专利名称：针对流感病毒m2离子通道蛋白vhh基因工程抗体及其编码基因和在制备抗流感病毒药物 ...的制作方法病毒性流行性感冒每年都在全世界流行，其波及范围之广，造成经济损失之大，位于传染性疾病之首。据世界卫生组织统计，北半球每年1乙人感染流感，500万次就诊，30万次住院，1万人死于流感，每年经济损失超过100亿美元。流感不仅在全世界引起广泛关注， 也是我国重点预防与控制的病毒性传染性疾病。控制流感的现有方法是每年用灭活的完整病毒或亚单位疫苗进行接种。流感病毒的重要中和抗原是红细胞凝集素(HA)，不过，由于 HA高频率的和无法预测的抗原变异，所述疫苗通常不能提供对于不同病毒株的最佳保护性免疫。另外，对于诸如老年患者，幼儿，免疫缺陷和免疫受损的个体来说，接种疫苗也不能提供有效的保护。抗流感病毒药物作为疫苗防护有效的补充，但是抗流感病毒药物的发展一直非常缓慢，M2离子通道蛋白抑制剂是长期以来主要的一类抗流感病毒药物，包括1966年上市的金刚烷胺(Amantidine，Symmetrel)和1987年上市的金刚乙胺(Rimatidine)。金刚烷胺和金刚乙胺可以通过阻断M2离子通道蛋白阻止病毒脱壳，使病毒RNA不能释放到细胞质中， 病毒的早期复制被中断，从而起到抗流感病毒的作用。此类药物主要不足之处有以下几点 ①具有胆碱能作用，中枢神经系统不良反应大。②M2离子通道蛋白产生变异很快，33%的患者在用药5天后由于M2离子通道蛋白的单个氨基酸突变而产生耐药性，并且耐药株具有致病性和传染性。被动免疫被证实是一种抗病毒治疗的安全和有效的手段，红细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)是刺激抗体产生的两种主要抗原。由于这两种蛋白经常发生抗原性变异，他们不是开发治疗药物的最佳目标。A型流感病毒的第三种跨膜蛋白，基质蛋白2(M2)， 是由病毒感染过的细胞大量表达的，其中，推测它能提供病毒复制所必须的跨膜质子流 (CiamporVirus research 22 :247(1992) ；Grambas and Hay,Virology 190 :11(1992)； Sugrue等，EMBO Journal9 :3469 (1990))。与HA和NA不同，M2是保守的，并且可以作为开发流感患者的基于抗体的被动免疫治疗的目标(It等，J Virology 65:5491(1991)； Sl印ushkin 等，Vaccine 13:1399(1995) ；Neirynck 等，Nature Med, 5 1157 (1999)) 与小分子药物相比，生物药具有活性高、特异性强、生物功能明确，毒性低等特点， 已成为医药产品中的重要组成部分，如多肽、重组蛋白和单克隆抗体(简称单抗)等。噬菌体抗体库技术使我们能绕过动物免疫，直接利用抗原从抗体库中筛选出特异性的人源性单克隆抗体，克服了鼠源单克隆抗体分子量大、穿透性差、产量低及体内产生HAMA等局限性， 是基因工程抗体技术的重大突破性发展。但是传统抗体结构复杂，生产成本高昂等缺点限制了其临床应用范围。比利时科学家从骆驼体内发现了天然缺少轻链的“重链抗体”，以此为基础产生的新型纳米抗体药物分子量小，只有抗体分子的1/10，而且化学性质也更加灵活，能与酶的活性部位和细胞膜中的裂缝结合在一起，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更易于用药和保存。与传统的单克隆抗体药物相比，其可以进行大规模细菌发酵生产，且价格低廉，易于普及应用。为抗体药物的发展开拓了更广阔的空间。
本发明的目的是提供一种针对流感病毒M2离子通道蛋白新型的广谱抗流感病毒 VHH基因工程抗体及其编码基因和在制备抗流感病毒药物中的应用。本发明通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，构建了大容量人工合成VHH基因工程抗体文库，并筛选获得特异性抗流感病毒M2离子通道蛋白VHH单域抗体， 并获得了抗体基因，从而实现了本发明的目的。