBank: M25346. 1)所得，并且荧光素酶报告基因和嘌呤霉素筛选基因通过内部核糖体进入序列(IRES)相连，嘌呤霉素基因终止密码子下游有AATAAA序列为poly A加尾信号。pBR322-luC-puro多克隆位点位于原EcoR I和Hind III之间(参见图5)。
构建时，先插入含有NF-K B结合序列和TATA盒的序列，然后插入STAT3结合序列，最终得到SIE-κ B-TATA盒的整体插入序列，具体步骤如下①荧光素酶报告载体 pBR322-luc-puro用天根高纯度质粒小提中量试剂盒提取，取10 Pg以Bio I和Hind III (各3 μ )做双酶切，37 8 h，琼脂糖凝胶电泳，使用天根DNA纯化回收试剂盒回收，得到产物I ；将两条带有粘性末端(并可与》10 I和Hind III酶切位点配对)的互补引物(包含了 NF- κ B结合序列和TATA盒序列，见下划线)


本发明提供了一种基于STAT3和NF-κB双信号通路为靶点的高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型，该模型采用STAT3特异性结合序列与NF-κB特异性结合序列组合建立报告系统载体；结合同时具有组成型STAT3和NF-kB活性细胞构建而成，用于筛选治疗STAT3和/或NF-κB持续活化造成的细胞癌变，STAT3与NF-κB相互结合、相互促进引起的细胞癌变的药物，相对于单信号的药物筛选系统具更高的效率。由于选用同时具有组成型STAT3和NF-kB的活性细胞，模型细胞中报告基因处于高度活化状态，无需使用外加刺激物，简化了筛选流程，降低了筛选成本，提升了系统稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。