一种基于纳米孔器件对生物分子探针标定dna的特异位点进行检测的方法[0002]基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线之一，成为目前研究和应用探索的热点，除哈佛大学、波士顿大学、布朗大学、加州理工学院、荷兰代尔夫特工业大学等研究小组外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人类基因组测序-1000美元计划，以基于纳米孔器件的测序技术为实现方法，使纳米孔的研究由基础研究开始走向应用(D.Branton, et al.Nature Biotechnology26 (10)，1146 (2008) ;M.Zwolak and M.Di Ventra, Reviews of Modern Physics80(1)，141(2008).)。通过在溶液中电泳驱动分子穿过一个纳米尺度的孔可以实现基于纳米孔器件的单分子探测和分析能力。在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进行快速的分析，当高聚物分子穿过纳米孔时，高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应关系。利用该特性可以直接对数千碱基对长度的单链DNA分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本DNA测序技术成为可能。目前阻碍这一技术长足发展的最大困难在于在电场驱动电压下，DNA穿孔速度过快，超出了通用仪器的分辨率，从而无法实现对单碱基的差别进行识别。[0003]目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使DNA分子从孔一端电泳通过纳米 孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应DNA的生物学信息。但是单纯使用电场调节，DNA的穿孔速度太快，基本在一个碱基一微秒的量级，而目前仪器的最小分辨率为4微秒，也就是说，如果想要区别不同碱基之间的差别，通过现有手段，时间分辨率是无法达到的。要提高时间分辨率，就必须使DNA分子的穿孔时间延长，有效减慢DNA在孔中的运动速度。减慢DNA的穿孔速度，才有可能实现对不同碱基的分辨。[0004]另一方面，现有的第二代高通量测序技术的基本原理是将待测物种的全基因组随机打碎成数百bp的小片段，然后经过体外扩增和修饰标定之后，利用一种“边合成边测序”的方法读取每一个小片段的序列，最后将全部小片段的序列通过一定的算法整合在一起，还原出全基因组的序列。需要指出的是，每个数百bp的小片段相对于人类的全基因组(约3X109bp)来说实在太小，因此在小片段的比对和拼接环节的计算量和算法复杂度是极高的，而且由于人类基因组中存在大量的重复序列，导致现有算法得出的全基因组仍然有5%到10%的不确定度；因此对于精确度要求很高的医疗诊断、药物筛选以及高端科研领域，需要对整个序列进行十几甚至上百次的重复测序，无疑大大增加了测序的成本且降低了时间效率。
[0005]本发明的一个目的是提供一种基于纳米孔器件对生物分子探针标定DNA的特异位点进行检测的方法。[0006]本发明所提供的基于纳米孔器件对生物分子探针标定DNA的特异位点进行检测的方法，包括下述步骤:1)用生物分子探针对DNA的特异位点进行标定，得到标定的DNA ；[0007]2)利用纳米孔测序装置对所述标定的DNA的特异位点进行检测，所述纳米孔测序装置包括:设有正极和负极的电解池、以及分隔所述电解池正极和负极的固态纳米孔薄膜；将所述标定的DNA加入到盛有电解液的所述电解池的正极腔室中，检测时，向所述正极腔室引入压强外场，作为DNA穿孔的驱动外场；并在正极和负极间施加电压，作为与压强外场反向的电场外场；测定过程中所述标定的DNA在纳米孔中受到的压强外场的作用力大于电场力。[0008]所引入压强外场产生的压强可为1.6-2.6个标准大气压，所施加电压的大小可为40_160mv。
[0009]测定时，在具体采用的电解液及纳米孔条件下，根据所要达到的穿孔速度(或穿孔时间)，在上述压强和电压范围内进行调节，经过有限次试验可确定使DNA穿孔速度降低所施加的最佳压强和电压。
[0010]测定时，电解液的浓度可为0.1-3.2mol/L,pH值为8-10。所述电解液可为纳米孔测序法中所采用的电解液。通常采用氯化钾溶液作为DNA测序时的电解液，其余比如NaCl，LiCl都是可以的。