本发明的针对流感病毒M2离子通道蛋白VHH基因工程抗体是一种“重链抗体”， 命名为M2-7AVHH抗体，该针对流感病毒M2离子通道蛋白VHH基因工程抗体，包括4个框架区，即FR1、FR2、FR3和FR4，禾口 3个互补决定区，即CDR1、CDR2和CDR3，所述的CDRl的氨基酸序列为GYILSNNSIG，所述的CDR2的氨基酸序列为AINMNGAKTNYADSVKG，所述的CDR3的氨基酸序列为 IHMRSHGHTKQNRTTYo本发明的针对流感病毒M2离子通道蛋白VHH基因工程抗体，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 1所示，其编码基因序列如SEQ ID NO. 2所示。用ELISA、IFA和FACS对所获得的针对流感病毒M2离子通道蛋白VHH基因工程抗体功能特性进行鉴定。结果表明M2-7A VHH抗体能特异性与流感病毒天然状态下M2离子通道蛋白分子结合，体外实验证明其对流感病毒M2野生型和金刚烷胺抗药株病毒都具有抑制作用。细胞存活实验提示其可能通过抑制M2离子通道功能行使作用。小鼠体内实验证实，被动免疫M2-7A VHH抗体对流感病毒攻击小鼠具有治疗性保护作用，能保护动物免受流感A/PR/8/34的致死剂量的侵袭。因此，本发明提供的一种针对流感病毒M2离子通道蛋白VHH基因工程抗体，该抗体可用于开发抗流感病毒药物，如治疗患有流感或存在患流感的危险的受试者的药物。图1是利用PCR拼接方法弓I入⑶R突变，合成VHH基因库的示意图；图2A是用ELISA检测表达纯化的M2-7A VHH抗体对流感病毒(A/Puerto Rico/8/34)的特异性结合情况图；图2B是用ELISA检测表达纯化的M2-7A VHH抗体对重组流感病毒M2离子通道蛋白特异性结合情况图；图2C是用ELISA检测表达纯化的M2-7A VHH抗体对流感病毒M2胞外段合成肽特异性结合情况图；图3A是用BIAC0RE检测M2-7AVHH抗体和重组M2离子通道蛋白亲和力大小；图;3B是用BIAC0RE检测14C2鼠源单克隆抗体和重组M2离子通道蛋白亲和力大小；图4是用流式细胞间接免疫荧光(FACS)检测M2-7AVHH抗体对细胞表面表达的M2离子通道蛋白分子特异性结合，4A是M2-7AVHH抗体对未诱导表达M2的293细胞结合情况， 4B是M2-7AVHH抗体对诱导表达M2分子的293细胞结合情况；图5是用免疫荧光检测M2-7AVHH抗体对病毒感染细胞表面M2分子特异性结合情况；图6是用噬斑抑制实验检测体外M2-7A VHH抗体对流感病毒抑制作用，6A是野生型流感病毒株，6B是金刚烷胺抗药性病毒株；1 未加病毒感染，2-12 病毒感染，其中2只有病毒感染；3，加入PBS ；4，加入无关VHH对照(100 μ g/ml) ；5-8 :M2_7AVHH抗体用PBS稀释到终浓度分别为100 μ g/ml，50 μ g/ml，25 μ g/ml，12. 5 μ g/ml ；9-12 金刚烷胺用 PBS 稀释到终浓度分别为 5 μ M，2. 5 μ M，1. 25 μ Μ, 0. 625 μ Μ。图7是利用表达Μ2离子通道蛋白的293细胞在PH改变下的细胞存活实验检测 M2-7AVHH抗体对离子通道的抑制作用，7Α是表达野生型Μ2离子通道蛋白293细胞，7Β是表达突变体Μ2离子通道蛋白293细胞；图8是利用小鼠流感模型检测M2-7AVHH抗体对流感病毒的体内治疗性保护实验， 8Α攻毒后小鼠的存活率随攻毒时间变化的曲线，8Β是攻毒后小鼠体重随攻毒时间变化的曲线；图9是原核表达的M2-7AVHH抗体经纯化后的SDS-PAGE图谱。 将M2-7AVHH抗体的编码基因克隆进原核表达载体PET22b中，在大肠杆菌原核细胞中表达，从周质腔中提取VHH，用Ni-NTA琼脂进行亲和层析，250mM咪唑洗脱，洗脱的VHH 蛋白对PBS缓冲液透析，SDS-PAGE检测纯度和均一性，如图9所示，图中的点样孔1、2、3和 4都是M2-7A VHH抗体，只是洗脱的批次不同，从而获得纯化的原核细胞表达的M2-7A VHH 抗体。M2-7A VHH抗体的性能四、测试方法1 :ELISA检测M2-7A VHH抗体与流感病毒颗粒以及重组M2离子通道蛋白，M2胞外段合成肽结合活性分别用纯化的灭活Hmi流感病毒颗粒(A/Puerto Rico/8/34)、重组流感病毒的M2离子通道蛋白和M2离子通道蛋白胞外段合成肽(合成多肽偶联KLH，多肽序列为 MSLLTEVET PIRNEWGCRCNDSSD)包被抗原，4°C包被至 96 孔 ELISA 板过夜；再用 PBS/0. 