专利名称:离子液体中修饰纤维素酶原位降解纤维素的方法纤维素是世界上最丰富的可再生资源,也是解决人类面临的粮食问题、能源问题和环境问题的最有前景的资源,现实生活中纤维素材料只有一小部分被用于纺织、造纸、建筑、饲料等方面,这不仅造成了资源的浪费而且还引发环境问题。将纤维素酶解为葡萄糖, 再通过发酵工艺可以生产乙醇、丙酮、丁醇等燃料和化工原料,是纤维素综合利用的有效途径。但是纤维素酶水解纤维素成葡萄糖的反应速度缓慢,在很大程度上是由于纤维素的高度结晶结构以致纤维素酶的吸附不到位。所以这种方法要求将纤维素溶解在一定的溶剂中,破坏纤维的晶态结构,以保证纤维素酶能够进入纤维素底物内部发挥作用。离子液体(ILs),是一类新型的纤维素的优良溶剂,也是一种新型的生物催化反应介质。Rogers等首先发现离子液体氯化I-丁基-3-甲基咪唑盐([Bmim]Cl)在室温可以直接溶解纤维素,破坏纤维素的结晶结构,在提高酶水解速度和降低酶用量等方面显示了巨大潜力。随后氯化1_烯丙基_3_甲基咪唑盐([Amim]Cl)、氯化I-(2-轻乙基)-3-甲基咪唑盐([HeEim]Cl)等相继被证实能够溶解纤维素(参见中国专利CN1491974)。但此类离子液体含有卤素对纤维素酶活性起到抑制作用。为了保持甚至提高离子液体体系中纤维素酶的活性,就要不断改进离子液体,使之既能满足纤维素的溶解性又能与纤维素酶的活性相匹配,咸漠等(参见中国专利CN101899487A)提出了咪唑磷酸酯类离子液体中可以进行纤维素酶的原位酶解。但该类离子液体对纤维素的溶解性远不如[Bmim]Cl离子液体。因此, 创制在[Bmim]Cl离子液体中具有高活性高稳定性的纤维素酶是实现离子液体下纤维素原位酶解的有效途径。
本发明的目的是创制具有高活性高稳定性的纤维素酶,以实现在氯化I-丁基-3-甲基咪唑盐([Bmim]Cl)离子液体体系下纤维素的原位酶解。本发明的技术方案是这样实现的在50_60°C下将微晶纤维素,加入到[Bmim]Cl 离子液体中,得到均相溶液,纤维素占离子液体的重量比5-10%。在50-60°C下加入pH为 4. 8的柠檬酸缓冲液和修饰纤维素酶,柠檬酸缓冲液的加入量为离子液体质量的5-6倍,修饰纤维素酶的加入量为每毫升离子液体O. 5-5mg,反应30分钟至I小时,纤维素转化成还原糖的转化率在80-90%。本发明采用的修饰纤维素酶是这样得到的在30_35°C下,在柠檬酸缓冲溶液(pH =4.8)中,加入天然纤维素酶,待其完全溶解后,缓慢加入等质量的聚乙二醇衍生物,混合均匀后,加入聚乙二醇衍生物质量的30-50%的还原剂氰基硼氢钠(NaCNBH3),恒温反应24 小时,然后加入天然纤维素酶质量20倍的甘氨酸,终止反应,通过透析纯化得到修饰纤维素酶。本发明采用聚乙二醇衍生物为修饰剂,具体为单甲氧基聚乙二醇丙醛,分子量分别为 5000,10000,20000,分别标记为 mPEG-ALD 5k,mPEG-ALD 10k,mPEG-ALD 20k;单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺,分子量为5000,标记为mPEG-SPA 5k ;单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺,分子量为5000,标记为mPEG-MAL 5k。本发明采用的纤维素酶,酶活力1800u/毫克,pH范围ρΗ2· 5-7. 5最佳ρΗ 4. 8, 温度范围30-80°C最佳温度50°C。本发明采用微晶纤维素原料的分子量2. 5 5万,聚合度153 300,灰分 < 0.6%,粒径 25 190 μ m。发明效果本发明提供的新型纤维素酶,能在含有卤素的离子液体中表现出良好的活性和稳定性,很好地促进纤维素降解。使用本发明的方法可提高天然纤维素酶抵制环境引起酶失活的能力,从而提高了酶的催化活性,在反应过程中始终保持较高的催化活性,具有明显的先进性,将为纤维素资源的综合利用提供一条新的途径。4称取7. 5g[Bmim] Cl于IOOmL三口瓶中,加入375mg微晶纤维素(5% w/w) 60°C溶解2.5小时,得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH为4. 8的柠檬酸缓冲液37. 5mL(约为离子液体重量的5倍)、15· Omg的Cell-ALD 5k,50°C下反应I小时后,取O. 5mL反应酶液,加入I. 5mLDNS试剂,沸水终止反应显色5min,冰水冷却至室温,蒸馏水定容至20mL。在540nm 下测定吸光度值,代入标准葡萄糖曲线,得到还原糖量达到4. 85mg/mL,纤维素转化为还原糖的转化率为80%。实施例2 微晶纤维素原料分子量2. 