专利名称：miRNA-29表达拮抗剂及其在预防和治疗主动脉瘤中的用途的制作方法miRNA-29表达拮抗剂及其在预防和治疗主动脉瘤中的用途发明领域本发明涉及微RNA (miRNA-29)的表达和/或功能的拮抗剂，其用于预防和/或治疗主动脉瘤。还公开了用于鉴定miRNA-29拮抗剂的方法、包含所述miRNA-29拮抗剂的药物组合物以及用于在需要这类治疗的个体中预防和治疗年龄相关性主动脉瘤形成的方法。发明背景目前，人类寿命的延长遇到年龄相关的心血管疾病的患病率增加的代价(Lakatta EC. Age-associated cardiovascular changes in health:impact on cardiovascular disease in older persons. Heart Fail Rev. 2002; 7:29-49)。具有高死亡率的一种具体疾病状态为主动脉瘤形成以及后续的主动脉血管破裂。主动脉瘤(AA)是典型的年龄相关疾病，其影响约9%的老年人并导致大量的死亡(Singh K, Bonaa KH, Jacobsen BK, Bjork LjSolberg S. Prevalence of and Risk Factors for Abdominal Aortic Aneurysms in a Population-based Study:The Tromso Study. Am J Epidemiol. 2001;154:236-244) AA的发生率仍在增加，意味着诸如通过针对血压的目前主要的预防性医疗保健策略在降低AA方面不是显著有效·的。外科手术目前是先进的治疗；然而，这种外科手术介入与显著的发病率和死亡率相关，例如，由于大的术前和术后死亡率，仅10-25%的患者幸免于破裂。在机械学水平上，人类病理学部分的分析表明AA的形成和破裂特征在于血管壁的变薄。细胞外基质的形成降低或破坏被认为是导致血管壁变薄的关键病理生理学过程 (Guo DC, Papke CL, He R, Milewicz DM. Pathogenesis of thoracic and abdominal aortic aneurysms. Ann N Y Acad Sci. 2006;1085:339-352).微RNA(miRNA)目前已经显现为多个(病理)生理学过程的关键调节剂。miRNA 是短的非编码RNA，其通过诱导靶mRNA的降解或通过阻断蛋白翻译而调节蛋白的转录后表达。miRNA被表达为折叠成莖环结构的前体转录本。随后,前体miRNA通过Drosha和Dicer 核酸酶而被消化，从而产生成熟miRNA双链体，其然后被引入miRNA相关的RNA诱导的沉默复合物(RISC)。然而，成熟miRNA仅一条链被保留在复合物中，并且将提供与靶mRNA的结合。沉默的基因转录本内的靶序列区域主要发现位于各自mRNA的未翻译区域；miRNA优选在它们的靶mRNA的3’未翻译区域中结合，并且促进翻译抑制或mRNA降解。然而，各种研究表明特异性miRNA控制血管生长和心功能(Urbich C，Kuehbacher A,Dimmeler S. Role of microRNAs in vascular diseases;inflammation,and angiogenesis. Cardiovasc Res. 2008; 79:581-588) ,miRNA 在 AA 形成和动脉粥样硬化斑块破裂中的参与以及年龄对血管miRNA表达的影响是未知的。围绕miRNA29的微RNA家族已知为心组织中纤维化的关键调节剂。WO 2009/018493表明miRNA-29家族的成员，即miRNA_29a、b和c在对应激反应的心脏组织中下调，并且在耐受应激和纤维化的小鼠的心脏组织中上调。然而，在WO 2009/018493中未公开主动脉瘤形成。同样，WO 2008/042231公开了 miRNA表达在心脏疾病中的治疗启示。发现在心肌细胞中的改变的miRNA表达引起对心力衰竭中各种基因转录的广泛影响。例如，miR-1调节调钙蛋白表达水平。预期的miR-1靶标包括多个能引起心力衰竭发病机理的靶标，其中， Calml和Calm2为心脏中的主要调钙蛋白异构体。该申请建议使用在受累心脏组织中特异性表达的miRNA作为治疗靶标。WO 2009/018493公开了 miR_29a至c拮抗剂作为促纤维化作用剂的用途，其使脉管系统中的软斑块转化为纤维化组织以防止心肌梗死。