1 % Tween 20洗涤2次之后，用PBS/1 % BSA在37°C封闭平板1小时，加入表达纯化的M2-7A VHH抗体，在37°C温育所述平板1小时，用PBS/0. 1% Tween 20洗涤6次之后，加入稀释过 HRP-偶联的抗His二抗(美国Abcam，l 5000稀释使用)，37°C温育1小时。再用PBS/0. 1 % Tween 20洗涤6次之后，添加过氧化物酶四甲基联苯胺(TMB)显色液显色，2M 终止反应，酶标仪在450nm检测吸光度A值。2 :BIAC0RE测定M2-7AVHH抗体与重组流感病毒M2离子通道蛋白的亲和力大小M2-7A VHH抗体结合重组M2离子通道蛋白的动力学分析在Biacore2000上于25°C 进行。采用胺连接试剂盒通过胺连接将M2离子通道蛋白共价包被至CM5传感芯片的单个流动池表面。在HBS缓冲液中将M2-7AVHH抗体以30 μ 1/min的流速注射在每一流动池上， 浓度范围为31.75至100011!11。将HBS缓冲液注射作为阴性对照。在完成每一结合和解离循环后，以0. 5M NaOH溶液再生表面。采用BiaCOre2000软件来计算结合速率(Ka)、解离速率常数(Kd)以及亲和常数(KD)。每一拟和优度都基于实验数据和计算拟合之间的一致性，其中Chi2值小于1.0。以14C2鼠源单克隆抗体(购自santa cruz公司，货号为sc-32238) 作为对照。3 流式细胞术分析抗原抗体结合特异性(Flow cytometry FCM)3. 1 稳定表达M2离子通道蛋白(野生型和突变型)的293细胞系的构建方法以M2离子通道蛋白的氨基酸序列为模板，M2离子通道蛋白的野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，突变型的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，经过密码子优化后，氨基酸序列不变，但适合哺乳动物细胞内高水平表达，野生型的M2离子通道蛋白的编码基因序列如SEQ ID N0. 5所示，突变型的M2离子通道蛋白的编码基因序列如SEQ ID N0. 6所示。基因序列由人工合成，通过BamH I和)(ba I酶切克隆于pcDNA4质粒，该质粒在HEK293 细胞中需在四环素的诱导下才能表达目的基因。采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 将质粒pcDNA4-M2及其空载体pcDNA4分别转染HEK293_Trex细胞，48h后将细胞按1 12 接种量传代并加入200 μ g/mL的kocin进行克隆筛选。维持200 μ g/mL的kocin培养3 周，待单细胞克隆形成进行扩大培养鉴定。细胞在37°C，5 %的C02下培养，培养基为含10 % 胎牛血清DMEM。由此构建成功稳定表达野生型的M2离子通道蛋白和突变型的M2离子通道蛋白的四3细胞系。3. 2 流式细胞术分析抗原抗体结合特异性(Flow cytometry FCM)采用间接荧光分类的方法(fluorescence activated cell sorting, FACS)分析 M2-7AVHH抗体与M2离子通道蛋白表达细胞的结合。将稳定表达M2离子通道蛋白(野生型和突变型)的293细胞系经细胞诱导表达M2离子通道蛋白M小时后，细胞计数设定每个反应体系约为2X105个细胞/50μ 1，加入M2-7AVHH抗体50μ 1，冰上作用1小时，用含 0. 5% BSA的PBS洗涤细胞3次。为了检测M2-7AVHH抗体与Μ2转染细胞的结合，将FITC 标记的抗His抗体1 100稀释(美国Abeam)用作二抗并与细胞一起避光4°C孵育30分钟，同上将细胞再次洗涤，将细胞重悬于PBS缓冲液中，流式细胞仪检测。4 间接免疫荧光(IFA)检测细胞6孔培养板培养MDCK细胞，置入载玻片，使细胞爬片生长，流感病毒A/ PuertoRico/8/34感染MDCK细胞1小时，37 °C培养约48小时，载玻片丙酮固定15min， TritonX-IOO处理5min，0. 