5 5万,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒径25 190 μ m0还原糖量的测定方法参见实施例I。在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 4. 8 O. IM的现配柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液;设定水浴加热温度为35°C,待瓶内温度稳定后加入150mg纤维素酶粉末,缓慢搅拌溶解;称取150mg分子量10000的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD 10k)作为修饰剂,并开始计时,混合均匀;再加入46mg氰基硼氢钠(NaCNBH3)作为还原剂搅拌溶解,使其终浓度保持在20mM/mL以上;反应24h后,加入3. Og甘氨酸以终止纤维素酶的修饰化学反应30min ;反应液通过透析袋(截留14k大分子)在pH = 4. 8 O. IM的朽1檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中透析过夜;得到纯化修饰纤维素酶液,冻干得到修饰纤维素酶粉。 记作 Cell-ALD 10k,4°C下保存。称取7. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中,加入450mg微晶纤维素(6% w/w)60°C溶解 3小时,得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH为4. 8的柠檬酸缓冲液41. OmL (约为离子液体重量的5. 5倍)、21· Omg的Cell-ALD 10k, 50°C下反应I小时后,取O. 5mL反应酶液,加入I. 5mLDNS试剂,沸水终止反应显色5min,冰水冷却至室温,蒸馏水定容至20mL。在540nm 下测定吸光度值,代入标准葡萄糖曲线,得到还原糖量达到9. 27mg/mL,纤维素转化为还原糖的转化率为85%。实施例3 微晶纤维素原料分子量2. 5 5万,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒径25 190 μ m0还原糖量的测定方法参见实施例I。在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 4. 8 O. IM的现配柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液;设定水浴加热温度为35°C,待瓶内温度稳定后加入150mg纤维素酶粉末,缓慢搅拌溶解;称取150mg分子量20000的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD 20k)作为修饰剂,并开始计时,混合均匀;再加入46mg氰基硼氢钠(NaCNBH3)作为还原剂搅拌溶解,使其终浓度保持在20mM/mL以上;反应24h后,加入3. Og甘氨酸以终止纤维素酶的修饰化学反应30min ;反应液通过透析袋(截留20k大分子)在pH = 4. 8 O. IM的朽1檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中透析过夜;得到纯化修饰纤维素酶液,冻干得到修饰纤维素酶粉。 记作 Cell-ALD 20k,4°C下保存。称取7. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中,加入600mg微晶纤维素(8% w/w)60°C溶解4小时,得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH为4. 8的柠檬酸缓冲液42. 5mL(约为离子液体重量的5. 7倍)、35· Omg的Cell-ALD 20k,50°C下反应I小时后,取O. 5mL反应酶液,加入I. 5mLDNS试剂,沸水终止反应显色5min,冰水冷却至室温,蒸馏水定容至20mL。在 540nm下测定吸光度值,代入标准葡萄糖曲线,得到还原糖量达到16. 36mg/mL,纤维素转化为还原糖的转化率为90%。实施例4 微晶纤维素原料分子量2. 5 5万,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒径25 190 μ m0还原糖量的测定方法参见实施例I。