[0011]所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径可为10-20nm，孔深可为20_100nm。
[0012]上述方法中，可根据待标定`的DNA的特异位点人工合成合适的生物分子探针；根据特异位点的不同可选择一种或多种构型或序列的生物分子探针同时进行标定。
[0013]本发明中所述生物分子探针具体可为“人工设计合成的肽核酸(peptide nucleicacids PNA) ”或“去除剪切功能区域的限制性内切酶作为生物大分子”。
[0014]所述人工合成的肽核酸生物分子探针，首先根据需求设计探针序列，然后由PerSeptive Biosystems, Framingham, MA 制备合成，通过 RP-HPLC 进行纯化。
[0015]所述去除剪切功能区域的限制性内切酶可利用分子生物学技术获得，即将限制性内切酶的基因中与“剪切功能区域”对应的序列删除，再在细胞中经过翻译表达得到。
[0016]本发明对长链DNA分子上的特异性位点进行生物分子探针的修饰标定，然后让其穿过固体纳米孔，得到了与普通未修饰的DNA截然不同的二级电流信号(secondaryblockage),通过对二级电流信号的分析和统计，表征出DNA上被修饰过的特异性位点的空间位置和顺序，从而得到该长链DNA的物理图谱。
[0017]基于上述方法，本发明还提供了一种对DNA进行测序的方法。
[0018]该方法包括下述步骤:
[0019]I)采用本发明的方法对生物分子探针标定DNA的特异位点进行检测，得到了与普通未修饰的DNA截然不同的二级电流信号，通过对二级电流信号的分析和统计，表征出DNA上被修饰过的特异性位点的空间位置和顺序，从而得到所述DNA的物理图谱；
[0020]2)采用第二代高通量测序方法对所述DNA进行测序，将打碎的小片段上存在的特异序列与步骤I)中标定了空间位置和顺序的特异性位点进行比对，直接得出小片段在组合成长链DNA时的位置，经过拼装得到长链DNA的序列。
[0021]本发明充分挖掘和结合了固态纳米孔技术和第二代测序技术的特点，实现优势互补。通过固态纳米孔技术得到的DNA物理图谱恰好可以作为第二代测序技术中小片段序列拼接的指导，将小片段上存在的特异序列与标定了空间位置和先后顺序的特异性位点进行比对就可以直接得出小片段在组合成长链时的位置，从而大大减轻了数据分析的工作量和算法的难度。
[0022]在上述方法基础上，发明人进一步发明了利用多种生物分子探针对一条DNA长链进行标定和探测的技术，利用不同构型的生物分子探针在物理尺度和电学性质上的差异，得到了更加复杂且信息量更大的二级电流信号，提高了在长链DNA上的修饰标定密度，使不同的标定分子不至于混淆。同时建立了一个标定分子库，对于需要标定的特异性位点的序列和长度可以进行选择，以充分满足测序应用的需要。
[0023]本发明突破传统的基于固态纳米孔器件的DNA测序的方法，引入压强外场作为驱动DNA穿孔的驱动外场，加电场作为反向外场，在不降低测量信号信噪比的前提下，使用IOnm左右的SiN固态纳米孔，有效降低DNA分子穿过纳米孔器件的速度，可以将穿孔速度减慢一个数量级以上。显著提高了现有工作的时间分辨率，既可以保持高的电流信号信噪比，又可以避免引入由于使用很小的纳米孔(直径小于5nm)带来的DNA分子与纳米孔壁不可控的相互作用问题，并且实验简单易行，重复性和可控性都比现有技术有显著提高。但即使是这样，要直接实现对单碱基的分辨依然达不到。
[0024]发明人考虑在现有的技术条件下，结合固态纳米孔DNA穿孔速率快，读取长度较长(现在可以达到约IOOkbp的读长，理论上讲让一条染色体上的双链DNA连续通过在不久的将来也有望实现)的特点与现有第二代测序技术在小片段测序方面的高精度、高通量的优势，在小片段拼接算法方面给予现有测序技术以帮助，有望将人类全基因组的测序成本降低一个数量级(现有技术的成本大约是IOOk美元/人)，从而离实现我们的目标更进一
止 /J/ O
[0025]本发明相比于 现有对基于固态纳米孔对DNA分子探测的报道，集中的优势体现在:
[0026]1、现有技术在DNA分子穿孔探测的时间分辨率上距离单碱基的分辨依然遥遥无期，而本发明创造性地将不易做到的单碱基分辨转换成了对直径更大、因而也更易探测的标定分子的探测，从而间接实现了对DNA上的特异序列的分辨，在基于固态纳米孔对DNA分子进行探测领域是一个长足的进步。同时由于特异序列在DNA长链上的标识作用，本发明还具有很广阔的实用价值。
