一种产碱性纤维素酶的铜绿假单胞菌的制作方法[0006]本发明提供一株产生纤维素酶的微生物新菌株，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PKC-001。该菌株所产生的纤维素酶既有酸性纤维素酶的活力，也有碱性纤维素酶的活力，是一种新型的纤维素酶产酶菌株。该菌株是发明人用微生物学手段从造纸厂的废弃纸浆中分离选育得到，已于2010年11月8日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2010294。[0007]该菌株为短杆状，1.5 μ mX 0.5 μ m，单生鞭毛，运动活跃。在平板培养基上显示为扁平、边缘锯齿的圆形菌落，色泽光亮。[0008]该菌株的最佳生长条件为:最适培养温度为37°C，高至42°C还可以生长；最适PH8.0,在7.5-12的碱性范围内均可生长，而在酸性条件下生长极慢。液体培养时接种量5%，转速为200rpm。培养8h左右进入对数期，32h后进入衰退期。[0009]生化鉴定结果为:革兰氏染色阴性，凝胶液化阳性，绿脓菌素阳性。[0010]该菌株具有表1所示的16s rDNA序列。序列分析显示该株与铜绿假单胞菌具有99%的同源性。[0011 ] 该菌株能够产生在酸性和碱性条件下均具有CMC活力的纤维素水解酶。所产酶的最适PH在酸性条件下为5.0，在碱性条件下8.6。[0012]该菌株的最大产纤维素水解酶发酵时间是37°C，200rpm下摇瓶培养约60h。
[0013]本发明的特点和技术进步
[0014]1.新的纤维素酶产酶菌株
[0015]本发明首先发现和证实了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌株能够产生纤维素水解酶，这至今未见报道。
[0016]2.菌株能产生在酸性和碱性条件下均有活力的纤维素酶
[0017]至今所报道的微生物菌株大多只能产生酸性或碱性纤维素酶，本发明所提供的菌株能够产生在酸性和碱性条件下均具有活力的纤维素酶，对此至今尚未见报道。



[0018]附图1:CCTCC No:M2010294铜绿假单胞菌PKC-001菌株的生长曲线。注培养基含蛋白胨 5g/L，酵母抽提物 5g/ L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L，MgSO4.7H20 2g/L，121°C灭菌20min，用预先灭菌的10% (W/V)Na2CO3溶液调pH至8.0~9.0。培养条件:37°C，200rpm
摇瓶培养；
[0019]附图2 =CCTCC No:M2010294铜绿假单胞菌PKC-001菌株所产纤维素酶的最适作用pH。菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L,KH2PO4 lg/L,MgSO4.7Η202g/L，121°C灭菌 20min，用预先灭菌的 10% (W/V)Na2CO3 溶液调 pH 至 8.0 ~9.0)在 37。。，200rpm下摇瓶培养64小时，接种量5%，然后取发酵菌液按QB2583-2003的方法测定纤维素酶的CMC活力。测定温度为42°C。以Imin水解CMC-Na底物产生Iumol的葡萄糖残基为I个酶活单位；
[0020]附图3 =CCTCC No:M2010294铜绿假单胞菌PKC-OOl菌株所产纤维素酶的最适作用温度。菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4.7H20 2g/L, 121°C灭菌 20min，用预先灭菌的 10% (ff/V)Na2CO3 溶液调 pH 至 8.0 ~9.0)在37°C，200rpm下培养64小时，接种量5%，取发酵菌液测定不同温度下的CMC酶活力和蛋白质含量。CMC酶活力按QB2583-2003的方法测定，pH为8.5，蛋白质含量用Braford方法测定，以Imin水解CMC-Na底物产生Iumol的葡萄糖残基为I个酶活单位；
[0021]附图4 =CCTCC No:M2010294铜绿假单胞菌PKC-OOl菌株所产纤维素酶的时间曲线。注:菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4.7H20 2g/L, 121°C灭菌 20min，用预先灭菌的 10% (ff/V)Na2CO3 溶液调 pH 至 8.0 ~9.0)在37°C，200rpm下摇瓶培养，接种量5 %，定时取发酵菌液测定纤维素酶活力和蛋白含量。CMC酶活力按QB2583-2003的方法测定，pH为8.5，蛋白质含量用Braford方法测定，以Imin水解CMC-Na底物产生Iumol的葡萄糖残基为I个酶活单位；
