一种电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料及其应用的制作方法[0002]人体组织的损伤修复与重建是现代医学力求解决的难题。骨是人体重要的组织器官，虽然具有再生和自修复能力，但对于由肿瘤、外伤、骨疾及骨异常生长所造成的骨缺损，在单纯依靠骨的自修复无法愈合的情况下，则需采用外科手术治疗。骨修复材料的研究与开发是生物材料研究中一个非常活跃的领域。近年来，在骨修复材料领域，可任意塑形并能够在体液条件下快速自固化的磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是目前研究较多并被认为是很有发展前途的一种生物活性骨水泥材料。[0003]CPC固化后产物的化学成分与骨组织的无机成分相似，晶相结构与骨组织相近，可根据缺损部位任意塑形，操作简便，克服了使用粉料和颗粒料成型困难、力学性能差、易于流失等问题，这些特点在很大程度上符合临床骨缺损修复的要求，从而具有广泛的研究意义。尽管CPC具有其它材料无法媲美的优点，但是它在力学性能方面还存在着较大的缺陷，它脆性大，强度低，耐压及抗弯强度仅与松质骨相当，限制了其临床应用。如何提高CPC的力学性能，研究者们发明了各种方法，其中由于纤维具有优良的机械性能，因此被广泛应用于骨水泥增强领域来改善材料的强韧性。[0004]根据材料的复合原理，在CPC与纤维复合制成的增强CPC体系中，纤维承受大部分载荷，在基体和纤维之间起到桥梁的作用，并且当基体在纤维与基体界面产生断裂时，纤维可以阻止裂纹扩展或使断裂发生偏转，从而调整界面应力，提高材料的机械性能。关于添加纤维的种类，主要依据骨骼的构成成分及仿生学概念出发来考虑。综合来讲，对于最终应用于临床骨缺损修复手术的CPC复合支架而言，要求添加的纤维最好是生物相容性良好的且可降解吸收的材料。可吸收纤维材料可在骨水泥复合材料植入体内初期发挥稳定和增强的作用，随着纤维的逐步降解并吸收，其遗留下来的孔道可以为细胞提供赖以生存的三维空间，有利于细胞黏附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢产物排出，同时还有利于血管和神经长入。即可吸收纤维在骨水泥的制备和应用中起到了“初期增强，后期致孔”的双重作用。[0005]近年来，静电纺丝技术作为一种纳米纤维支架的仿生构建方法，已在组织工程和再生医学领域中得到越来越多的应用和关注。静电纺丝是一种高效低耗的纤维制备技术，能够连续制备纳米及或亚微米级超细纤维，在尺寸和形貌上对细胞外基质(ECM)有较好的仿生。电纺的原理是在装有聚合物溶液的腔体喷头和接收装置之间施加高压静电，使溶液在高压静电场作用下产生与表面张力相反的电场力，驱使溶液在毛细管末端拉伸成一个泰勒堆，当电场力足够大时，聚合物液滴可克服表面张力形成喷射细流，形成纳米级电纺纤维。将电纺纤维作为增强相引入CPC的制备中，可大大提高CPC的力学性能，为拓宽CPC在临床上的应用奠定基础。[0006]虽然电纺纤维的添加一定程度上提高了 CPC的力学性能，但目前的电纺纤维增强磷酸钙骨水泥产品中，抗压强度依然不足，同时其制备工艺也比较复杂。
[0007]本发明的发明目的是克服现有技术的不足，提供一种电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料。所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料通过特别的制备方法制备得到，其颗粒间结合强度更高，因此具有更好的抗压强度。[0008]本发明的另一发明目的是公开一种电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料的制备方法。
[0009]本发明的另一发明目的是公开电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料在制备骨修复材料中的应用。
[0010]本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现:
一种电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料，由电纺纤维、壳聚糖溶液、固体磷酸盐混合物混合组成，
