专利名称：细胞培养装置的制作方法一直以来，细胞培养的操作如果没有限制的话是在除菌后的洁净室内在严格的制造工序下通过熟练的操作者的手工操作来进行的。因而，当面向产业化而大量地培养细胞时，有可能导致操作者的负担增加、对操作者的教育和培养需要花费时间和成本、人为的失误或检体的错拿、以及带有菌等的人所导致的生物学污染(污染)等，为了解决这些问题需要很大的成本。这在细胞大量培养的产业化中成为巨大的壁垒。因而，期待通过利用机器将一系列的培养操作自动化来解决这些问题。因此，目前主要开发了使用多关节型机器人机械手来模仿人手的培养操作的自动培养装置。但是，利用人手的培养操作是由复杂的动作构成的。对于这种培养装置而言，有必要与人手同等地或进行简化、无论怎样也要无菌地实施培养容器或培养液的处理。为此，例如专利文献1提供了利用多关节型机器人机械手来处理培养容器的搬送操作或培养基交换等的例子。对该多关节型机器人机械手，提出了可对其自身进行灭菌的构成。另外，例如专利文献2提供了使培养容器和流路本身成为封闭体系来进行处理的方式。其为对软骨细胞施加很高的压力来进行培养的装置，其具备下述机构通过使培养容器或流路内成为封闭体系、在培养结束后不与外部大气接触地将与培养容器部分加栓的流路取出的方式，无菌地将所生成的软骨组织回收。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2006-14拟68号公报专利文献2 日本特开2002-315566号公报
发明要解决的技术问题对于专利文献1所记载的自动培养装置而言，由于培养容器自身为开放体系，因而需要打开盖子将培养容器内部开放的动作。因而，为了保持自动培养装置内部的洁净性， 伴有空调机器的大型化。由此整个系统变大，具有耗费成本的问题。对于专利文献2的自动培养装置而言，由于是封闭体系，因而如何在保持内部无菌性的情况下安装流路、且将培养基(培养液)或细胞(细胞悬浮液)注入到流路内成为课题。另外，在实施复杂的培养操作时，如何能够容易地将该密闭的流路设置在装置上、且高效地施加驱动力成为课题。目前，在使用人类细胞将利用培养制作的细胞或组织移植到人类的再生医疗中，将在手术室内采集的组织放入到进行了无菌处理的试管等中，在内部为无菌的状态下运出，在遵照生产质量管理规范(GMP:Good Manufacturing Practice)的洁净室(CPC Ce 11 Processing Center，细胞加工设施)内从组织中将需要的细胞分离出来，实施目标的调整， 进行培养。为了将所采集的细胞在制造工序内不受任何污染地进行培养，必须在适于极其严格的规则的工序、环境下通过人手进行制造。即便是利用机械自动地进行细胞培养处理的自动培养装置，该装置所制造的细胞或组织在制造工序中也不可以有任何由菌或病毒等所导致的生物学污染。在这种状况下，鉴于上述使用了开放体系培养容器的自动培养装置的系统，为了能够对自动培养装置内部进行灭菌、使内部保持为高度的洁净环境，需要巨大的空调设备和灭菌设备，且需要其设备本身的制造成本和维护成本。另外，在灭菌处理时， 发动机类的驱动体系是无法承受的。因此，优选使用于自动培养的培养容器本身为封闭体系结构、其内部可进行灭菌处理、由外部供给驱动力来培养细胞的系统。但是，为了在封闭体系结构的培养容器中进行培养，如何使向其内部无菌地放入培养基或细胞并实施培养处理的机构和控制方法高效化成为课题。本发明的目的在于，为了解决上述课题，提供能够使用细胞等制作组织的以遵循生产质量管理规范为目标的细胞培养装置、以及具备要素机器、封闭体系流路的构成、省空间配置、用于流路的无菌液体输送机构的细胞培养装置。用于解决技术问题的方法为了达成上述目的，本发明提供一种细胞培养装置，其为使用培养基来培养细胞的细胞培养装置，其构成具备输送培养基和细胞的多个流路；配置于第一空间内的驱动底座；通过流路与驱动底座相连接的培养容器；保持培养容器的保持构件；形成于比驱动底座更靠下方的位置并形成冷藏空间的冷藏部；和将第一空间与冷藏空间隔开的中间室。