一株高产纤维素酶菌株及发酵产中性纤维素酶的方法【技术领域】[0001]本发明利用一株高产纤维素酶的菌株(Trichodema reesei QZ-5)及利用该菌株经种子培养和以玉米浆、硫酸铵等为氮源、以葡萄糖、麸皮等为碳源发酵生产中性纤维素酶的方法，所制备的酶能被应用于纺织、造纸、饲料、食品等领域，属于生物[0002]纤维素酶是一类能够降解纤维素成葡萄糖的多组分复合酶系，可广泛应用于能源、纺织、造纸、饲料、食品等领域，近年来，随着全球资源能源短缺问题日显突出，纤维素酶是将自然界中分布最广、含量最多、最为廉价的纤维素作为再生资源的主要酶系，从而使生产制备纤维素酶的研究成了全球科研工作者更关注的课题。[0003]纤维素酶广泛分布于真菌、植物、动物、细菌和昆虫中。但用于生产纤维素酶的主要是木酶属的里氏木酶菌。里氏木酶产生的纤维素酶包括内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)和β —葡萄糖苷酶(CB)，依据应用条件，可分为酸性纤维素酶、中性纤维素酶、碱性纤维素酶。[0004]我国中性纤维素酶年需求量约4万吨(10000IU/g)，重点应用于纺织、食品、饲料、造纸等领域，目前基本依赖进口。尽管我国已成为继美国、日本、丹麦之后世界上第4个能生产纤维素酶的国家，但目前我国中性纤维素酶生产技术相对发达国家还比较落后，酶活力低、成本高、规模小，其根源是没有筛选到产酶活高的野生菌种或基因改造工程菌技术尚处于发展阶段。
[0005]本发明筛选并提供了一株高`产纤维素酶的野生菌株(Trichodema reesei QZ-5)及利用该菌株经种子培养和以玉米浆、硫酸铵等为氮源、以葡萄糖、麸皮等为碳源发酵生产中性纤维素酶的方法，所制备的酶能被应用于纺织、造纸、饲料、食品等领域，来替代价格昂贵的进口中性纤维素酶。[0006]本发明的技术方案:一种高产纤维素酶的木酶属菌株，其命名为Trichodemareesei QZ-5，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012204,保藏日期2012年6月5日。[0007]用该菌为出发菌种，经种子培养和以玉米浆、硫酸铵等为氮源、以葡萄糖、麸皮等为碳源发酵生产中性纤维素酶；工艺为:
[0008](I)种子培养
[0009]种子培养基:葡萄糖15g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨3g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, 115°C灭菌待用。
[0010]接种工艺:取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30°C培养7天，取一平板用IOml无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液.取Iml孢子悬液接入250ml规格的三角瓶，装液量为50ml。[0011]培养条件:转速200rpm，温度30度，恒温培养2天，即为发酵罐发酵产酶的种子。
[0012]⑵产酶培养
[0013]产酶培养基:玉米浆30g/L、麸皮10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏0.5g/L，蛋白胨3g/L，硫酸铵 2g/L，磷酸二氢钾 3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, FeSO4.7Η200.005g/L,MnSO4.H2O0.016g/L, ZnSO4.7Η200.0014g/L, CoCl20.002g/L,吐温-800.2g/L, 115°C灭菌待用。
[0014]发酵罐:规格为容量7L.实际发酵装液量为5L.[0015]发酵参数:转速200r/min.温度30度.通气量1.4L/min/L.发酵时间150小时。
[0016]根据上述条件，按10%接种量在7L发酵罐中进行发酵，发酵液的中性纤维素酶活力最高达5000U/L以上。
[0017]本发明从津市市保河堤食用菌培植基地腐烂土样、腐质稻草、平菇栽培染菌料等采集的样品中筛选出一株高产中性纤维素酶的野生木酶属里氏木酶菌株，命名为Trichodema reesei QZ-51,本菌株的筛选:
[0018]1.1平板初筛