所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料通过如下方法制备得到:
51.制备电纺纤维原料溶液，所述电纺纤维原料溶液由聚己内酯与聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物混合组成；
52.制备壳聚糖溶液， 使所述壳聚糖溶液中，壳聚糖的质量分数为1~5%，柠檬酸的质量分数为5~25%，葡萄糖的质量分数为5~20% ；
53.将步骤SI中所述的电纺纤维原料溶液采用静电纺丝技术直接纺入步骤S2的壳聚糖溶液中，得到纤维/液相混合物；所用的电纺纤维原料溶液与壳聚糖溶液的体积比为1~10: 100 ；
54.将固体磷酸盐混合物与纤维/液相混合物按固液比0.5、.Sg:1ml混合调配，gp得所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料；
所述固体磷酸盐混合物为磷酸四钙和磷酸氢钙的混合物。
[0011]本发明中，将电纺纤维直接纺入含有壳聚糖、柠檬酸和葡萄糖的混合溶液中，然后与磷酸盐混合得到的电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料，其粘弹性、可塑性明显改善，颗粒间的结合强度也得到提高，因而所得的复合材料具有更佳的抗压性能，并且可以采用注射器注入骨缺损部位，适用于微创手术，病患承受的痛苦较小。
[0012]聚己内酯(polycaprolactone,简称PCL)是一种半结晶型聚合物,是化学合成的生物降解型高分子材料，其结构重复单元上有5个非极性亚甲基和一个极性酯基，这样的结构使得PCL具有很好的柔韧性和加工性。因为分子结构中引入了酯基结构，而酯基结构易被微生物或酶分解，最终产物为CO2和!120。PCL结晶性较强，降解缓慢。它在体内的降解分两个阶段进行:第一阶段表现为分子量不断下降，但不发生形变和失重；第二阶段是指分子量降低到一定数值后，材料开始失重，并逐渐被肌体吸收排泄。由于PCL能够生物降解，有着良好的加工性能和生物相容性，以及良好的塑性,是一种理想的植入材料,主要应用于微胶囊药物制剂，具有降低药物毒副作用、防止药物失活、减少服药次数以及靶向给药的效果。此外还用于可控释药物载体、细胞、组织培养基架等方面。
[0013]聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),简称 PLGA)由两种单体一乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收进美国药典。破坏酯键会导致PLGA的降解，降解程度随单体比不同而有差异，当两种单体比为50:50时，降解速度较快，为2周至4周左右。PLGA的降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人代谢途径的副产物，所以应用在医药和生物材料中不会有毒副作用，已广泛应用于生物医学领域中，如皮肤移植、伤口缝合、体内植入、微纳米粒等。
[0014]壳聚糖(chitosan)具有优良的生物相容性,能够止血、抗感染,在体内能够被溶菌酶等多种特异性或非特异性酶降解为氨基葡萄糖而被吸收，将其添加到磷酸钙骨水泥中，可以提高骨水泥的粘弹性，增加其可塑性。从理论上讲，CPC水合过程中以及水合后的产物羟基磷灰石(HA)呈碱性；壳聚糖溶解于弱的有机酸溶液内，其代谢产物也呈酸性。两者可能正好中和从而减轻因为非生理性PH值所引发的不良反应，而且壳聚糖表面为亲水基团，可以有利于吸附血清或者体液内的细胞外基质蛋白，从而促进细胞粘附及增殖。
[0015]柠檬酸(citric acid)是一种无色透明的晶体酸，骨的矿物相中即含有柠檬酸根离子，在骨磷灰石的形成和/或溶解过程中扮演着重要角色。柠檬酸根离子中含三个羧酸根基团，羧酸根基团中的氧原子能提供孤对电子，而钙离子具有未填满外层电子的空轨道，因此柠檬酸中的羧酸根基团与磷酸钙盐表面的钙离子可形成配位键。由于柠檬酸中含三个羧酸根基团，因此它可以通过配位键使颗粒之间产生桥连作用，提高颗粒间的结合强度，从而使CPC材料的抗压强度提高。
[0016]葡萄糖(glucose)是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质,其氧化反应放出的热量是人体生命活动所需能量的重要来源。在食品、医药上可直接使用。由于葡萄糖分子中含有醛基，因此容易和壳聚糖分子中的氨基反应生成西佛碱(Schiff ’s bases)，溶液中的酸性环境利于该西佛碱反应 的发生。