另外，为了达成上述目的，本发明提供一种细胞培养装置，其为培养细胞的细胞培养装置，其构成具备输送培养基和细胞液的多个流路；配置于第一空间内的驱动底座；通过流路与驱动底座相连接的培养容器；配置在相对于第一空间为第二象限的位置且设置有培养容器的培养容器底座；对培养基和细胞液进行冷藏的冷藏部；和位于比驱动底座更靠下方且相对于所述第一空间为第四象限的位置、并将设置于其内部的冷藏部和第一空间隔开的中间室。
发明效果
通过本发明，可以实现具备具有培养容器的封闭体系流路的设置容易性、以生产质量管理规范水平的无菌洁净度将细胞无菌且高效地进行培养的细胞培养装置。


图1为表示第一实施例的设置有驱动底座的自动培养装置的整体概略构成的图。
图2为表示第一实施例的打开门的自动培养装置的正视图。
图3为表示第一实施例的自动培养装置的内部的侧视图。
图4A为表示第一实施例的将密封机构与卡爪连接之前的状态的构成图。
图4B为表示第一实施例的将密封机构与卡爪连接之后的状态的构成图。
图5为表示第一实施例的将流路设置于驱动底座的状态的俯视构成图。
图6为表示第一实施例的罐的构成的侧视图。图7A为表示第一实施例的泵与注射器连接之前的状态的俯视图。图7B为表示第一实施例的泵与注射器连接之后的状态的俯视图。图7C为表示第一实施例的泵与注射器连接之前的状态的侧视图。图7D为表示第一实施例的泵与注射器连接在一起的状态的侧视图。图7E为表示第一实施例的泵与注射器连接之后的状态的侧视图。图8A为表示第一实施例的在载置于搬送夹具的状态下未在细胞袋中注入细胞悬浮液的状态的侧视构成图。图8B为表示第一实施例的在载置于搬送夹具的状态下在细胞袋中注入有细胞悬浮液的状态的侧视构成图。图9为表示第一实施例的自动培养装置整体的控制的构成的模块图。

6外，对于各图中共同的构成，标以同样的附图标记。
[实施例1]
图1为第一实施例的自动培养装置10的整体概略图。图2为自动培养装置10的正视图。图3为自动培养装置10的侧视图。图4A及4B为关于细胞培养室13与冷藏库 (冰箱)14之间的密封机构33的概略图。图5为关于流路40的构成的概略图。图6为关于作为流路40的构成部件之一的罐25的概略图。图7A、7B、7C、7D及7E为关于作为流路 40的构成部件之一的泵23的概略图。图8A及8B是关于无菌的细胞液或培养基向流路40 内的供给的概略图。图9为表示用于使自动培养装置10工作的线路的模块图。
<自动培养装置的构成〉
使用图1、图2、图3及图4A、图4B对自动培养装置10的整体构成进行说明。对于自动培养装置10，作为基本的构成要素，是由细胞培养室13、冷藏库14、控制部15、中间室 16构成。以下对各个的基本构成进行说明。
如图1所示，自动培养装置10整体由细胞培养室13、构成冷藏部的冷藏库14、控制部15、中间室16这4个区域构成，通过打开细胞培养室门11和冷藏库门12、中间室门17， 可以进入自动培养装置10内部。细胞培养室13中由作为保持并设置培养容器20的保持构件的培养容器底座21及与其连接并旋转的旋转机构22、对培养容器20内的细胞图像进行拍摄的显微镜观及其镜台29、具有泵23或阀M等驱动机构且与含有罐25的封闭体系结构的流路40相连接的驱动底座27构成。进而具有与内部的所有驱动机构相连接并与控制部15接线的连接板30。需要说明的是，控制部15与连接板30之间的配线省略了图示。 在细胞培养时，细胞培养室13内部保持在接近温度为37°C、湿度为100%、二氧化碳为5% 的环境。但根据需要也可成为仅包含培养容器20的周边部分保持前述环境的结构。可以在冷藏库14中放入培养基底座32，在细胞培养室13、冷藏库14、中间室16这3个区域保持独立的情况下，利用仅通过流路40的管41的密封机构33，可以保持细胞培养室13和冷藏室14内部的温度以防止结露。在中间室16内具有带有滤器51的风扇50。滤器51设置在排气口上。该风扇50引起气流的移动，可以防止湿度上升。另外，在之后详细说明的中间室16的入口处使用阻断细胞培养室13内部和冷藏库14内部、仅使培养液流过的密封机构。