多个其他的微RNA为心脏疾病起始中的关键调节剂。Silvestri等人评论了 MiR-29参与心肌梗死后的纤维化反应，而miR-21可以在血管成形后再狭窄中发挥重要作用。MiR-208参与心力衰竭中收缩蛋白向胚胎基因表达模式的改变。MiR-I 影响在心肌梗死之后对心律失常的易感性(Silvestri P等人，MicroRNAs and ischemic heart disease:towards a better comprehension of pathogenesis,new diagnostic tools and new therapeutic targets. Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2009Jun;4(2) : 109-18)。
miRNA-29在心肌梗死中的表达是研究吡格列酮(PPAR-Y激动剂)针对心肌缺血再灌注损伤的保护性作用的起始点。在向大鼠给予吡格列酮之后，miRNA-29a和 miRNA-29c显著较少地表达。有趣地,miRNA_29a和miRNA_29c的微RNA拮抗剂(antagomir) 显著降低经过IR损伤的心脏中的心肌梗塞尺寸和细胞凋亡。这可能是由于心脏中抗凋亡因子(Mcl_2)的表达增加(Ye Y,等人，Down-regulation of microRNA-29by antisense inhibitors and a PPAR-{gamma}agonist protects against myocardial ischemia-reperfusion injury, Cardiovasc Res. 2010Feb 17)。此夕卜，Golledge 等人 (在 Golledge J,等人 Peroxisome proliferator-activated receptor ligands reduce aortic dilatation in a mouse model of aortic aneurysm. Atherosclerosis.2010 May; 210 (I) : 51-6. Epub20090ct 29.中)公开了骨桥蛋白与人类腹主动脉瘤(AAA)相关，并且在体外研究中，暗示了通过过氧化物酶体增殖物-激活的受体(PPAR)连接来下调该细胞因子。同样，Jones等人(在Jones A,等人Rosiglitazone reduces the development and rupture of experimental aortic aneurysms. Circulation. 2009Jun 23; 119 (24) : 3125-32. Epub 2009Jun 8.中)公开了罗格列酮，即过氧化物酶体增殖物-激活的受体-Y激动剂，降低动脉瘤扩张或破裂。使用罗格列酮的预治疗或后治疗降低小鼠模型中的主动脉扩张和破裂。使用罗格列酮预治疗的动物中的损伤降低伴随着炎症介质的表达降低。描述需要阐明准确机制的其它研究。然而，在这些公开中，配体或罗格列酮或吡格列酮的作用完全与本发明涉及的机制无关。
尽管没有药物治疗被认证并可用于治疗主动脉瘤形成、风险因子修饰以及预防性治疗，但在最近的15年里，使用他汀类药物和ACE抑制剂已经降低由于动脉粥样硬化而导致的死亡率。然而，更重要地，由于寿命期望的增加和总人群的年龄增加，所以预期年龄相关的疾病，例如动脉瘤形成将进一步随时间而增加。因此，迫切需要有效的治疗。治疗性干扰异常的血管重构的目前尝试集中于改良与血管壁结构的改变相关的炎性反应。然而，没有一种治疗选择修饰血管壁的组织弱化。阻断胶原_降解蛋白酶的特异性介入或炎性细胞募集的抗体导向抑制结果是不成功的。
发明概述
根据上述现有技术以及目前用于主动脉瘤的预防性或治疗性策略的限制，本发明的目的在于提供用于预防和/或治疗在老年人中常诊断出的主动脉瘤的新型诊断和治疗策略。
在第一方面，通过用于预防和/或治疗哺乳动物、优选人类的主动脉瘤形成的 miRNA-29表达和/或功能拮抗剂来解决上述问题。通过使用生物信息学方法，发明人惊讶地发现与年轻小鼠相比，mir-29家族(mir-29a、b和c)为本发明环境中所研究的20个调节的miRNA中功能性影响年老小鼠的主动脉中的mRNA水平的唯——个。
主动脉瘤形成由胶原、原纤维蛋白的分解，血管平滑肌细胞的凋亡，以及炎性细胞的募集诱发。
本发明所述的拮抗剂特别可用于预防与动脉血管弱化有关的疾病和事件，例如急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、周围动脉闭塞性疾病、缺血性发作、主动脉瘤形成和主动脉破裂。优选地，本发明的拮抗剂用于预防和/或治疗疾病状态，包括i)由于动脉粥样硬化而产生的主动脉中的动脉瘤形成；ii)由于遗传因素而产生的主动脉中的动脉瘤形成，例如在马凡氏综合征中；iii)在患有二叶式主动脉瓣形成的患者中的主动脉瘤形成；以及iv) 年龄依赖性主动脉瘤形成。因此，在一个实施方案中，所述主动脉瘤形成能在年老哺乳动物中发生，由此为年龄相关性的。在另一实施方案中，所述主动脉瘤形成能由于遗传状态而发生和/或为疾病相关性的。两种实施方案还能同时发生。
在本发明语境中的术语“主动脉破裂”涉及其中主动脉(身体中最大的动脉)由于扩张而撕裂或破裂的疾病状态，特别是由于主动脉瘤的缘故或由于动脉粥样硬化斑块的形成。