在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 7. O O. 2M的现配磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液;设定水浴加热温度为35°C,待瓶内温度稳定后加入150mg 纤维素酶粉末,缓慢搅拌溶解;称取150mg分子量5000的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺 (mPEG-SPA 5k)作为修饰剂,并开始计时,混合均匀;再加入48mg氰基硼氢钠(NaCNBH3)作为还原剂搅拌溶解,使其终浓度保持在20mM/mL以上;反应24h后,反应液通过透析袋(截留7k大分子)在pH = 4. 8 O. 2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中透析过夜;得到纯化修饰纤维素酶液,冻干得到修饰纤维素酶粉。记作Cell-SPA 5k,4°C下保存。称取I. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中,加入375mg微晶纤维素(5% w/w)60°C溶解2. 5小时,得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH为4. 8的柠檬酸缓冲液40. OmL (约为离子液体重量的5. 3倍)、28· Omg的Cell-SPA 5k,50°C下反应I小时后,取O. 5mL反应酶液,加入I. 5mLDNS试剂,沸水终止反应显色5min,冰水冷却至室温,蒸馏水定容至20mL。在 540nm下测定吸光度值,代入标准葡萄糖曲线,得到还原糖量达到5. 16mg/mL,纤维素转化为还原糖的转化率为86%。实施例5 微晶纤维素原料分子量2. 5 5万,聚合度153 300,灰分< O. 6%,粒径25 190 μ m0还原糖量的测定方法参见实施例I。在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入15mL pH = 7. 00. 2M的现配磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液;设定水浴加热温度为35°C,待瓶内温度稳定后加入150mg 纤维素酶粉末,缓慢搅拌溶解;称取150mg分子量5000的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺 (mPEG-MAL 5k)作为修饰剂,并开始计时,混合均匀;再加入48mg氰基硼氢钠(NaCNBH3)作为还原剂搅拌溶解,使其终浓度保持在20mM/mL以上;反应24h后,反应液通过透析袋(截留7k大分子)在pH = 4. 8 O. 2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中透析过夜;得到纯化修饰纤维素酶液,冻干得到修饰纤维素酶粉。记作Cell-MAL 5k,4°C下保存。称取7. 5g[Bmim]Cl于IOOmL三口瓶中,加入375mg微晶纤维素(5% w/w)60°C溶解2.5小时,得到均相溶液。在此均相溶液中加入pH为4. 8的柠檬酸缓冲液45. OmL (约为离子液体重量的6倍)、30· Omg的Cell-MAL 5k,50°C下反应I小时后,取O. 5mL反应酶液,加入I. 5mLDNS试剂,沸水终止反应显色5min,冰水冷却至室温,蒸馏水定容至20mL。在540nm 下测定吸光度值,代入标准葡萄糖曲线,得到还原糖量达到4. 97mg/mL,纤维素转化为还原糖的转化率为82%。
本发明公开一种在氯化1-甲基3-丁基咪唑盐离子液体下修饰纤维素酶原位酶解微晶纤维素的新方法。该方法主要包括以下步骤聚乙二醇衍生物与天然纤维素酶以一定比例在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中反应,通过透析纯化得到修饰纤维素酶;按一定比例将修饰纤维素酶与柠檬酸-柠檬酸钠混合,加入到纤维素/氯化1-甲基3-丁基咪唑盐离子液体的均相体系中,对纤维素进行酶解。本发明的特点在于修饰纤维素酶稳定性提高,催化活性强,在含有卤素的离子液体中仍能保持纤维素酶活性,为纤维素提供了一条高效酶解的新途径。
离子液体中修饰纤维素酶原位降解纤维素的方法
- 专利详情
- 全文pdf
- 权力要求
- 说明书
- 法律状态
查看更多专利详情
下载专利文献
下载专利
同类推荐
-
代淑梅, 李秋园S·西鲁M·哈格马克, F·保利尼
您可能感兴趣的专利
-
仇锦明, 仇剑梅仇锦明, 仇剑梅张君曼纪尧姆·卡森
专利相关信息
-
刘明军E·帕泰恩, T·德罗维特斯卡亚吴斌久保浩之