专利名称：抑制miR-27b表达的化合物、含有该化合物的药物及应用的制作方法近几年来，心脏疾病的发病率呈逐渐升高的趋势，大多数心脏疾病患者最终会因为形成心衰而死亡，据世界卫生组织统计，心脏疾病已成为目前导致死亡的主要原因之一。 心衰的发生和发展是多种因素参与的复杂变化过程，心肌肥厚和心肌纤维化是其中重要的两个因素。心肌肥厚通常是在众多病理刺激下，如心肌缺血、高血压，心瓣膜缺陷等，心肌发生的肥大反应，主要表现为心室壁增厚，心肌细胞体积增大和某些胚胎期基因表达升高等。 尽管早期心肌肥厚代偿期被认为是心脏的一种适应性反应，有利与增强心脏的功能，但是心肌长期处于肥厚状态会导致心律不齐、心衰和心脏猝死。因此研究形成心肌肥厚的分子机制将有助于我们更好的了解心衰形成早期的机制，有利于心衰的早期诊断和防治，并可为临床上心脏疾病的基因治疗提供重要的靶标分子。近期的研究表明miRNAs在心脏疾病发生过程中也扮演着极其重要的角色。在横大动脉缩窄或过表达活性钙调神经磷酸酶(calcineurin)时，小鼠心脏组织中miRNA的表达发生变化，部分miRNA表达变化与人类衰竭心脏组织中的miRNAs变化相似，体内外实验表明其中一些miRNA的过表达足以诱发心肌细胞发生肥大。在TAC致小鼠心肌肥厚早期 miR-Ι表达水平明显降低，体外转染miR-1可以抑制ET-I引起的心肌肥厚。此外，在人类心肌肥厚标本和小鼠心肌肥厚模型中发现miR-133表达水平降低，体外过表达miR-133抑制心肌肥大的发生，miR-133的敲减可促进心肌肥厚的发生。另有两个研究小组利用基因敲除小鼠和转基因小鼠技术研究miR-208在心脏中的功能，发现miR-208在应激依赖的心肌细胞生长和基因调节方面起到重要的调节作用。除了在心肌肥厚中发挥功能外，还有一些miRNA被证实在调节心肌纤维化和心肌细胞凋亡方面发挥了重要作用。在病理性心肌肥厚中，miR-133和miR-30的表达水平降低，CTGF表达水平升高，容易发生纤维化改变，说明 miR-133和miR-30在调节心肌纤维化过程中发挥了重要作用。在急性心肌梗死中，miR-四家族分子表达水平下调。通过对其靶分子的分析发现其作用的靶分子多为纤维化相关蛋白，miR-四的下调使这些分子表达升高，导致纤维化的发生。这些研究表明miRNAs在心脏疾病中的确发挥了重要的功能。鉴于miRNAs在心脏中发挥的重要功能，近几年来，国内外研究者陆续开展了利用针对miRNA的调节来进行心脏疾病的治疗和预防，取得了一些良好的结果。目前应用较广泛的形式是Antagomir，Antagomir是根据microRNA成熟体序列而设计，经过特殊标记与修饰的单链RNA，专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。2008年有学者报导在心脏组织中利用Antagomir-21抑制miR-21的表达可有效地预防和治疗由压力性负荷升高引起的心肌肥厚和心衰。在小鼠中敲减miR-23a可预防异丙肾上腺素引起的心肌肥厚。体内应用 Antagomir-320可减轻由缺血-再灌注引起的心脏纤维化。最近又有两个国外的研究小组的研究结果显示miR-210和miR-494可作为治疗缺血性心脏疾病的新的治疗靶标分子。以往的研究显示miR_27b在发生心肌肥厚的小鼠模型及主动脉硬化的人类标本中表达水平明显升高，提示其在心脏疾病发生过程中可能发挥了重要的作用，但关于其在心脏中的具体功能尚未见报导。
