专利名称：一种利用芽孢杆菌制备纤维素酶的方法多年来，生物转化纤维素质成为有用产物一直是生物技术的重要研究领域，但在天然条件下能直接分解利用纤维素作碳源的微生物却很少，尤其在中性条件下能分解纤维质原料的菌类，更是少有。 目前关于纤维素酶方面研究和生产的报导，大都是关于酸性条件下能分解纤维素质原料的菌类，在中性条件下的几乎还是一片空白。中性纤维素酶市场远景非常的好。我国是一个纺织大国，每年需要纺织用纤维素酶5万余吨，目前中性纤维素酶主要靠进口，亟需开发成本合理、易于操作的中性纤维素酶制备方法。就生产及应用方面来说，目前国内酸性纤维素酶已经有一部分厂家正在生产，并在纺织用水洗酶上占有很大的市场，但是酸性酶并不是很适合水洗。一是与它的复合酶系组成有关，其中有效酶组分比例太小，二是在酸性条件下水洗时反污染情况相当严重，而中性纤维素酶就正好解决了上述的问题。中性酶可在PH值6-8的条件下使用。这个特定的PH值范围不会损坏织物的强力。表面活性剂在这个pH值范围是最有效的，从而节约了纺织品加工过程中的表面活性剂的使用。目前在纺织水洗酶市场上中性纤维素酶非常走俏，价格也很高，酸性水洗酶很难与其竞争，将来的发展趋势必是中性酶，现在主要靠从国外进□。近几年，碱性纤维素酶在洗涤剂工业上的成功应用，改变了传统的去污方法，建立了一套新的去污机制，提高了洗涤效果，并有柔软、增艳等作用，被洗涤剂工业称之为一次技术革命；在日本和丹麦它已作为洗涤剂的添加剂而被广泛使用。碱性纤维素酶可提高洗涤效果，碱性纤维素酶的去污机理人们很早就知道。但国内生产碱性纤维素酶方面仍存在空白。
本发明针对现有技术的不足，研究出一种高活性纤维素酶的生产工艺，填补了这方面的空白。本发明的另一目的是提供用该方法制备所得的纤维素酶。实现本发明上述目的的技术方案为一种利用芽孢杆菌生产纤维素酶的方法，包括步骤以芽孢杆菌为生产菌株，经过斜面培养、振荡培养、发酵培养而得，其中发酵培养的培养基包括质量含量的淀粉0. 5-2%、豆饼粉I 5%、豆饼粉水解液8-12%、麸皮0. 3 0. 8%、无机盐1-2%、消泡剂0-0. 3%和70-90%的水。所述芽抱杆菌优选(BacillusCohn)DM_32。一种芽孢杆菌(Bacillus Cohn) DM-32，保藏编号为CGMCC No. 6211。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，电话(010)64807355。保藏日期2012年6月8日。所述芽孢杆菌系发明人从土壤中分离筛选后经诱变得到的。该菌株具有如下特性DM-32菌株既可以在酵母膏、葡萄糖合成培养基上生长，也可以在麸皮、豆饼粉、豆饼粉水解液组成的粗培养基上生长，其主要代谢产物为纤维素酶。生长PH值范围为5. 5^10. 0，生长温度范围为25 42°C。DM-32菌体细胞杆状，末端方，成短或长链。产芽孢，芽孢椭圆形或柱形，中生或近中生。好氧型，革兰氏阳性。DM-32在细菌培养基平板(牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调pH7. 8-8. 2)上的菌落特征是形态为圆形，表面光滑有光泽，边缘整齐浅乳白色，扁平，生长迅速，该菌株鉴定为Bacillus sp.，并命名为Bacillus Cohn0其中，所述斜面培养的培养基包括质量含量的淀粉0. 3-0. 8%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、无机盐I. 5-1. 8%、羧甲基纤维素钠0. 4-0. 6%和90-95%的水。 其中，所述斜面培养的温度为35_37°C，培养的时间为3-4天。其中，所述振荡培养的培养基包括质量含量的淀粉0. 4-0. 6%、蛋白胨0. 8-1. 2%、酵母粉0. 8-1. 2%、麸皮0. 3-0. 8%、无机盐1-2%和90-95%的水。其中，所述振荡培养的温度为35_37°C，培养时间24-48小时，振荡培养的装置转速为 120-200r/min。