[0019]样品的处理方法:将材料用少量无菌水30°C浸泡24h，之后采用梯度稀释法稀释至10_8，取ImL均匀涂布在1 21°C灭菌20min的刚果红筛选平板培养基(MgSO40.50g/L,(NH4) 2S042.00g/L, KH2PO4L 00g/L，NaC10.50g/L,刚果红 0.20g/L，琼脂 20.00g/L，CMC2.0Og/L,自然pH值)上28°C恒温培养3-4天，挑取有水解透明圈且透明圈较圆整边缘清晰的的菌落在新的刚果红筛选平板培养基上划线分离培养3-4天，挑取透明圈圆整边缘清晰且透明圈直径与菌落直径比值(H/d)较大的菌落作为筛选出产纤维素酶活力较高的菌株接种到PDA平板培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20.00g/L)作为复筛菌株。
[0020]1.2摇瓶复筛
[0021]将长满菌丝的PDA平板用IOmL无菌水冲洗，吸取ImL接入种子培养基(葡萄糖 15g/L，酵母膏 2g/L，蛋白胨 3g/L，硫酸铵 2g/L，磷酸二氢钾 3g/L，CaCl2.2Η200.3g/L，MgSO4.7H200.3g/L)，种子培养基装液量为250mL三角瓶中装50mL培养基，培养温度30°C、转速200r/min摇床恒温培养48小时，取菌悬液(按接种量10% )接入液态发酵产酶培养基(玉米衆30g/L、麸皮10g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏0.5g/L,蛋白胨3g/L,硫酸铵2g/L,磷酸二氢钾 3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, FeSO4.7Η200.005g/L, MnSO4.H2O0.016g/L，ZnSO4.7H200.0014g/L, CoCl20.002g/L,吐温-800.2g/L)，液态发酵基础培养基装液量为250mL三角瓶中装50mL培养基，培养温度30°C、转速200r/min，摇床恒温培养8天。
[0022]1.3经上述两种方法筛选最终筛选到一株中性纤维素酶活力相对较高的菌株，平板菌落(图1)，电镜(图2.)，18S rDNA序列鉴定(见序列表)并鉴定确定为木酶菌属中的里氏木酶，命名为 Trichodema reesei QZ-51。
[0023]2、酶活的测定方法
[0024]2.1酶活定义
[0025]在50°C，pH为6.0条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放Iymol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(IU)，还原糖以葡萄糖等量。
[0026]2.2 原理
[0027]在一定温度和pH条件下纤维素酶水解纤维素产生单糖和寡糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的强度与酶解产生还原糖的量成正比，还原糖生成量与反应液中纤维素酶活力成正比，通过分光比色测定反应液吸光度，可计算纤维素酶活力。
[0028]2.3仪器和设备:
[0029]2.3.1 分析天平:感量 0.0OOlg
[0030]2.3.2精密pH计:精确至0.01
[0031]2.3.3磁力加热搅拌器
[0032]2.3.4分光光度计:应符合GB9721有关规定，5mm比色皿
[0033]2.3.5 电热恒温水浴锅:30 ~100°C，土0.5°C
[0034]2.3.6计时器:每小时误差不超过五秒
[0035]2.3.7 移液器:100 ~1000 μ L
[0036]2.3.8微量进样器:0~50 μ L
[0037]2.4试剂和溶液
[0038]2.4.1 试 剂:
[0039]
柠檬酸C6H8OrH2O
柠檬酸三钠Na3C6H5Or 2Η2Ο
酒石酸钾钠K0C0(CH0H)2C00Na_4H20
3，5-二硝基水杨酸C7H4N2O7
氢氧化钠NaOH
苯酚C6H5OH
无水亚硫酸钠Na2SO3
[0040]2.4.2 配制:
[0041 ] a.0.5M的磷酸二氢钠溶液:
[0042]称取39.0g磷酸二氢钠完全溶于400ml的蒸馏水中，定容至500ml。标记为A试液。
[0043]b.0.5M的磷酸氢二钠溶液:
[0044]称取89.5g磷酸氢二钠完全溶于400ml的蒸懼水中，定容至500ml。标记为B试液。
[0045]c.0.5M的磷酸盐缓冲液:
[0046]取342.5ml的A试液与157.5ml的B试液混匀。标记为C试液.[0047]d.0.05M的中性缓冲液:
[0048]取C试液500ml加入到4000ml的蒸馏水中。用精密pH计测定其pH值，必要时用3M的盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调pH值至6.0后再定容至5000ml。摇匀后标记为0.05M中性缓冲液，同时标记pH = 6.0、配制日期。在4°C条件下保存。[0049]e.200g/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠200.0g加水溶解,定容至1000ml。