本发明的目的是提供一种抑制miR_27b表达的化合物以及含有该化合物的药物。对miR-27b在心脏中的功能的研究发现miR_27b在心肌肥厚中发挥重要功能，而在体内抑制miR-27b的表达可以缓解由压力性负荷引起的心肌肥厚和心脏功能受损，说明 miR-27b可成为心脏疾病治疗新的靶标分子。为此，本发明提供了特异性抑制miR_27b表达的化合物在制备治疗心脏疾病的药物中的应用。其中，所述心脏疾病为心肌肥厚、心肌纤维化及其导致的心功能异常。本发明提供一种治疗心脏疾病的药物，其包括特异性抑制miR_27b表达的化合物。其中，所述化合物为小分子干扰核糖核酸、小分子干扰核糖核酸化学修饰物或在体内产生小分子干扰核糖核酸的载体等。优选地，所述小分子干扰核糖核酸为SiRNA或shRNA。优选地，所述siRNA的核苷酸序列为5，-GCAGAACUUAGCCACU⑶GAA-3，。优选地，所述载体为含有以5’ -GCAGAACTTAGCCACTGTGAA-3’为外源基因的表达盒的病毒载体。其中，所述病毒载体可用腺病毒载体。将所述的抑制miR_27b表达的病毒载体线性化，可获得线性双链DNA分子。线性双链DNA分子转染细胞可获得抑制miR-27b表达的病毒。该抑制miR_27b表达的病毒的基因组DNA为所述的线性双链DNA分子。本发明还提供了两种治疗心脏疾病如心肌肥厚、心肌纤维化及其导致的心功能异常的药物，其有效成分别为所述的抑制miR-27b表达的病毒和RNA抑制剂 (5，-GCAGAACUUAGCCACU⑶GAA-3，)。上述治疗心脏疾病的药物可通过静脉注射方式给药，腺病毒剂量为2. SXKTpfu， 仅注射一次；RNA抑制剂的剂量为80mg/kg/d并连续三天给予注射。本发明通过心肌细胞实验确定miR_27b在心肌肥厚中的功能，通过包装特异性抑制miR-27b表达的的腺病毒及合成的针对miR-27b的抑制剂，对TAC手术建立的压力性负荷引起心肌肥厚的小鼠模型进行治疗，结果显示这两种抑制剂均能有效地缓解TAC手术引起的心肌肥厚和纤维化，小鼠心室壁厚度明显变薄，心脏收缩功能也得到了明显的缓解，因此miR-27b可作为心脏疾病治疗新的靶标分子。图1体外心肌细胞尺寸测定结果。图2利用抑制miR_27b进行心脏疾病治疗的策略示意图。图3Ad-anti-miR_27b抑制效果的检测。图4TAC手术后小鼠心脏组织中miR_27b表达水平的检测。 图 5 利用 Ad-anti-miR-27b 和 Antagomir_27b 对 TAC手术小鼠进行治疗后 miR_27b表达水平的检测。图6利用Ad-anti-miR-27b对TAC手术小鼠进行治疗后心脏功能检测结果。图7利用Antagomir-27b对TAC手术小鼠进行治疗后心脏功能检测结果。图8利用Ad-anti-miR-27b对TAC手术小鼠进行治疗后心脏形态学观察及分子标志物检测结果。图9利用Antagomir-27b对TAC手术小鼠进行治疗后心脏形态学观察及分子标志物检测结果。图10利用Ad-anti-miR-27b对TAC手术小鼠进行治疗后心脏组织学观察结果。图11利用Antagomir-27b对TAC手术小鼠进行治疗后心脏组织学观察结果。图12利用Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b对TAC手术小鼠进行治疗后对 miR-27b靶分子PPAR- γ表达水平进行检测的结果。取Siam组，TAC组及TAC治疗组进行形态学观察发现，TAC手术组小鼠心脏较Siam 组心脏明显增大，而TAC治疗组的心脏较TAC组心脏明显减小，测量的心脏体重比值及心脏胫骨长度比值也反映了这一趋势。对这几组小鼠进行了 H&E，Masson和Laminin染色，结果显示TAC手术后小鼠的心肌细胞尺寸增加，纤维化明显增加，而应用Ad-anti-miR-27b或 Antagomir-27b治疗后的TAC组小鼠较TAC组小鼠相比，心肌细胞尺寸减少，心肌纤维化也明显减少。对小鼠进行功能检测也发现相似的趋势。