[0027]2、之前对DNA分子穿孔速率进行减速的研究普遍发现，由于分子布朗运动的存在，DNA分子穿孔速率越慢，布朗运动对其运动不确定度的影响也就越显著，因此虽然时间分辨率提高了，但是空间分辨率的不确定度却在增大。而本发明中虽然也使用了压强驱动DNA减速的技术，但是由于标定分子的二级电流信号特征明显易于探测，所以对DNA减速的幅度并不大，使得最后对事件的统计结果具有极好的精确度和可信度。
[0028]3、方法简单，易于操作。用于标定的肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探针最早报道于 1992 年(M.Egholm, P.E.Nielsen, et al.J.Am.Chem.Soc., 1992, 114(5), pp 1895-1897)，其合成制备手段成熟易行，而且获得的标定分子可以保留建立标定分子库，以满足不同的特异性位点的序列和长度对生物分子探针的需求。这种方法可重复性好，非常利于推广。不需要引入复杂的体系和制作工艺，对技术要求不高，实验成功率很闻，大大提闻了实验效率。
[0029]4、之前的研究和报道全部着眼于对DNA本身穿孔事件的研究，试图解决单碱基分辨的难题。而本发明充分利用了现有技术条件下成熟的技术手段，通过创造性的技术整合和优势互补，达到挖掘现有技术潜力的目的，也不失为一种很好的思路。



[0030]图1为本发明所用固态纳米孔的光刻掩模板的图形；其中，(a)为4英寸硅片设计的光刻掩模板图形，(b)对图1a的局部放大图，白色圆孔区对应的是每个芯片中的圆形透光区域。(c)对Ib的进一步放大图,可以清楚看到对应于每个芯片中对应的圆形透光区域。(d)为方便从4英寸大硅片上解理单个小芯片，而特殊设计的划片线，用白色虚线表示。
[0031]图2为纳米孔器件(3mm*3mm芯片)制作流程示意图；(a)甩胶，曝光，显影，去胶，出图形(b)反应离子束刻蚀刻透一面的氧化娃和氮化娃(C)去掉光刻胶(d) KOH溶液各向异性腐蚀掉硅，露出氧化硅和氮化硅悬空膜(e)用聚焦离子束在氧化硅刻出一个深度为
1.5 μ m的小窗格(f ) RCA反应将剩余0.5 μ m氧化硅层去掉，只暴露出2 μ mX 2 μ m小窗格大小，厚度为70nm的氮化硅悬空膜。
[0032]图3(a)离子电流测量与压强加载示意图；(b)泳池和电极加载装置图；(C)压强加载装置图；(d)压强显示 计。
[0033]图4为在IOkb长链DNA上利用人工合成的肽核酸(peptide nucleic acidsPNA)生物分子探针(识别位点为CTTCTTT)标定两个特异性位点，获得的二级电流信号(secondary blockage)图。
[0034]图5为在IOkb长链DNA(其序列上每间隔Ikb就有一个可以被分子标定的特异位点)上间距Ikb标定一个生物分子探针，对大量DNA穿孔事件的统计得到标定分子的相对位置分布图。
[0035]图6为在长度为48kb的λ -DNA上标定三种不同识别位点和分子构型的生物分子探针(特异性识别位点分别为CTTCTTT，CTAGAT，GCTTCAT)，获得的强度不同的二级电流信号图。

[0036]下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
[0037]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0038]实施例、
[0039]I)制备芯片器件
[0040]本步骤的目的是制备可以放入透射电子显微镜中进行操作的固态纳米孔器件，从而实现利用透射电子显微镜中高能会聚电子束对器件悬空薄膜进行打孔操作，从而实现纳米孔器件。这其中包括了一系列传统半导体加工工艺中涉及的微纳加工工艺，并且还涉及了一系列现代前沿的纳米尺度加工技术。