[0022]附图5 =CCTCC No:M2010294铜绿假单胞菌PKC-OOl菌株对外分泌蛋白的时间曲线。注:菌株用培养基(含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 5g/L，KH2PO4 lg/L,MgSO4.7H20 2g/L, 121°C灭菌 20min，用预先灭菌的 10% (ff/V)Na2CO3 溶液调 pH 至 8.0 ~
9.0)在37°C，200rpm下摇瓶培养，接种量5%，定时取发酵菌液用Braford方法测定蛋白含量。

[0023]1、菌株分离选育过程
[0024]分三步进行,采样、初筛、复筛和纯化。
[0025]1.1 采样
[0026]从广西壮族自治区南宁市的造纸厂采集废弃纸浆；
[0027]1.2 初筛
[0028] 从采集的废纸浆中随机抽取约Ig样品，浮于IOml无菌水中，充分振摇，静止30分钟，让残渣下沉，取上清液稀释IO5倍，涂布接种琼脂平板初筛培养基(含蛋白胨10g/L，酵母抽提物 5g/L，NaCl 5g/L, KH2PO4 lg/L，MgSO4.7Η20 lg/L, CMC-Na 10g/L，刚果红 0.03g/L，琼脂粉20g/L, 121°C灭菌20min，用预先灭菌的10% (ff/V)Na2CO3溶液调pH至8.0~9.0)，37°C培养72h。挑取透明水解圈较大的菌落作进一步筛选。
[0029]1.3复筛和纯化
[0030]将初筛得到的菌落划线接种琼脂平板复筛培养基(除蛋白胨含量减少为5g/L，MgSO4.7H20的含量增加为2g/L外，其余与上述初筛培养基相同)，37°C培养72h，挑选透明水解圈大且清晰、稳定的菌株，反复划线接种纯化5次。然后挑单菌落接种液体发酵培养基(同复筛培养基，不加刚果红和琼脂)，于37°C，200rpm下摇瓶培养24h，取发酵液测定碱性纤维素酶的活力，筛选得到I株产碱性纤维素酶的高产菌株，命名为PKC-001。
[0031]2、菌株的分类鉴定
[0032]2.1形态鉴定[0033]将筛选得到的PKC-001菌株接种液体菌株培养基(同上述液体复筛培养基，不加CMC-Na和刚果红)，37°C，200rpm下摇瓶培养16h，显微镜下观察菌体的外观特征，用测微尺测量菌体细胞的大小。显示菌体细胞为短杆状，大小1.5 μ mX0.5 μ m,单生鞭毛,运动活跃。此外，菌体在筛选平板培养基上显示为扁平、边缘锯齿的圆形菌落，色泽光亮。
[0034]2.1生化鉴定
[0035]参照国标GB7918.4-1987，对PKC-OOl菌株进行凝胶化反应和绿脓菌素检验。
[0036]I)凝胶化检测:先将筛选得到的PKC-OOl菌株用上述液体菌株培养基在37°C，200rpm下培养16h，再转接一次，得到活化菌株。然后按国标GB7918.4-1987的方法取菌株培液穿刺接种明胶培养基(含牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，明胶120g/L，加热溶解，调pH至
7.4，115°C灭菌20min，分装制成高层培养基)，37°C下培养24h，取出放入冰箱内30min。结果呈阳性反应，培养基被液化；
[0037]2)绿脓菌素检测:筛选得到的PKC-OOl菌株按上述活化，接种绿脓菌素检测培养基[含蛋白胨20g/L，氯化镁1.4g/L，硫酸钾10g/L，琼脂18g/L，甘油(化学纯)10g/L，加热溶解，调pH至7.4，115°C灭菌20min,制成斜面]，37°C培养24小时，向培养物加入3~5ml氯仿，待氯仿呈蓝色时，将氯仿转移到另一试管，加入Iml浓度为IN的盐酸，振摇2min。结果上层盐酸呈红紫色，表明反应呈阳性。
[0038]2.3分子鉴定