控制部15独立于其他的区域，设置在细胞培养室13或中间室16的下方。由此阻断细胞培养室13内的温度、湿度、二氧化碳以保护内部的电气设备类。控制部15中具有风扇52，利用吸气用滤器53和排气用滤器M，可以使内部的热量无菌地释放到外部。由风扇 52和滤器5354构成控制部15的冷却部。57为控制部15的控制用面板，与通常的操作面板同样，具备各种按钮或显示部等，用于控制部15的操作。当然，控制部15是由省略了图示的作为处理部的中央处理部(CPU)和作为存储控制程序或数据的存储部的存储器等构成的。
图2表示从打开了细胞培养室门11、冷藏库门12的状态的自动培养装置10的正面观察到的各要素机器的配置。以细胞培养室13内部的驱动底座27为中心，在水平方向上由可旋转的培养容器20构成，在垂直方向上由可设置装有细胞液或培养基的培养基底座32的冷藏库14构成。由该图2和图1可知，在本实施例的自动培养装置10中，当使设置驱动底座27的空间(第一空间)为第一象限时，将第一空间和作为冷藏部的冷藏库14隔开的中间室16处于第四象限，作为保持并载置培养容器20的保持构件的培养容器底座21 处于第二象限或者通过旋转处于第三象限。通过本实施例的配置构成，节省空间，成为各机器间距离短的构成，可将在位于第四象限的冷藏库14中保存于4°C左右的培养基在位于第一象限的驱动底座27上的罐25中温热，尽快地供至位于第二象限的培养空间，可以使由于移动所造成的细胞损伤降低至最小。进而，如图2所示，拍摄细胞的显微镜观从正面来看在垂直于位于第二象限的培养容器20的方向上构成。显微镜观固定在用于移动或对焦的镜台四上。关于它们的配置，以位于第一象限的驱动底座27为中心，可以全部配置在水平方向上，也可全部配置在垂直方向上，可以根据所培养的细胞选择最佳的配置。冷藏库14处于位于第四象限的中间室16内部，利用密封机构33将各个区间分隔开，因而除流路40内部以外，与细胞培养室13 在空间上是分离的。对于其构成，由于在图3中有详细的记载，因而在后面进行说明。在驱动底座27上配置进行流路40内的液体输送的泵23、切换液体输送线路的阀 M、储存并温热培养基等或改变液体的流动方向的罐25等驱动机构。在后面对其进行详细的叙述。为了使驱动机构工作，在驱动底座27背面具有连接板30，可以连接于驱动底座27 的连接器31。由连接板30可以配线至控制部15。此时，由于连接板30在保持细胞培养室 13内部环境的情况下将连接器31配线与外部的控制部15相连接，因而具有隔热防水的结构。本图中记载了控制部15处于细胞培养室13的垂直方向，但例如在桌子上使用时也可设置在水平方向上或设置在剩余空间中。图3表示从自动培养装置10的侧面观察到的各要素机器的配置。由于在同一装置内配置温度、湿度等环境完全不同的细胞培养室13和冷藏库14并连接流路40，因而设置了中间室16和密封机构33。细胞培养室13 —般具有37°C、100%湿度，冷藏库14 一般将内部保持在4 5°C，因而当在细胞培养室13附近设置时会发生结露，并且产生细胞培养室13内部的温度不均。设想一般的孵育器(细胞培养室)或冷藏库是在室温或室内的湿度下使用来进行设计。因而，通过在冷藏库14和细胞培养室13之间设置保持室内环境的中间室16，可以防止剧烈的温度变化所导致的结露的发生。但是，也希望冷藏库14内的培养基或洗涤液、细胞悬浮液可通过构成流路40的管41输送至细胞培养室13内。因而，将管41通入到图4A、图4B所示的密封机构33的凹槽42中，嵌入在卡爪34 中，从而将冷藏库14、中间室16、细胞培养室13的空间分离，可以将培养基或洗涤液、细胞悬浮液从冷藏库14输送至细胞培养室13。