5% BSA的PBS洗3次，加入表达的M2-7AVHH抗体，37°C孵育1小时，0. 5% BSA的PBS洗3次，加入FITC标记的抗His抗体(Abeam)，37°C孵育1小时，0. 5% BSA的PBS洗3次，DAPI处理5分钟，冲洗，甘油封片，显微镜观察。5 体外病毒噬斑抑制实验感染前M小时，将MDCK细胞(较高代次)以3X IO5细胞/孔的密度平铺于12孔板，平均每孔加入2ml细胞悬液。C02培养箱中37°C培养18 22小时后，将50pfu流感病毒稀释到0. 5ml含0. 5% BSA的DMEM培养液中，再与不同浓度M2-7AVHH抗体混合37°C孵育30min，弃去12孔培养板中的细胞液，PBS洗细胞2洗，加入上述病毒抗体混合液，37°C感染细胞1小时，弃去12孔培养板中的病毒液，PBS洗细胞2次。用Iml顶层琼脂培养基覆盖(0.5% BSA and 0. 8% agarose MEM, lmg/ml TPCK 处理的胰酶 trypsin，不同浓度 VHH抗体)，培养板37°C孵育48小时至空斑出现，弃去上层软琼脂覆盖，丙酮固定细胞，结晶紫染色观察噬斑。六、测试结果1 =VHH抗体库筛选抗流感病毒M2离子通道蛋白抗体本发明合成寡核苷酸片段作为PCR引物时，引入了 CDR区域的突变，再采用PCR拼接方法合成VHH基因库，克隆进噬菌体表面展示载体，构建了高容量合成VHH抗体库，计算库容为4. 8 X IO8,挑取克隆进行测序证明库的多样性良好，为增加库丰度，分别构建CDR3从 9到18个氨基酸的抗体库，合并制备噬菌体VHH用于筛选。用纯化的大肠杆菌表达系统表达重组M2离子通道蛋白作为抗原对抗体库进行筛选，经过4轮筛选后。用流感病毒感染的 MDCK细胞和未感染细胞进行差异鉴定。细胞96孔板铺板，利用ELISA鉴定，结果挑选100 个特异性结合流感病毒感染细胞阳性克隆，进行序列分析。然后在大肠杆菌系统中表达阳性克隆，得到纯化后VHH抗体进行后续功能实验。经筛选，本发明筛选得到了一种特异性抗流感病毒M2离子通道蛋白的VHH单域抗体，命名为M2-7AVHH抗体，该抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码基因序列如SEQIDN0. 2所示，该抗体包括4个框架区，即FR1、FR2、FR3和FR4，和3个互补决定区，即 ⑶R1、⑶R2和⑶R3，框架区与骆驼单域抗体的框架区一致，只是在3个互补决定区引入了突变，其中CDRl的氨基酸序列为GYILSNNSIG，CDR2的氨基酸序列为AINMNGAKTNYADSVKG和CDR3的氨基酸序列为IHMRSHGHTKQNRTTY。2 抗流感病毒VHH抗体和流感病毒M2离子通道蛋白的特异性结合为了证实所获得的重组VHH抗体-M2-7AVHH抗体是特异针对流感病毒M2离子通道蛋白，本发明进一步通过ELISA，流式细胞术，间接免疫荧光实验鉴定原核表达的M2-7A VHH抗体的功能活性。如图2所示，分别用纯化的灭活Hmi流感病毒颗粒(A/Puerto Rico/8/34)、重组流感病毒M2离子通道蛋白和M2离子通道蛋白胞外段合成肽作为包被抗原，对原核表达的M2-7AVHH抗体进行检测。结果证明M2-7AVHH抗体能有效识别流感病毒表面M2分子和重组M2离子通道蛋白，但是不能识别M2离子通道蛋白胞外段合成肽，提示 M2-7A VHH抗体的识别表位可能不是线性表位，而是依赖于二级空间结构。如图4所示，流式细胞结果显示，M2-7AVHH抗体能特异识别293细胞表面诱导表达的M2分子，但是对未诱导的四3细胞无明显结合。流感病毒感染MDCK细胞后，制成病毒抗原片，免疫荧光检测M2-7AVHH抗体与病毒感染细胞表面M2分子结合情况，结果与流式细胞检测结果相符， M2-7AVHH抗体能特异识别病毒感染细胞表面表达M2离子通道蛋白分子，如图5所示，免疫荧光为阳性反应。以上结果证实M2-7AVHH抗体能特异识别病毒表面和诱导表达或感染细胞表面天然状态下M2离子通道蛋白分子。3 :M2-7A VHH抗体亲和力测定通过将重组M2离子通道蛋白结合在CM5芯片上，并将M2-7AVHH抗体以不同浓度 (1000，500，250，125，62. 5，31. 25，0nM)注射到芯片表面。采用 1 ILaugmuir 结合模型评价结合动力学。