一种增强成骨活性的复合人工骨及其制备方法[0002]由于骨关节坏死、股骨头坏死、创伤、感染、肿瘤切除等造成的骨缺损，以及在整形外科、颌面修复等手术中，对骨支架材料的需求不断增大。常用的自体骨、异体骨移植均存在不同程度上的不足，例如，自体骨移植虽然没有免疫排斥反应且具有较好的骨诱导性，但自体骨移植来源受限，且会给病患带来二次创伤的痛苦；异体骨移植免疫排斥反应大，引起病毒传播感染，存在安全隐患。研究合成具有优良生物相容性、能够促进骨细胞粘附、增殖、分化、生长及介导新骨组织形成的人工骨支架材料成为了一种趋势。[0003]胶原蛋白是天然骨成分之一，具有良好的生物相容性、低免疫原性，能够很好的促进细胞的粘附与增殖，其作为一种生物高分子物质，具有一般蛋白质的化学性质，可以发生氨基反应、羧基反应、羟基反应、显色反应及交联反应等。类人胶原蛋白是利用基因工程方法制备得到的一种人源性蛋白，它是将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA经酶切后重组于E.coli (大肠杆菌)体内，再经高密度发酵、分离、复性、纯化等工艺获得的一种生物高分子蛋白。它具有胶原蛋白的一般性质，具有良好的生物相容性，促细胞粘附、生长的特性。 [0004]羟基磷灰石天然骨主要组分中的另一种重要组成物质，其不仅具有良好的生物相容性及生物活性，而且具有良好的骨诱导和骨传导性能，能与骨组织较好的结合，有利于支架材料才与机体的应答过程。[0005]多酚已经被作为一种交联剂用在蛋白的交联上，以提高蛋白之间的强度、降解性等。尤其的，橄榄多酚，属于裂环烯醚萜类，对于骨骼的发育较好的功能，它能促进人体对钙质等矿物质的吸收来保持骨密度和预防骨质疏松的发生。另外，橄榄多酚具有较高的抗氧化活性，而具有较高的抗氧化活性的物质能够降低某一类活性因子的释放来促进骨的重建过程。
[0006]本发明的目的是提供一种增强成骨活性的复合人工骨及其制备方法，改善细胞与植入支架材料的应答过程，提高植入物的生物活性及生物相容性，更好的引导新骨的构建。[0007]本发明所采用的技术方案是: 一种增强成骨活性的复合人工骨的制备方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:用去离子水配制质量分数为10%_25%的胶原蛋白水溶液；
步骤二:将纳米羟基磷灰石粉末分批加入胶原蛋白水溶液中，胶原蛋白与羟基磷灰石的质量比是1: (2-4)，室温下于漩涡震荡仪上充分混匀；
步骤三:将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中；步骤四:将模具于4°C中预冻20-60min，依次移至_20°C预冻l_2h，转移至_80°C预冻3_6h，之后于真空冷冻干燥机中干燥12-48h ；
步骤五:用乙醇溶液配制质量分数为2%-5%橄榄多酚溶液，调节pH至6-8之间；步骤六:将步骤四所得冻干品于步骤五的多酚溶液中于37°C -60°C孵育12-24h ；步骤七:将步骤六得到的样品用pH为7.3的PBS冲洗7-20遍，除去乙醇，重复步骤三和四。
[0008]步骤一中，胶原蛋白为动物源性的全长胶原蛋白、胶原多肽、明胶，或者基因工程法制得的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。
[0009]步骤五中，乙醇溶液是质量分数为75%_95%的乙醇水溶液；
PH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.l-lmol/L0
[0010]所述的一种增强成骨活性的复合人工骨的制备方法制得的增强成骨活性的复合人工骨。
[0011]本发明具有以下优点:
(I)本发明提供的增强生物相容性的复合人工骨的制备工艺简单，且整个制备过程使用的原料、试剂及溶液等均无毒无害。