卡爪34分别设置在将细胞培养装置13与中间室16隔开的隔壁13A和将冷藏库14与中间室16隔开的隔壁14A上。图3中，冷藏库14中具有用于对其内部进行冷却的冷却器18。其将冷却过的部分的热量排出到冷藏库14外部。为了使得中间室14内部的温度不会上升，成为以下的构成 利用风扇50由自动培养装置10外部通过滤器51吸入空气，与冷却器18接触，并通过滤器 51释放到自动培养装置10外部。S卩，用冷却器18和风扇50以及滤器51构成中间室的冷却部。图3的箭头55表示空气的流动。由此，中间室16内部的气温和湿度可以保持在与自动培养装置10外部相同的状态。控制部15内部多存在计算机或电源等发热装置，必须将内部的热量释放。为了防止灰尘进入控制部15内部，通过吸气用滤器53利用风扇52 放入控制部15外部的空气，并将其通过排气用滤器M返回至控制部15外部。将空气的流动56以图3的箭头表示。由此，例如在洁净室的洁净区域内可防止散布灰尘等，可以维持洁净度。
<流路和驱动底座的构成>
使用图5、图6及图7A 7E，对流路40的构成及其驱动方法进行说明。图5为表示流路40和驱动底座27的整体构成的概略图。图6为表示罐25的构成的正视图。图7A 表示注射器43与泵23分离的状态的俯视图、图7B表示注射器43和泵23成为一体的状态的俯视图、图7C表示注射器43与泵23分离的状态的侧视图、图7D表示将注射器43安装于泵23的状态的侧视图、图7E表示注射器43和泵23 —体地成为注射器泵44的状态的侧视图。注射器43可以在同一轴上平移。
首先，使用图5对封闭体系结构的流路40的构成进行说明。流路40由可交换的下述构件构成管41、培养容器20、注射器43、滤器45、配件46、罐25、细胞袋60、培养基袋 61、洗涤液袋62、废液袋63、回收袋64。该流路40通过与作为驱动机构的改变流动方向的阀对、进行液体输送的泵23、从位于第二象限的水平方向旋转至位于第三象限的垂直方向而将培养容器20内的气泡排除的旋转机构22相连接，可以进行利用细胞液或培养基向培养容器20内的输送所实施的细胞接种以及培养基交换、利用洗涤液所实施的流路洗涤。这里，设置培养容器20的培养容器底座21的从第二象限向第三象限的旋转可通过从图2所示的水平位置利用旋转机构22使培养容器底座以逆时针方向向下旋转而实现。
驱动机构配置在驱动底座27上，不能暴露在湿度等下的配线或机构全部放入在驱动底座27内部，可以设置在高湿度环境下。由于与控制部15相连接，因而在驱动底座27 上具有防水应对的连接器31，在将驱动底座27设置在自动培养装置10内部时，通过与该连接器31相连接，可以使驱动机构工作。对于流路40的配置，以罐25为中心，分成向培养容器20输送液体的培养容器组件35、将冷藏库14内的培养基类输送至罐25的培养基组件 36、用于进行流路40内部的液体输送并控制气体流动(方向、流速)的泵组件37这3个独立的组件。通过该组件化，可以提高驱动机构的最佳配置和流路的设置容易性。
通过图6对成为组件中心的罐25的构成进行说明。在罐25中有相对于培养容器 20的注入罐65和废液罐66。另外，对应着高度具有作用不同的配件46。由下开始分为第 1配件67、第2配件68、第3配件69。对于第1配件67，注入罐65侧是向培养容器20的液体输送口，废液罐66侧是向废液袋63或回收袋64的液体输送口。对于第2配件68，注入罐65侧是将从培养基组件36送出的细胞悬浮液或培养基、洗涤液注入到注入罐65内部的注入口，废液罐66侧是将来自培养容器20的废液注入到废液罐65内部的注入口。可进入罐25内的液体为总量不会到达该第2配件68的容量。第3配件69与泵组件37相连接、 在用于流路40内液体输送的气流控制中使用。在罐25中，为了在液体输送时细胞不会残留于壁面，具有椎体47。通过该倾斜，可以防止细胞悬浮液内的细胞在罐25内残存。在细胞接种或培养基交换的向培养容器20内部送入液体时，可以暂时在该罐25内温热至周边温度。还可在注入罐65内设置加热器。