[0039]将PKC-001菌株同上活化后接种液态菌株培养基(同上)，接种量5%，37°C，200rpm下培养16h至对数期，菌株达到2X 108/ml以上。取培养液2ml，15000rpmX IOmin离心，弃上清，菌体用无菌 蒸馏水洗涤2次，收集菌体细胞，用液氮冷冻研磨破碎，用酚-氯仿法提取菌体的基因组DNA。以该DNA为模板，采用通用引物:BSF8/20:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(正向);BSR1492/21:ACGGCTACCTTGTTACGACTT (反向)，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增菌体的16SrDNA序列，50ul的反应体系含PCR缓冲液5ul，正、反向引物各 IuM, Mg2+2.5mM，各 dNTP0.02mM, TaqDNA 聚合酶 1.25U。反应条件为:95°C,5min ；94。。，30s ；55°C, 30s ；72°C, lmin, 30cycles ;最后 72°C, IOmin0 反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测、分离 PCR 产物，使用 TaKaRa AgaroseGel DNA Purification Kit Ver.2.0 (CodeN0.DV805A)试剂盒切胶回收扩增的目的片段，将目的片段连接到PMD-18T载体，将带有目的片段的PMD-18T载体通过转化E.coli DH5a菌株进行扩增后，测定载体上目的片段的序列，得到该菌株1501bp的16S rDNA序列。将序列在NCBI网站的Genbank核酸数据库进行同源序列比对搜索(Nucleitide-NucleitideBLAST)，结果表明，该菌株16SrDNA与Pseudomonas aeruginosa strain DQl 菌株的 16s rDNA 序列(GU269267.1), Pseudomonasaeruginosa strain AS2 菌株的 l6s rDNA 序列(GU447228.I)具有的序列同源性(PKC-001的16SrDNA序列见附表)。
[0040]综合上述结果，鉴定所选育得到的产纤维素酶菌株PKC-001为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。
[0041]3、菌株及其所产纤维素酶的特性
[0042]3.1菌株的生长特性
[0043]将PKC-001菌株接种液态菌株培养基(同上)，接种量5%，在不同条件下观察菌株的生长情况。结果表明，菌株的最适培养温度为37°C，高至42°C还可以生长；生长最适pH为8.0，在pH7.5-12的碱性范围内均可生长，而在酸性条件下生长极慢。200rpm摇床培养时，37°C下培养8h左右进入对数期，32h后进入衰退期(附图1)。
[0044]3.2菌株所产纤维素酶的最适作用pH
[0045]将PKC-001菌株按上述方法活化后接种产酶发酵培养基(同上述复筛培养基，不加刚果红和琼脂成分)，接种量5%，在37°C，200rpm下摇瓶培养64h，取菌液12000rpm离心lOmin，取上清在pH为6、7、8、8.5、9、10、11、12、13的缓冲条件下测定纤维素酶的活力，反应温度42°C，以Imin水解CMC-Na底物产生Iumol的葡萄糖残基为I个酶活单位。结果表明=PKC-OOl菌株所产的纤维素酶在酸性和碱性条件下均具有活力。酸性纤维素酶的最适pH为5.0，在pH4-6的范围内显示酶活力。碱性纤维素酶活力的最适pH为8.6，在pH7-ll的范围内保持部分酶活(附图2)。
[0046]3.3菌株所产纤维素酶的最适作用温度
[0047]同上将将PKC-OOl菌株接种产酶发酵培养基(同上)，接种量5%，在37°C，200rpm下摇瓶培养64h，取菌液12000rpm离心lOmin，在pH8.6的条件下，以CMC-Na为底物，按国标GB (2583-2005)的方法测定菌株所产碱性纤维素酶在30、35、40、47.5、50、55、60°C的活性，结果表明在50°C下酶活力最高，反应温度从30°C上升至50°C，酶活力逐步上升，温度超过50°C后，酶活力迅速下降，温度为60°C的酶活力只有最高酶活的0.6% (附图3)。
[0048]3.4菌株的产酶时间
[0049]将PKC-OOl菌株同上活化后接种产酶发酵培养基(同上述复筛培养基，不加刚果红和琼脂)，接种量5%，于37°C下200rpm摇瓶培养，按国标QB2583-2003的方法，以CMC-Na为底物，在PH8.5的条件下 测定 发酵液的CMC酶活力，观察菌株的产酶情况，用Braford方法测定发酵液的蛋白浓度，观察 菌株向外分泌蛋白的情况，结果表明该菌株在培养启动时即开始对外分泌蛋白，培养24h蛋白产量达到最高，此后发酵液的蛋白浓度基本保持不变。产酶方面，培养IOh,菌株进入对数期后开始产生纤维素酶,培养24h后大量产酶,在培养66h发酵液的碱性纤维素酶活力达到最大值，随后迅速降低，培养到IOOh发酵液的酶活几乎为零(附图4、5)。