[0041]具体方法如下:首先，将(100)面4英寸硅片，两面分别先后生长2微米的氧化硅，用低压化学气相沉积方法沉积150到200纳米左右的低应力氮化硅。然后制作光刻掩模版，目的是要在4英寸的娃片上做成很多3mmX3mm的小基片周期分布(图1a),每个3mmX3mm小基片图形中心有一个直径为584 μ m的圆形透光区域(图lb，C)。为保证后期在4英寸硅片上分离每个3mmX3mm的小基片，保证分离划片时走刀的准确，又使得硅片不会破损成随机小片，在每个小基片图案边界加了一些透光的短划线:透光条的宽度为5 μ m，长度为20 μ m(图1d)。光刻掩模版的具体制作参数为:制版尺寸:5英寸；图形分布范围:Φ IOOmm圆形分布；晶向条:距离中心49mm,长50mm,宽0.8mm。然后利用光刻(图2a)和反应离子束刻蚀(图2b)将Si片一面的二氧化娃和氮化娃按照光刻掩模版的图形刻透,露出Si表面。随后去掉光刻胶(图2c)，使用KOH各向异性腐蚀，(40%K0H，80°C，6小时)腐蚀硅，腐蚀沿着(111)面进行。腐蚀穿的标准是:小窗格透光后再过腐蚀一段时间。光学显微镜下氧化硅面很平整，没有岛状结构。这样就实现了一面只有二氧化硅和氮化硅的小窗格(20~80μπι)悬空膜，下面有娃衬底作支撑(图2d)。接下来,为了从4英寸的大娃片上分离3mmX3mm小基片，需要进行划片操作。划片时需要在硅片背面贴上一层强力蓝胶做保护，因为在划片过后，撕开蓝胶时容易把悬空膜撕破，所以必须做好防护。办法是:用高温热融蜡把待划硅片和另一保护硅片用高温热融蜡粘在一起。然后把蓝胶粘在保护硅片的背面，放进划片机进行划片，划片深度为200到250微米左右。划片过后，把蓝胶撕下。把热融蜡粘在一起的硅片放在热板上加热，蜡融化，把硅片分开。上面的蜡用丙酮冲洗干净即可。这一步可以保证顺利解理得到大量3mmX3mm小基片。一般来讲，一张4英寸的硅片，可以解理得到800片3mmX3mm小基片。之后将3mmX3mm小基片放入热磷酸160°C加热减薄氮化娃膜厚度,减薄速率为f5nm每分钟，减薄到70纳米或其它需要的厚度，厚度可以通过椭偏仪监控。之后为了降低暴露在溶液中氮化硅膜的面积以减小电容噪声，并且降低氮化硅膜在溶液中破裂的可能，我们使用聚焦离子束(FIB，DB 235，FEI)刻蚀2微米氧化硅，离子束流300pA，大约刻蚀I分钟，可以在氮化娃下面形成一个I~2 μ mX I~2 μ mX 1.5 μ m的小窗格，1.5 μ m是深度。目前我们得到了还剩余500nm厚氧化娃，I~2 μ mX I~2 μ m的小窗格(图2e)。然后使用RCA反应，将剩余的500nm厚`氧化硅腐蚀掉，只剩下I~2μπιΧ1~2μπι小窗格大小，厚度为70nm的氮化硅悬空膜(图2f)。其中RCA反应为:NH3.H2O:H202=1:1:5 (v/v)，70° C加热10分钟，去除硅片上的有机污染，也为了下一步BOE腐蚀时更好的浸润；B0E(HF =NH4F:H2O=1:2:3)腐蚀6分钟(腐蚀速率为100nm/min)，可以把剩余的500nm氧化硅去除干净得到悬空的氮化硅膜；HC1 =H2O2 =H2O=1:1:5 (v/v/v)，，70° C，清洗10分钟，去除无机杂质。
[0042]2)透射电子显微镜进行纳米孔制作
[0043]芯片器件加工好之后,放入透射电子显微镜(FEI Tecnai F30)进行打孔操作，放大倍数调整到520k-890k，束斑大小为:1，电子束聚到最小或稍大，5分钟左右，即可得到直径IOnm左右、深度为60nm的纳米孔。打孔前后，样品杆要放在等离子体清洗仪中(O2:Ar=l: 3, v/v)里清洗一分钟，去除有机污染。纳米孔器件制作好后，储存在真空干燥箱里备用。
[0044]3)制备用于对DNA分子上的特异性位点进行修饰标定的生物分子探针[0045]肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探针是将核酸分子中带电荷的磷酸戊糖骨架置换成电中性、非手性、类似多肽骨架而得到的一种DNA类似物，其骨架由酰胺键连接的N(2-氨乙基)-甘氨酸单元重复组成，AGCT四种碱基与骨架之间以亚甲基羰基相连，可以通过碱基互补配对原理与DNA上的特异序列相互作用，而且具有特异性强，亲和性及稳定性好的特点。PNA最早报道于1992年(MEgholm，P.E.Nielsen, etal.J.Am.Chem.Soc., 1992, 114 (5), pp 1895 - 1897),随后 Egholm和 Nielsen 等人又合成出了具有不同构型和杂交模式的 PNA,例如 bis_PNA(M.Egholm, P.E.Nielsen, et al.NucleicAcid.Res.1995, 23 (2), 217 - 222.)和 pcPNA (P.E.Nielsen, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1999,96(21), 11804 - 11808.)等。目前商业化的PNA探针合成手段已经非常成熟。