[0012](2)本发明提供的增强成骨活性的复合人工骨以天然骨的主要成分胶原蛋白与羟基磷灰石为主要原料，大大提高了支架材料的生物活性及生物相容性。
[0013](3)本发明的提供的增强成骨活性的复合人工骨以天然物质橄榄多酚作为交联剂，无毒无害，不仅大大的提高了人工骨支架材料的生物相同性，而且，利用各组分之间的键合作用提高了支架材料的力学性能，另外，利用橄榄多酚天然的抗氧化性及促进出成骨活性，来制备了具有较好的促进成骨活性的人工骨支架材料。
[0014](4)本发明提供的胶原蛋白基纳米羟基磷灰石复合人工骨抗压强度均在2_3Mpa，能在植入部分提供一定的强度支持，引导新骨的形成。



[0015]图1为骨修复材料的抗压强度试验结果。
[0016]图2为骨修复材料浸提液体外细胞毒性试验结果，图中，MEM为细胞培养液，Scaffold为材料浸提液，纵轴为细胞成活率，横轴为时间。
[0017]图3为成骨细胞在支架材料上的增殖及分化研究:不同培养时间下细胞增殖(cell)及碱性磷酸酶活性的研究(ALP)。

[0018]下面结合对本发明进行详细的说明。
[0019]本发明所涉及的一种增强成骨活性的复合人工骨的制备方法，模仿天然骨的基本成分，以胶原蛋白和羟基磷灰石为主要原料，采用慢冻及真空干燥技术制得初次支架材料，再辅助以天然多酚类化合物溶液处理，制得的支架材料表面即具有一定的疏水特性又具有一定的亲水特性，加上其粗糙的形貌特征非常有利于细胞的粘附与增值，大大的提高了表面生物活性及支架材料的生物相容性。具体制备方法是:步骤一:用去离子水配制质量分数为10%-25%的胶原蛋白水溶液。
[0020]胶原蛋白为动物源性的全长胶原蛋白、胶原多肽、明胶，或者基因工程法制得的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。
[0021]步骤二:将纳米羟基磷灰石粉末分批加入胶原蛋白水溶液中，胶原蛋白与羟基磷灰石的质量比是1: (2-4)，室温下于漩涡震荡仪上充分混匀。
[0022]步骤三:将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中。
[0023]步骤四:将模具于4°C中预冻20_60min，依次移至_20°C预冻l_2h，转移至_80°C预冻3-6h，之后于真空冷冻干燥机中干燥12-48h。
[0024]步骤五:用乙醇溶液配制质量分数为2%_5%橄榄多酚溶液，调节pH至6-8之间。
[0025]乙醇溶液是质量分数为75%_95%的乙醇水溶液；pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为
0.1-lmol/Lo
[0026]步骤六:将步骤四所得冻干品于步骤五的多酚溶液中于37°C -60°C孵育12_24h。
[0027]步骤七:将步骤六得到的样品用pH为7.3的PBS冲洗7_20遍，除去乙醇，重复步骤三和四。
[0028]实施例1:
步骤一:用去离子水配制质量分数为10%的胶原蛋白水溶液。
[0029]胶原蛋白为动物源性的全长胶原蛋白、胶原多肽、明胶。
[0030]步骤二:将纳米羟基磷灰石粉末分批加入胶原蛋白水溶液中，胶原蛋白与羟基磷灰石的质量比是1:2，室温下于漩涡震荡仪上充分混匀。
[0031]步骤三:将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中。
[0032]步骤四:将模具于4°C中预冻20min，依次移至_20°C预冻lh，转移至_80°C预冻3h，之后于真空冷冻干燥机中干燥12h。
[0033]步骤五:用乙醇溶液配制质量分数为2%橄榄多酚溶液，调节pH至6。
[0034]乙醇溶液是质量分数为75%的乙醇水溶液；pH值调节剂选自氢氧化钠溶液，或盐酸溶液，摩尔体积浓度均为0.lmol/L。