采用BiacOre2000评价软件，通过拟合至1 ILaugmuir模型，测定了筛选到的M2-7AVHH抗体动力学速率和亲和力常数。如图3所示M2-7AVHH抗体亲和力数据分别为ka LlXlO4Ir1Sikd 4· 34X ΙΟΛΓ1，KD 3. 95 Χ10—Μ。4 :M2_7AVHH抗体体外对流感病毒中和作用体外噬斑实验表明筛选到的M2-7AVHH抗体对流感病毒在噬斑测定中的生长具有抑制作用。如图6所示，不仅对M2野生型病毒(A/HongKong/8/68)具有抑制作用，而且对 M2产生突变对金刚烷产生耐药病毒(A/Puerto Rico/8/34)也具有相同的抑制作用。最小抑制浓度大概为2μπι/πι1，而目前报道M2离子通道蛋白的抗体，仅14C2 (Zebedee和Lamb， J Virol 62 =27621988)在体外噬斑实验对流感病毒具有抑制作用，可是其仅能抑制A/ Udorn/72等M2离子通道蛋白无突变的流感病毒，并不是对不同的流感病毒株普遍有效。因此，我们筛选到M2-7AVHH抗体在体外具有广谱的抗流感病毒活性，对于开发广谱药物具有重要意义。5 :M2-7A VHH抗体对表达M2离子通道细胞的PH刺激的保护作用筛选得到的稳定表达M2离子通道蛋白的293细胞系，在四环素诱导下表达M2分子，在膜上形成M2离子通道。在低PH(pH5.4)刺激情况下，H+大量流入会对细胞造成损伤， 导致细胞死亡。而像金刚烷类药物可以阻断M2离子通道，因此可以起到对细胞的保护作用。M2-7AVHH抗体与细胞孵育结合半小时后，再用低PH缓冲液处理3小时，然后换成正常培养液，利用CCK-8试剂盒检测细胞活力。如图7所示，无论对于M2离子通道蛋白野生型细胞还是M2突变型细胞，M2-7AVHH抗体均能保护细胞的作用，而金刚烷胺只能对M2野生型细胞提供保护作用。结果和体外噬斑检测结果相符，进一步证明我们筛选到的M2-7AVHH 对流感病毒具有广谱的保护作用。而且结果提示M2-7A VHH可能是通过阻断或者干扰M2离子通道行使功能。但是由于M2-7A VHH与M2离子通道结合位置与金刚烷胺类药物不同， 因此作用机制可能有所不同，所以我们筛选到的M2-7AVHH也可以作为M2离子通道结构和功能研究的工具。6 在小鼠A型流感病毒模型中将M2-7AVHH抗体用于治疗性处理通过鼻内途径用30 μ 1的10LD50致死剂量的流感A/PR/8/34 (ATCC)感染麻醉的雌性Babl/c小鼠(8-10周龄)，在病毒感染后施用M2-7AVHH抗体，抗体治疗分为2组，分别在病毒侵袭之后1天，和侵袭之后1天、2天连续用药2次，每次以200 μ g/小鼠的剂量， 通过腹腔内注射施用M2-7AVHH抗体(每组10只小鼠)。对照组为同种型不相关的VHH和 PBS注射(分别每组10只)，用药后14天，每天观察小鼠体重变化和死亡情况。如图8所示，在对照组中，小鼠在感染之后7天内全部死亡，而在抗体组中，用药1 次，10只小鼠中的6只在病毒感染14天后仍然存活，在1天和2天连续用药2次后，10只小鼠中的8只在病毒感染14天后仍然存活。因此，抗-M2的M2-7AVHH抗体能显著提高受 A/PR/8/34病毒感染小鼠的存活率。小鼠每天体重观测表明小鼠体重在感染初期逐渐下降，7天之后又慢慢恢复，提示 M2-7AVHH抗体并不能完全抑制病毒的感染，可是能减轻病情严重性，其体重减轻也明显小于对照组。以上结果表明，在病毒感染后施用M2-7AVHH抗体治疗是有效的，这提示，此抗体可以用于预防和治疗用途。


本发明公开了一种针对流感病毒M2离子通道蛋白VHH基因工程抗体及其编码基因和在制备抗流感药物中的应用。该VHH基因工程抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。该抗体能特异性与流感病毒天然状态下M2离子通道蛋白分子结合，其对流感病毒M2野生型和金刚烷胺抗药株病毒都具有抑制作用。细胞存活实验提示其可能通过抑制M2离子通道功能行使作用。小鼠体内实验证实，被动免疫M2-7AVHH抗体对流感病毒攻击小鼠具有治疗性保护作用，能保护动物免受流感A/PR/8/34的致死剂量的侵袭。该抗体可用于开发抗流感病毒药物，如治疗患有流感或存在患流感的危险的受试者的药物。