本发明人通过Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b，对由TAC手术引起的压力性负荷导致的心肌肥厚小鼠模型进行治疗实验，发现这两种抑制剂能有效地降低由TAC手术引起的miR-27b表达升高并能有效地减轻由压力性负荷增加引起的心脏增大、心肌细胞尺寸增加、纤维化增加及心脏功能的受损，结果表明该miRNA有可能成为心脏疾病治疗新的靶标分子，而对其产生抑制作用的腺病毒或抑制剂将有可能成为心脏疾病治疗的新型药物。以下通过实施例进一步详细说明本发明。但是，这些实施例并不构成对本发明保护范围的任何限定。实施例1过表达miR-27b腺病毒的包装与细胞感染实验将包含miR_27b前体的基因序列连入pAcKTrack载体，经Riie I线性化后与 pAd-easy载体在BJ5183菌中进行重组，获得pAd_miR-27b。将获得的载体经I^ac I线性化回收后转染细胞获得过表达miR-27b的腺病毒(pAd_miR-27b)。将病毒扩增后按 IOOmoi感染心肌细胞48h，(同时以Ad-GFP作为阴性对照，以Ad-GFP感染同时加去氧肾上腺素(PE)处理的作为阳性对照)，通过免疫荧光染色和计量软件测量，分析miR-27b过表达对心肌细胞尺寸的影响，同时提取细胞RNA，反转录后检测肥大标志基因的变化。结果见图 1，显示了 miR-27b在体外促进心肌肥厚。实施例2敲低miR_27b腺病毒的包装与鉴定将包含成串的与miR_27b成熟序列反向互补序列，连入pAcKTrack载体，经Rne I 线性化后与pAd-easy载体在BJ5183菌中进行重组，获得pAd-anti-miR-27b。将获得的载体经I^ac I线性化回收后转染细胞获得敲低miR-27b的腺病毒Ad-anti-miR-27b。将获得的腺病毒Ad-anti-miR-27b扩增后感染分离的原代心肌细胞，48h后提RNA，进行miRNA northern blot的检测，见图3，发现这个腺病毒能成功地敲低miR_27b的表达。实施例3TAC手术模型的建立和miR_27b表达水平的检测(一)手术模型的建立1、使用0. 125%三溴乙醇将动物麻醉，并对小鼠进行气管插管；2、将小鼠移到解剖台进行手术，固定四肢及小鼠尾部；3、在显微镜指导下，沿小鼠胸骨剪开胸腔，使用开胸器扩张并固定一个小切口，便于后面的结扎手术；4、分离出心脏升主动脉，使用沈号标准marker，在升主动脉周围进行结扎，引起压力性负荷增加；关闭胸腔，将小鼠放在保温台上直至苏醒；5、对照组小鼠进行同样的手术操作，但不进行升主动脉结扎。(二)miR_27b表达水平的检测1.组织总RNA的提取(1)将小鼠心脏组织IOOmg放入aiil Trizol中，用勻浆器进行勻浆，于室温培养5分钟。(2)加入0.細1氯仿，盖紧瓶盖剧烈振荡15秒，放置2-3分钟。2-8 ， 10000-12000g 离心 15 分钟。(3)将上层水相转移到一个新的离心管中，加入0. 5ml异丙醇，混勻，室温放置10 分钟，2-8°C ,10000-12000g 离心 10 分钟。(4)弃上清，加入至少anl 75%的异丙醇洗涤，2-8で，不大于7500g离心5分钟。(5)弃上清，空气干燥5-10分钟，加入无RNase的水500 ill，反复抽吸使RNA溶解。(6) 55-60で保温10分钟，-70で冰箱储存备用。2. miRNA Northern 杂交检测 miR-27b 的表达(1)材料准备180で烤器皿三角锥瓶、量筒、镊子等大于6小吋；电泳槽清洗梳 子和电泳槽，并用3%双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用；处理DEPC水OL)备用。