通过图7对注射器泵44说明构成。泵23由发动机70、滚珠螺杆71、编码器72、驱动台73、注射器制动器74、卡锁75以图7A、7C的状态构成。将连接有使注射器43内部的气体的流动为一个方向的阀76的注射器43以2根相向的方式设置在注射器制动器74和驱动台73上。提起卡锁75，如图7D那样使其旋转，如图7B、7E那样将注射器43固定。通过发动机70的旋转，利用滚珠螺杆71将驱动台73左右地移动，由此可一直反复进行一侧吸引、另一侧喷出，能够以接近层流的状态进行连续液体输送。通过泵组件37的阀M的配置方法，可以切换向罐25的气体的喷出和吸引。可以在保持封闭体系状态的情况下驱动注射器泵44。由于可进行利用编码器72的精密控制，因而可以正确地输送所需的液体量。<与细胞悬浮液或培养基向培养容器内的注入有关的一系列的动作>根据以上的各部的构成，对自动培养装置的一系列细胞培养动作的一例进行说明。利用注射器泵44将细胞悬浮液或培养基输送至罐25的注入罐65侧。装入规定量后， 由滤器45通过气体将管41内的液体排除，实施反向输送将液体送回至原点位置的处理，数次后也可正确地进行液体输送。在注入罐65内温热细胞悬浮液或培养基。通过阀M，利用注射器泵44输送至培养容器20。此时，将培养容器20内的气体或废液送至罐25内的废液罐66侧。切换泵组件37的阀对，将废液送至废液袋63或回收袋64中。切换泵组件37的阀对，将洗涤袋62内的洗涤液输送至罐25的注入罐65侧。装入规定量后，由滤器45通过气体将管41内的液体排除，实施反向输送将液体送回至原点位置的处理，数次后也可正确地进行液体输送。通过阀对，按照不将洗涤液输送至培养容器20的方式送至罐25内的废液罐66侧。切换泵组件37的阀M，将废液送至废液袋66。在培养期间中反复进行规定次数的以上动作。在流路40内部、特别是在培养容器组件35中以单向通行的方式流动液体。 由此，由于是在废液不会返回至培养容器20内的培养空间和培养基袋61类的线路中的情况下一直将洁净、新鲜的培养基供至细胞，因而不会混入细菌等，可以保持洁净的环境。<向封闭体系流路内部的液体注入>图8A、8B中，对向具有封闭体系结构的流路40内无菌注入细胞悬浮液48的方法进行说明。图8A表示未在流路40内部注入细胞悬浮液48的驱动底座27和培养基底座32 的状态、图8B表示在流路40的细胞袋60内部注入有细胞悬浮液48的状态。首先，由图8A开始说明各要素的构成。设有流路40的驱动底座27和培养基底座 32在设置于自动培养装置10之前设置在搬送夹具19上。该搬送夹具19可以将驱动底座 27等设置在自动培养装置10内部或从其中取出，在设置后可仅将搬送夹具19取出。在培养基底座32的内部放有空的细胞袋60。例如当为细胞培养用洁净室(CPC)内部时，这些搬送夹具19设置在等级为10，000的空间77内。在生产质量管理规范(GMP)中，细胞直接处理区域仅为安全柜79 (包含净化台)内部的等级为100的空间78。因此，将用乙醇等进行了仔细的消毒处理的细胞袋60放在安全柜79内部。如图8B所示，利用注射器等将在安全柜79内进行了处理的细胞悬浮液48注入到细胞袋60中。注入后，注入口密封从而保持流路40的封闭体系。将装有细胞悬浮液48的细胞袋60拿出到等级为100的空间78外，放在培养基底座32中。由于流路40预先通过灭菌处理而保持等级为100的空间78，因而流路40即便如图8A那样在等级为10，000的空间77内存在，其内部也可保持等级为100的空间78。之后，即便向自动培养装置10内进行设置，由于驱动机构与流路40内部不相连，因而无论自动培养装置10的设置空间如何，封闭体系结构的流路40内部可一直保持等级为100的空间78。<自动培养装置的线路构成>图9为表示用于控制自动培养装置10的内部机器的控制体系线路的构成的模块图。