其中，所述淀粉为玉米淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉中的一种或一种以上。其中，所述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、碳酸钠、硫酸钠中的一种或一种以上。其中，所述豆饼粉水解液是按照质量比例，将10-18%的豆饼粉与0. 5-1. 5%的氧化钙或氢氧化钙、余量的水混合，在温度110-130°C下处理0. 5-2小时获得的。其中，所述发酵培养的接种量为0. 1-15%，培养的温度为33-37 °C，通风量为0-0. 8vvm (通入空气体积/发酵液体积/min)，培养时间为24-120小时，发酵的压力为0.02-0. 07MPa。本发明提出的方法制得的纤维素酶。本发明所述的纤维素酶在纺织品加工中的应用。本发明的有益效果为①本发明提出的方法得到的是在pH中性及碱性条件下均适用的纤维素酶，而国内现在一般生产的都是酸性条件下适用的纤维素酶，中性及碱性纤维素酶在水洗酶应用方面明显优于酸性纤维素酶。②使用的菌种为芽孢杆菌，和目前国内一般采用木霉菌作为纤维素酶生产菌种不同。该方法所使用的芽孢杆菌是一种易于保存、扩增、繁殖快、适合大规模生产的菌种，可以缩短生产周期。③采用的产酶培养基和一般常规的产酶培养基不同。一般产纤维素酶的培养基中都要有纤维类原料碳源作为产酶诱导底物。纤维类原料成本昂贵，而且在投料、物料消毒、大规模生产等方面使用起来都有诸多不便。而该方法采用淀粉类原料作为碳源，成本低，而且在运输、投料、消毒等方面都优于纤维类原料。④培养基中添加豆饼粉水解液作为可溶性氮源，成本低、制作及使用方便、氮利用率高。一般生产纤维素酶培养基用蛋白胨或玉米浆作为可溶性氮源，成本很高。⑤该方法所制备的纤维素酶成本低、活力高、对pH适用范围广稳定性好、生产周期短。I.0%氯化钠0. 5%磷酸氢二钾0. 1%，CMC (羧甲基纤维素钠)0. 5%，碳酸钠1%，琼脂2. 0% ;其余为水。2、振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种用接种环挑两环接入三角瓶的种子培养基中，置摇床上振荡培养36小时，培养温度36°C，摇床转速为150r/min。种子培养基中各成分的质量百分比为可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉I. 0%麸皮0. 5%氯化钠0. 5%磷酸氢二钾0. 1%碳酸钠1% ;其余为水。3、然后再在装液量为IOOml的500ml三角瓶中用芽孢杆菌做菌种发酵生产中性纤维素酶，接种量为0. 1%体积比，发酵温度0-72小时为35-37°C，72-120小时为33_35°C，摇床转速为180-200r/min。其中发酵培养基中各成分的质量百分比为玉米淀粉1%豆饼粉2%豆饼粉水解液10%麸皮0. 5%氯化钠0. 5%，磷酸氢二钾0. 1%碳酸钠1%，其余为水。4、其中，豆饼粉水解液为豆饼粉在碱性条件下经高温蒸煮后获得，其组分为豆饼粉14%，石灰1%, 7jC 85%，处理条件为120-122。。，I小时。5、酶活力测定测定结果表明，pH6. (T9. 0时，该纤维素酶活力最高，9.0时为459. 2u/ml, pH值6. 0时为382. 5u/ml。pH为5. 0和10. 0时，其活力下降至最高值的80%。PH为4. 0时，活力下降至最高值的50%。实验结果表明，本发明制备得到的纤维素酶在中性和碱性条件下均有很高活力。实施例2 IOL发酵罐制备纤维素酶I、斜面培养在无菌操作条件下，将芽孢杆菌(Bacillus Cohn，保藏编号CGMCCNo. 6211)菌株用接种环挑一环接入试管斜面培养基中，37°C培养3天；斜面培养基中各成分的质量百分比为可溶性淀粉0. 3%、蛋白胨0. 8%、酵母粉0. 8%、氯化钠0. 4%、磷酸氢二钾0.1%、CMC0. 5%、碳酸钠1%、琼脂2. 0%，其余为水。2、振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种用接种环挑两环接入三角瓶的种子培养基中，置摇床上振荡培养36小时，培养温度36°C，摇床转速为150r/min。