[0046]本发明所使用的肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探针,首先根据需要设计特异序列并选择合适的构型(PNA单体、bis-PNA或pcPNA等),然后由PerSeptiveBiosystems, Framingham, MA制备合成,通过RP-HPLC (高效液相色谱)进行纯化,其浓度可以用紫外分光光度计在UV260nm处定量。制备得到的具有不同序列、构型和杂交模式的PNA分子探针用于4)和5)的后续实验。
[0047]4)单分子标定DNA穿过固态纳米孔的探测
[0048]我们通过一系列浸润过程用PDMS垫片将芯片封装入由PEEK制成的电泳池中，泳池由Cis腔和Trans腔构成，两个腔之间只通过纳米孔进行连接，无其他连接通道(图3a)。然后向两个腔中注入浓度为1.6摩尔每升的氯化钾溶液。溶液中含有ImM的EDTA和IOmM的Tris (pH=8)。我们使用两个Ag/AgCl电极分别插入Cis腔和Trans腔中(图3a)。
[0049]我们将预先制备好的单种PNA生物分子探针溶液(识别位点为CTTCTTT)与IOkb的长链DNA溶液混合，调节混合溶液的pH = 8，其中长链DNA的序列已知(见图4)，上面有两个可被选定的分子标定特异性结合的位点。混合溶液放在热台上水浴30min,温度设定为.37°C，以提高特异性结合的效率(限制性内切酶的活性在37°C时最佳)。
[0050]然后向Cis腔注入混合水浴后的DNA溶液，在从Cis到Trans的方向引入压强外场。具体做法:在与Cis腔相连的导管上连接于气瓶相连的导管，使得气瓶产生的压强可以被引入到Cis腔中(图3b，C)。引入压强的示数通过气压计显示(图3d)。通过调节气瓶上的压强真空计，就可以调节被引入到Cis腔中的压强大小。这样我们就实现了 Cis到Trans方向的压强外场驱动。然后我们再从反向加载IOOmV电压(图3a)，这样可以利用膜片钳放大器系统给出离子电流测量信号。由于DNA和其上的分子标定在溶液中带负电，反向电压的施加起到减速DNA，提高时间分辨率的作用。未经标定的DNA分子通过固态纳米孔时由于占据了孔内的离子通道，因此使得离子电流信号产生了一个降低(blockage)，而当有标定的DNA分子从孔内穿过时，生物分子探针和DNA特异性结合的区域会产生构象改变，因此对离子通道的堵塞作用更加显著，从而在电流信号降低的情况下进一步产生一个新的降低信号(secondary blockage)(见图4),成为表征DNA上具有某些特异性序列的有力证据。通过对大量DNA穿孔事件的信号数据进行统计分析，我们精确地确定了两个特异性序列位点之间的空间距离，与已知序列的比对证明本发明的实验方法精确度很高。
[0051]在以上实验的基础上，发明人设计合成了另一种长度为IOkb的DNA双链分子，在其序列上每间隔Ikb就有一个可以被分子标定的特异位点(特异性识别位点为CTTCTTT)，即一条链上总共有9个可标定位点。最后我们经过大量的穿孔事件统计分析，得到了这9个标定位点的相对距离(见图5)，实验结果与我们的模拟和预期非常吻合，同时我们还发现:作为标定的生物分子探针与DNA的亲和性及特异性很好，超过90%的穿孔事件都有且仅有9个二级电流信号，说明这些穿孔的DNA上有且仅有9个结合的标定分子。这表明利用本发明的方法对现有测序手段实现改进的想法不仅可行，而且非常可靠。
[0052]5)混合分子标定DNA穿过固态纳米孔的探测
[0053]购买商业化的λ-DNA分子溶液(长度为48kb)，根据已知的序列从我们建立的标定分子库中选择了三种不同的标定分子(特异性识别位点分别为CTTCTTT，CTAGAT，GCTTCAT)，它们的特异性识别位点长度分别为7bp、6bp和7bp，这些特异性位点在48kb的序列上相隔排列，同时三种标定分子与DNA结合后产生的构象改变各不相同。我们将三种标定分子与λ -DNA分子混合，37°C水浴30min后注入电泳池的Cis腔，在压强驱动反向电场减速的条件下测量离子电流信号，结果得到了三种强度的二级电流信号(见图6)，分别对应三种不同的标定分子，从而对应地获得了三种特异性位点在λ -DNA链上的排列顺序和空间距离。这一实验一方面是对分子标定DNA探测技术的稳定性和精确性进行进一步的验证，另一方面也更加符合现有测序技术对小片段拼接方面的要求，因为所需拼接的小片段上很有可能带有不同的特异序 列，需要我们在长链DNA上做不同的标定。