(2)样品处理25 U g总RNA加上样缓冲液(1:1)，煮沸5分钟，冰浴2分钟，12000 转离心30秒。(3)电泳15%PAGE/8M尿素/0.5XTBE;电流30mA;时间1小时左右，蓝色到 底。电泳缓冲液0.5XTBE。(4)染胶用0. 5XTBE加EB进行染胶(专用皿)，RT lOmin。(5)转膜半干法，电流200mA ；时间30分钟；顺序擦干净，从下面起三层滤纸+ 膜+胶+三层滤纸；赶气泡。(6)固定转膜后放在滤纸上瞭干，紫外交联2次，杂交炉80で烤1小吋，保鲜膜封存。(7)预杂交预杂交液于65で融化；膜置于TBE中，然后放入已倒入半瓶TBE的杂 交瓶中，然后倒出TBE，使膜紧贴在管壁上；放入杂交液anl (最少anl，锋10cm7ml)；杂交 炉37で，预杂交2个小时以上。标记探针
探针1 ILil (浓度lOpmol)
PNK缓冲液 1 ILil
PNKinase 1 |li1
ddHsO:2 ILil
p32(同位素)5 ILil离心后，37°C反应1小时(8)探针纯化G-25层析柱，振摇柱子使介质落入管中，折断尾巴，轻轻开盖， 3800rpm(IOOOg)离心1分钟；将探针混合物加到柱子中间，3300rpm(IOOOg)离心4分钟。(9)杂交将纯化后的探针放入杂交瓶，37°C杂交过夜。(10)洗膜洗膜液OXSSC/0. 1% SDS)，37で在杂交炉中，2次，锋次20-30分钟。(11)压片，显影。①PAGE混合物(300ml配方)
丙烯酰胺42.56 g
亚甲双(bis) 2.24 g
尿素144 g
ΙΟχΤΒΕ:30 ml
ddH20:到 300 ml②尿素PAGE胶(每块胶配方):PAGE 混合物 6ml10% AP 30 μ 1TEMED 6 μ 1③20 X SSC(ILmS)NaCl 175. 3g柠檬酸钠88. 2gHCL调pH值到7. 0，水定容至1L。结果见图4和表1。表1统计结果表明TAC手术后2w，小鼠出现明显的心肌肥厚， 图4结果说明与Siam手术组相比较，TAC术后Iw和2w时，miR_27b表达水平明显升高。表ITAC术后2w小鼠心脏超声检测结果
TAC术后2w
假手术组侯选用于生理盐水处理组侯选用于 Ad-anti-miR-27b 处理组侯选用于 Antagomir-27b 处理组N=IlN=9N=4N=5左心室舒张末期内径,mm3.75 土 0.083.77 ±0.083.77 ±0.043.64 土 0.12左心室后壁舒张末期厚度mm0.67 土 0.020.85 ±0.03 *0.82 ±0.20*0.89 土 0.05 *左心室收缩末期内径,mm2.76 土 0.102.74 ±0.082.68 ±0.012.58 ±0.11左心室后壁收缩末期厚度,mm1.02 土 0.031.17 ±0.04*1.15 ±0.02*1.25 土 0.06*左心室前壁舒张末期厚度,mm0.67 土 0.020.84 ±0.02*0.81 ±0.01 *0.88 土 0.04*左心室前壁收缩末期厚度,mm1.04 土 0.021.19 ±0.03*1.25 ±0.03 *1.22 土 0.07*左心室舒张期容积,mm60.76 ±3.1961.11 土 3.1460.87 土 1.3955.98 ±4.43左心室舒张期容积,mm29.08 ±2.7528.44 土 1.9426.58 土 0.3224.39 ±2.42射血分数,％52.75 ±2.6153.59 土 1.7356.26 土 0.9556.48 ±2.57缩短分数,％26.78 ± 1.5627.21 土 1.0928.86 土 0.6429.02 ±1.64左心室质量,mg66.56 ±2.9292.51 土 5.81 *87.00 土 0.77"92.44 ±5.03"*P < 0.05(代表与Sham组相比较)。