[0050]2.4.310mg/ml CMC 溶液:
[0051]精密称取CMC(sigma c-5678) 1.0OOOg缓慢加入到80mL0.05M的中性缓冲液(d)中，磁力搅拌至完全溶解(室温下2小时左右)。用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调pH值至6.0，再用0.05M的中性缓冲液(d)定容至100mL。标记为10mg/ml CMC溶液，同时标记PH及配制日期。4°C条件下保存，有效期7天。
[0052]2.4.410mg/ml标准葡萄糖溶液:
[0053]精密称取无水葡萄糖1.0OOOg置80ml蒸馏水中搅拌溶解，待完全溶解后定容至100ml0标记为10mg/ml的标准葡萄糖溶液，同时标记配制日期，4°C条件下保存。
[0054]2.4.0TNS试剂的配制[0055]称取3，5-二硝基水杨酸31.50g缓慢加入5000ml蒸馏水中，不断搅拌，水浴至45°C，逐步加入1000ml氢氧化钠溶液(e)，不断搅拌至溶液清澈透明(在加入氢氧化钠溶液过程中，溶液温度不要超过48°C ) ο再逐步加入四水酒石酸钾钠910.0g、苯酚25.0g、无水亚硫酸钠25.0g,继续45°C水浴加热，同时补水3000ml,不断搅拌,至上述物质完全溶解后，冷却至室温，并定容到10000ml。用滤布过滤，将滤液储存于棕色瓶中，标识名称和配制日期，避光，室温保存7天后可以使用，有效期6个月。
[0056]本发明的有益效果:
[0057]首先提供了一株高产中性纤维素酶的菌株及用该菌为出发菌株采用液态发酵制备中性纤维素酶的方法。本发明的菌种和发酵产酶方法具有如下特点:
[0058]1、发酵性能稳定，菌体易于培养。
[0059]2、产酶周期短，在第6天即可停止发酵。
[0060]3、产酶活力高，最高可达5000IU/L以上。
[0061]4、粗酶液中中性纤维素酶含量在胞外成为主导产物，便于分离纯化。
[0062]5、粗酶性质稳定,最适温度为55度,较耐热。
[0063]6、作用底物和条件更温和广泛，具有更广阔的应用前景。
[0064]7、填补了我国中性纤维素酶发酵水平低需依赖进口的空白。
[0065]因此本发明的菌株和发酵产中性纤维素酶的方法所生产出来的中性纤维素酶可广泛使用于纺织、造纸、饲料、食品等领域，并可替代价格昂贵的进口中性纤维素酶，因此本发明的菌种和发酵产酶方法有广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。
[0066]附图表说明
[0067]图1和图2分别为Trichodema reesei QZ-5菌株平板菌落和扫描电镜形态。
[0068]序列表为Trichodema reesei QZ-5 菌株的 18S rDNA 序列鉴定。
[0069]生物材料样品保藏
[0070]Trichodema reesei QZ-5已保存于已保存于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M 2012204，保藏日期 2012 年 6 月 5 日。

[0071]实施例1
[0072]取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30°C培养7天，取一平板用IOml无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液，取Iml孢子悬液接入装有50ml种子培养基的250ml规格的三角瓶中，准备若干份。培养条件:转速200rpm，温度30度，恒温培养3天，即为发酵种子液。
[0073]在7L发酵罐中装入5L产酶培养基，再加入2.5ml消泡剂，121°C灭菌30分，冷却后，按10%接种量，加入500ml上述发酵种子液，培养条件为:转速200r/min，温度30°C，通气量1.2L/min/L，发酵培养时间150小时后，提取粗酶液，并按测酶活方法测酶活，发酵液酶活力达5080IU/L。
[0074]产酶培养基为玉米衆30g/L、麸皮10g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏0.5g/L,蛋白胨3g/L，硫酸铵 2g/L，磷酸二氢钾 3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, FeSO4.7Η200.005g/L, MnSO4.H2O0.016g/L, ZnSO`4.7`Η200.0014g/LCoCl2`0.002g/L,吐温-800.2g/L。