[0035]步骤六:将步骤四所得冻干品于步骤五的多酚溶液中于37°C孵育12h。
[0036]步骤七:将步骤六得到的样品用pH为7.3的PBS冲洗7_10遍，除去乙醇，重复步骤三和四。
[0037]实施例2:
步骤一:用去离子水配制质量分数为15%的胶原蛋白水溶液。
[0038]胶原蛋白为基因工程法制得的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。
[0039]步骤二:将纳米羟基磷灰石粉末分批加入胶原蛋白水溶液中，胶原蛋白与羟基磷灰石的质量比是1:3，室温下于漩涡震荡仪上充分混匀。
[0040]步骤三:将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中。
[0041]步骤四:将模具于4°C中预冻40min，依次移至_20°C预冻1.5h，转移至_80°C预冻
4.5h，之后于真空冷冻干燥机中干燥30h。
[0042]步骤五:用乙醇溶液配制质量分数为3%橄榄多酚溶液，调节pH至7。
[0043]乙醇溶液是质量分数为85%的乙醇水溶液；pH值调节剂选取氢氧化钾溶液和硫酸溶液，摩尔体积浓度均为0.5mol/L。
[0044]步骤六:将步骤四所得冻干品于步骤五的多酚溶液中于48°C孵育18h。
[0045]步骤七:将步骤六得到的样品用pH为7.3的PBS冲洗10-15遍，除去乙醇，重复步骤三和四。
[0046]实施例3:
步骤一:用去离子水配制质量分数为25%的胶原蛋白水溶液。
[0047]胶原蛋白为基因工程法制得的重组胶原蛋白或类人胶原蛋白。
[0048]步骤二:将纳米羟基磷灰石粉末分批加入胶原蛋白水溶液中，胶原蛋白与羟基磷灰石的质量比是1:4，室温下于漩涡震荡仪上充分混匀。
[0049]步骤三:将步骤三得到的混合物迅速转移至模具中。
[0050]步骤四:将模具于4°C中预冻60min，依次移至_20°C预冻2h，转移至_80°C预冻6h，之后于真空冷冻干燥机中干燥48h。[0051]步骤五:用乙醇溶液配制质量分数为5%橄榄多酚溶液，调节pH至8。
[0052]乙醇溶液是质量分数为95%的乙醇水溶液；pH值调节剂选取碳酸钠溶液或磷酸溶液，摩尔体积浓度为lmol/L。
[0053]步骤六:将步骤四所得冻干品于步骤五的多酚溶液中于60°C孵育24h。
[0054]步骤七:将步骤六得到的样品用pH为7.3的PBS冲洗15-20遍，除去乙醇，重复步骤三和四。
[0055]参见图1的骨修复材料的抗压强度试验结果，骨修复材料的抗压强度达到
2.6Mpa0
[0056]参见图2的骨修复材料浸提液体外细胞毒性试验结果，图中，MEM为细胞培养液，ScaffoId为材料浸提液，纵轴为细胞成活率，横轴为时间。细胞在纯培养液及骨修复用支架材料的浸提液中表现出了相当的生存活力，表明材料没有细胞毒性，可支持细胞的生长增殖；
参见图3的成骨细胞在骨修复用材料上的增殖及分化研究:不同培养时间下细胞增殖(cell)及碱性磷酸酶活性的研究(ALP)。从中可以观察到，随着培养时间的延长，细胞数量在逐渐增多，细胞在材料上不断生长增殖，碱性磷酸酶是细胞分化的前期标志，碱性磷酸酶的活性先是增加后是减小，说明在14d后成骨细胞进入分化的后期阶段，材料可支持细胞的增殖分化。
[0057]本发明利用纯天然物质——橄榄多酚(该交联剂常用于皮革处理领悟，业界从未将其用于胶原蛋白/骨组织的复合体系中)对制备的有机物/无机物复合人工骨支架材料进行交联，一方面利用键合作用提高了支架材料的力学性能，另一方面，利用橄榄橄榄多酚较高的抗氧化活性及促进成骨性能，而大大的提高了人工骨支架材料的成骨活性。
[0058]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。