自动培养装置10的控制体系线路具备用于输入数据或指示的输入部(键盘、鼠标等)81 ；控制自动培养装置10的各动作的控制部82 ；将控制的状况显示给使用者的显示部80 ；存储程序或参数等的R0M85 ；暂时存储数据或处理结果的RAM86 ；用于进行超高速缓存等动作的存储器83 ；通信部84 ；进行灭菌处理、加热、吹风、二氧化碳供给、水供给等处理并利用监视这些状况的传感器的环境保持装置87 ；具备与驱动底座27连接的旋转机构22 的驱动部89 ；以及控制冷藏库内的环境的冷藏库控制88。当使用者由输入部81或通信部84指示应处理的培养工序时，控制部82根据存储在R0M85的培养准备程序，利用环境保持装置87的灭菌功能对自动培养装置10的内部进行灭菌，处理结束后进行培养环境保持处理，达到温度37°C、5%二氧化碳浓度、湿度 100%、洁净环境区域，同时进行冷藏库控制88。然后，控制部82根据存储在R0M85的自动培养程序，通过位置传感器感知驱动底座27的安装，一旦感知到了连接器31的设置，则通过旋转机构22、驱动底座27实施培养容器20内的细胞培养处理。随时可利用显示部80 和通信部84将其处理状况显示给使用者。当细胞培养处理结束时，利用显示部80和通信部84将结束显示给使用者，一旦感知到了驱动底座27的卸下时，则控制部82根据存储在 R0M85的结束程序进行结束处理。由此，可以实现利用自动培养装置10的一系列的细胞培养处理。需要说明的是，本发明并不限定于上述实施例，包含各种变形例。例如，上述实施例是为了更好地理解本发明而进行了详细的说明，但并不限定于要具备说明的所有构成。另外，上述自动培养装置的控制机构的各构成、功能、处理部等也可以通过将其一部分或全部在例如集成线路中进行设计等利用硬件来实现，当然也可以是将其一部分或全部作成通过作为处理部的CPU执行的程序，由此利用软件来实现。符号说明
10自动培养装置11细胞培养室门
12冷藏库门13细胞培养室
14冷藏库15控制部
16中间室17中间室门
18冷却器19搬送夹具
20培养容器21培养容器底座
22旋转机构⑵泵
24阀25罐
27驱动底座28显微镜
四镜台30连接板
31连接器32培养基底座
33密封机构34卡爪
35培养容器组件36培养基组件
37泵组件40流路
41管42凹槽
43注射器44注射器泵
45滤器46配件
11
47椎体48细胞悬浮液
50风扇(中间室)51滤器(中间室)
52风扇(控制部)53吸气用滤器
54排气用滤器55空气的流动(中间室
56空气的流动(控制部)57控制面板(控制部
60细胞袋61培养基袋
62洗涤液袋63废液袋
64回收袋65注入罐
66废液罐67第1配件
68第2配件69第3配件
70发动机71滚珠螺杆
72编码器73驱动台
74注射器制动器75卡锁
76阀77等级为100的空间
78等级为10，000的空间79安全柜
80显示部81输入部
82控制部83存储器
84通信部85R0M
86RAM87环境保持装置
88冷藏库控制


本发明提供使用于自动培养的培养容器本身为封闭体系结构、内部可进行灭菌处理、从外部供给驱动力来培养细胞的细胞培养装置。其使用各组件的封闭体系流路构成、以驱动底座为中心的机器配置、处于冷藏库和细胞培养室之间的中间室。即，自动培养装置(10)具备输送培养基和细胞液的多个流路(40)；配置于第一空间内并设置有泵(23)、阀(24)、罐(25)的驱动底座(27)；通过流路与驱动底座相连接的培养容器(20)；配置在相对于第一空间为第二象限的位置且设置有培养容器的培养容器底座(21)；对培养基和细胞液进行冷藏的冷藏库(14)；和位于驱动底座的下方且相对于第一空间为第四象限的位置并将设置于其内部的冷藏库(14)和细胞培养室(13)隔开的中间室(16)。