[0017]SI中，聚己内酯与聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物的混合比例可以参照现有技术，根据填充部位以及承重要求的不同，可调节其配比。优选地，Si中，聚己内酯与聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物的混合比例为质量比f 4:1。
[0018]固体磷酸盐混合物的配方，可以参考本领域技术人员常用的配方，优选地，所述固体磷酸盐混合物为磷酸四钙和磷酸氢钙按摩尔比1:1混合的混合物。在此配方下，得到的磷酸钙骨水泥固化性能更好。
[0019]所述壳聚糖溶液通过按比例选取壳聚糖、柠檬酸、葡萄糖混合，搅拌溶于水中制得。
[0020]优选地，所述电纺纤维原料中还含有占电纺纤维原料质量1%~10%的聚乳酸。聚乳酸也是一种生物可降解材料，在临床上可用作手术缝合线、骨钉和骨板等。聚乳酸可以是外消旋聚乳酸、左旋聚乳酸或右旋聚乳酸中任意一种。
[0021]优选地，所述电纺纤维原料中还含有占电纺纤维原料质量5%~20%的胶原。因为天然骨的主要成分是羟基磷灰石和胶原。磷酸钙骨水泥的最终固化产物是羟基磷灰石，而胶原的加入使骨水泥更加贴近人体天然骨成分。
[0022]优选地，所述固体磷酸盐混合物中还含有占固体磷酸盐混合物质量2%~20%的羟基磷灰石。[0023]优选地，所述固体磷酸盐混合物中还含有占固体磷酸盐混合物质量2%~5%的β-磷酸三钙。
[0024]优选地，所述固体磷酸盐混合物中还含有占固体磷酸盐混合物质量1%~5%的药物。
[0025]优选地，所述药物为消炎痛、阿司匹林或胰岛素中的一种或几种。
[0026]优选地，所述壳聚糖溶液中还含有占其质量10%~20%的丙烯酰胺和f 2%聚丙烯酸按(ammonium polyacrylate)。
[0027]优选地，所述壳聚糖溶液中还含有占其质量1%~2%的羟丙基甲基纤维素。
[0028]所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料在骨修复中的应用，将IOng~20ngβ -重组人转化生长因子β -rhTGF，载入60mg所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料后，植入骨缺损部位。
[0029]一种所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料的制备方法，包括以下步骤:
51.制备电纺纤维原料溶液，所述电纺纤维原料溶液由聚己内酯与聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物的混合组成；
52.制备壳聚糖溶液，使所述壳聚糖溶液中，壳聚糖的质量分数为1-5%，柠檬酸的质量分数为5~25%，葡萄糖的质量分数为5~20% ；
53.将步骤SI中所述的电纺纤维原料溶液采用静电纺丝技术直接纺入步骤S2的壳聚糖溶液中，得到纤维/液相混合物；所用的电纺纤维原料溶液与壳聚糖溶液的体积比为1-10: 100 ；
54.将固体磷酸盐混合物与纤维/液相混合物按固液比0.5、.Sg:1ml混合调配，gp得所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料；
所述固体磷酸盐混合物为磷酸四钙和磷酸氢钙的混合物。
[0030]优选地，一种所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料的制备方法，包括以下步骤:
51.分别制备质量体积比均为4%~18%的聚己内酯溶液和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物溶液，按聚己内酯和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物的质量比为1~4:1混合，得到聚己内酯溶液和聚(乳酸-羟基乙酸)混合液；
52.制备壳聚糖溶液，使所述壳聚糖溶液中，壳聚糖的质量分数为1-5%，柠檬酸的质量分数为5~25%，葡萄糖的质量分数为5~20% ；