种子培养基中各成分的质量百分比为可溶性淀粉0. 4%、蛋白胨I. 0%、酵母粉0. 8%、麸皮0. 5%、氯化钠0. 4%、磷酸氢二钾0. 1%、碳酸钠0. 6%，其余为水。3、然后在装料量为6L的IOL不锈钢标准发酵罐中用芽孢杆菌做菌种发酵生产纤维素酶，接种量为I. 5%体积比，发酵温度在0-72小时之内为35-37°C，然后在72-120小时为33-35°C，搅拌转速为200r/min，通风为0. 7vvm,罐压为0. 05MPa。其中发酵培养基中各成分的质量百分比为玉米淀粉0. 5%、豆饼粉5%、豆饼粉水解液8%、麸皮0. 3%、氯化钠0. 5%、磷酸氢二钾0. 1%、碳酸钠I. 2%、泡敌0. 01%，其余为水。发酵每4小时取样测定各种指标。4、其中，豆饼粉水解液为豆饼粉在碱性条件下经高温蒸煮后获得，其组分为豆饼粉14%，石灰1%，水85%，处理条件为120°C，蒸煮I小时。 5、酶活力测定结果表明，pH6. 5时，该纤维素酶活力为402. Iufml0 pH8. 5时，该纤维素酶活力为446. 2u/ml。pH6. 0 9. 0时,该纤维素酶活力最高。实施例3 30m3发酵罐制备纤维素酶I、斜面培养在无菌操作条件下，将芽孢杆菌(Bacillus Cohn,保藏编号CGMCCNo. 6211)菌株用接种环挑一环接入试管斜面培养基中，35-37°C培养3_4天；斜面培养基中各成分的质量百分比为可溶性淀粉0. 8%、蛋白胨I. 2%、酵母粉I. 2%、氯化钠0. 6%、磷酸氢二钾0. 2%、CMC0. 6%、碳酸钠I. 2%、琼脂2. 0%，其余为水。2、振荡培养在无菌条件下，将斜面菌种用接种环挑两环接入三角瓶的种子培养基中，置摇床上振荡培养36小时，培养温度37°C，摇床转速为150r/min。种子培养基中各成分的质量百分比为可溶性淀粉0. 6%、蛋白胨I. 2%、酵母粉I. 2%、麸皮0. 8%、氯化钠0. 3%、磷酸氢二钾0. 1%、碳酸钠0. 6%，其余为水。3、种子罐扩培3m3种子罐，装液量为I. 8m3,接种量为0. 2%，培养温度35_37°C，通风量为0. 5vvm，搅拌转速180r/min，培养周期24小时。培养基中各成分的质量百分比为可溶性淀粉0. 5%蛋白胨I. 0%酵母粉I. 0%麸皮0. 5%氯化钠0. 5%磷酸二氢钾0. 1%碳酸钠1%;其余为水。4、然后在装液量为ISm3的30m3不锈钢标准发酵罐中用芽孢杆菌发酵生产纤维素酶，接种量为10%体积比，发酵温度为0-72小时为36°C，72-120小时为35°C，搅拌转速为150r/min，通风为0. 8vvm，罐压为0. 07MPa。其中发酵培养基中各成分的质量百分比为甘薯淀粉1%、豆饼粉2%、豆饼粉水解液10%、麸皮0. 5%、氯化钠0. 5%、磷酸氢二钾0. 1%、碳酸钠1%、泡敌0.01%，其余为水。发酵每4小时取样测定各种指标。发酵结束后，经过压滤浓缩得到纤维素酶成品。其中，豆饼粉水解液为豆饼粉在碱性条件下经高温蒸煮后获得，其组分为豆饼粉14%，氢氧化钙1%，水85%，处理条件为122°C，蒸煮I小时。5、酶活力测定结果表明，pH6. 5时，该纤维素酶活力为394. 5u/ml,pH8. 5时，该纤维素酶活力为436. lu/mlo pH6. 0 9. 0时,该纤维素酶活力最高。


本发明提供一种利用芽孢杆菌生产纤维素酶的方法，其包括步骤以芽孢杆菌为生产菌株，经过斜面培养、振荡培养、发酵培养而得，其中发酵培养的培养基包括质量含量的淀粉0.5-2%、豆饼粉1-5%、豆饼粉水解液8-12%、麸皮0.3-0.8%、无机盐1-2%、消泡剂0-0.3%。本方法得到的是在pH中性及碱性条件下高活性的纤维素酶，在水洗酶应用方面明显优于酸性纤维素酶，本发明的方法采用淀粉类原料作为碳源，其在运输、投料、消毒等方面都优于纤维类原料；以豆饼粉水解液作为可溶性氮源，成本低、制作及使用方便。本发明的方法所制备的纤维素酶成本低、活力高、对pH适用范围宽稳定性好、生产周期短。