实施例4将Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b分别导入TAC手术后小鼠体内后检测miR-27b表达水平的变化具体实验设计如下共取小鼠28只，其中11只小鼠是Siam手术组，其余17小鼠为TAC手术组。将TAC手术组小鼠随机分为Saline (生理盐水组，8只)，Ad-anti-miR-27b组G只)及Antagomir-27b组(5只)，按照图2中的实验策略进行处理。(Siam手术组亦同时给予生理盐水进行处理)。(一)小鼠尾静脉注射1、将小鼠固定好，将尾巴拉直，绷紧；2、用酒精棉球擦拭尾巴，使血管扩张；或者用热水或者热毛巾焐热，使静脉扩张； 选用适当的针头，越细越好；在尾部较靠近上段的地方注射(此处血管较粗)。用酒精或热水擦拭，擦拭的时候，可把尾巴用力扯在桌面上。注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉；3、用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾巴固定；4、注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，尾巴与桌边紧贴转弯处为进针部位，一般选择距尾尖1/4或1/3处进针，此处皮肤较薄，血管清晰，进针容易；5、通过看有无回血来测试针是否在静脉内；6、注射 Ad-anti-miR-27b 和 Antagomir_27b。腺病毒剂量为 2. 5 X 10lclpfu，只需注射一次，RNA抑制剂的剂量为80mg/kg/d并连续三天进行注射。( 二 ) Northern blot 检测 miR_27b 表达情况方法同实施例3，结果见图5，说明Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b均能有效地降低由于TAC手术引起的miR-27b表达水平的升高。实施例5利用腺病毒和抑制剂对TAC手术小鼠进行治疗后心脏功能检测对实施例4的几组小鼠用三溴乙醇胺麻醉后，剔去胸前区的被毛，利用带有 12-MHz微型探头的Vivid 7超声检测仪(GE公司)进行心脏M型超声的检测。结果见图6、7和表2。图6和图7的结果显示TAC手术后2w小鼠出现明显的心肌肥厚和心脏功能受损，几个代表性数据如左心室舒张末期厚度(LVPWd)增加，缩短分数 (FS)降低，左心室质量(LVM)增加。在随后经过不同因素处理后3w再进行检测发现，给生理盐水组小鼠心肌肥厚程度进一步加重(见LVPWd及LVM值)，心脏收缩功能进一步受损 (见FS值)，而经Ad-anti-27b或Antagomir_27b治疗后可有效地降低LVPWd和LVM，而FS 值的降低也得到了有效地缓解。其他的测量指标见表2。表2小鼠治疗后心脏超声检测结果


本发明涉及特异性抑制miR-27b表达的化合物及含有该化合物的药物，所述化合物在体内生成的功能性分子的核苷酸序列为5’-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3’。在体内抑制miR-27b的表达能缓解由压力性负荷引起的心肌肥厚和心脏功能受损。本发明通过心肌细胞实验确定miR-27b在心肌肥厚中的功能，通过包装特异性抑制miR-27b表达的腺病毒及合成针对miR-27b的抑制剂，对TAC手术建立的压力性负荷引起心肌肥厚的小鼠模型进行治疗，发现分别利用以上两种抑制剂对TAC术后小鼠进行处理后，能有效地缓解TAC手术引起的心肌肥厚和纤维化，心室壁厚度明显变薄，心脏收缩功能也得到了明显的缓解。