53.将SI中所述的聚己内酯和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物混合液装入注射器针筒中，与静电纺丝机的高压电源正极相连；将装有S2中所述的壳聚糖溶液与高压电源的负极相连，作为纺丝液的接收装置；将聚己内酯和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物混合纤维纺入到壳聚糖溶液中，所述聚己内酯和聚(乳酸-羟基乙酸)混合液与壳聚糖溶液的体积比为广10:100，混合得到纤维/液相混合物；
54.将磷酸四钙与磷酸氢钙按照等摩尔比混合，得到磷酸钙骨水泥固相成分；
55.将S4所述的磷酸钙骨水泥固相成分与S3所述的纤维/液相成分按固液比0.5~
0.Sg:1ml调和均匀，得到电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料。
[0031]优选地，S3.中，电纺电压为l~30kV，电纺聚合物溶液流速为0.5~10mL/h，喷丝口与壳聚糖溶液液面的距离为l(Tl5cm。[0032]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明将可生物降解的PCL-PLGA电纺纤维混入CPC中，可起到“初期增强，后期致孔”的双重作用，符合组织工程和仿生学的设计理念；
壳聚糖是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，脱乙酰基程度(D.D)决定了大分子链上胺基(NH2)含量的多少，而且D.D增加，由于胺基质子化而使壳聚糖在稀酸溶液中带电基团增多，从而壳聚糖的稀酸溶液是带电的。利用此特性，本发明将金属线直接插进壳聚糖溶液中，然后与高压电源的负极相连，作为静电纺丝的接收端。从而摒弃了传统需用磷酸盐缓冲液(PBS)作为溶剂或接收端的传统做法，保证了磷酸钙骨水泥液相配方的纯正，也使得制备工艺简单可控；另外，壳聚糖和柠檬酸的加入提高了颗粒间结合强度，从而提高材料的抗压性倉泛。[0033]本发明制备的电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料主要用于骨缺损和骨组织工程支架材料，也可作为齿科修复材料。其具有更好的可塑性，使用时，可将调制好的浆料，直接用注射器注入骨缺损部位，也可将浆料注入模具中固化成型后，再植入骨缺损部位。

[0034]下面结合具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明实施例中采用的原料和方法为本领域常规市购的原料和常规使用的方法。
[0035]实施例1
51.分别制备质量体积比为8%的聚己内酯(PCL)和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)溶液，按PCL: PLGA质量比=1:1的比例混合，制备PCL-PLGA混合液；
52.按质量比壳聚糖:柠檬酸:葡萄糖:蒸馏水=2: 20: 7: 71混合，搅拌溶解制得壳聚糖溶液；
53.将步骤S1.制得的PCL-PLGA混合液装入注射器针筒中，与静电纺丝机的高压电源正极相连。将装有步骤S2.制得的壳聚糖溶液与高压电源的负极相连，作为纺丝液的接收装置。电纺电压为15kV，电纺聚合物溶液流速为0.6ml/h，喷丝口与壳聚糖溶液液面的距离为12cm，直接将PCL-PLGA纤维纺入步骤S2的壳聚糖溶液中，得到纤维/液相混合物，其体积比为PCL-PLGA:壳聚糖溶液=10: 100 ；
54.将磷酸四钙与磷酸氢钙按照等摩尔比混合，制备固体磷酸盐混合物；
55.将步骤S4.配制的固体磷酸盐混合物与步骤S3.配制的纤维/液相混合物按固液比0.5g:1ml调和均匀，制得电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料；
将步骤S5.所制得的磷酸钙骨水泥复合浆料直接用注射器注入骨缺损部位。
[0036]参照实施例1的制备工艺，按照表1内容，改变其中比例，制备实施例10-14的电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料。
[0037]表1实施例10-14的配方(表中除非特别说明，均为质量比)