在本发明语境中的术语“预防”应理解为旨在避免负面事件发生的医疗介入，所述负面事件很可能导致患有疾病的患者的疾病状态的恶化或者健康和/或生病个体的损伤或死亡。
在一个实施方案中，miRNA-29表达和/或功能拮抗剂用于主动脉瘤(AA),所述主动脉瘤特征在于由于血管壁变薄而产生的主动脉的局部扩张。
因此，在另一实施方案中，本发明的拮抗剂用于预防和/或治疗年龄相关性主动脉瘤，其中所述主动脉瘤(优选年龄相关性的)还涉及主动脉组织中的细胞外基质蛋白的基因下调，所述细胞外基质蛋白例如胶原、原纤维蛋白或弹性蛋白，所述基因例如COLl Al、 COLl A2、C0L1 A3、ELN 和 / 或 FBNl。
在本发明的又一实施方案中，miRNA-29的表达和/或功能的拮抗剂选自 miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA_29c的表达和/或功能的拮抗剂,特别是miRNA_29b的表达和/或功能的拮抗剂。
本发明的拮抗剂在另一实施方案中为选自以下的拮抗剂反义DNA-和/或 RNA-寡核苷酸、反义2’-0_甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰键的反义寡核苷酸、包含锁核酸 LNA 碱基的反义寡核苷酸、吗啉代反义寡核苷酸、PPAR- Y激动剂、微RNA拮抗剂及其混合物。
因为miRNA通过沃森-克里克碱基配对而靶向它们的mRNA，因此优选地，miRNA-29 的拮抗剂为反义寡核苷酸，其与miRNA互补并且与内源mRNA靶标竞争性地与miRNA碱基配对。对于本发明的目的，反义寡核苷酸的序列与miRNA-29(a至c)的补体和/或其种子序列为50%相同，优选为与miRNA-29 (a至c)补体和/或其种子序列60%、70%、80%、90%或 95%相同，并且最优选为100%相同。此外，特别优选地，反义寡核苷酸被化学地修饰以改善反义寡核苷酸和miRNA之间的双链体的热稳定性。优选的化学修饰包括例如，双环高亲和性RNA类似物，其中糖-磷酸主链中的呋喃糖环通过引入2’ -O, 4’ -C-亚甲基桥(LNA -antimiR)而化学地锁在RNA模拟N-型构象中。其它的优选化学修饰的寡核苷酸包括吗啉代(morpholinos)寡核苷酸、2’ -O-甲基寡核苷酸、2’ -O-甲氧基乙基寡核苷酸，以及胆固醇结合的2’ -O-甲基修饰的寡核苷酸(微RNA拮抗剂)。
在本发明语境中的拮抗剂还包括能通过抑制微RNA表达或通过抑制微RNA的沉默功能而抑制miRNA-29的任何物质。因此，干扰微RNA途径的任何化合物能够为本发明的拮抗剂，例如通过抑制蛋白Pasha、Drosha、Dicer或Argonaut家族蛋白的功能。此外，抑制前体微RNA或miRNA-29的任何化合物，例如聚合酶II或III的抑制剂，为miRNA-29表达的候选拮抗剂。成熟miRNA还用作设计miNRA-29功能抑制剂的靶标。具有与微RNA精确的或错配的互补性的核酸可以用于抑制或竞争内源miRNA-29与其靶mRNA的结合。如何设计这类miRNA抑制剂在本领域中公知。
在另一实施方案中，通过药物-洗脱支架或通过气球向动脉组织给予本发明的拮抗剂。优选地，药物洗脱支架或气球由生物可吸收材料制成。应理解，任何适于将药物局部递送入血管内部的装置可用于本发明的环境中。
通过用于鉴定miRNA_29a至c拮抗剂的方法，在另一方面解决本发明的目的，所述方法包括
(a)使细胞与候选化合物接触；
(b)评价miRNA_29a至c活性或表达；以及
(c)将步骤(b)中的活性或表达与不存在候选化合物下的miRNA_29a至c的活性或表达进行比较，
其中，与步骤(c)相比，在步骤(b)中测量的miRNA_29a至c活性或表达的下降表示候选化合物为miRNA-29a至c的拮抗剂。
合适的细胞能选自血管壁细胞、主动脉起始细胞或源自哺乳动物血管的其他细胞，例如，优选为内皮细胞(EC)和/或平滑肌细胞(SMC)，其在其他优选的实施方案中重组地或固有地表达或优选地过表达基质基因，例如，胶原、原纤维蛋白或弹性蛋白的基因，例如 COLl AUCOLl A2、C0L1 A3、ELN 和 / 或 FBNl。
在其他实施方案中，本发明的方法包括使细胞与候选化合物在体外和/或体内接触。
又一实施方案则涉及本发明的方法，其中所述候选化合物为蛋白、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。
在其他实施方案中，评价miRNA_29a至c的表达包括Northern印迹法或RT-PCR。 然而，用于鉴定和量化微RNA的许多技术在本领域中已知。除了 Northern印迹法或PT-PCR， 评价微RNA表达能通过微RNA表达阵列、荧光核酸探针(例如与膜或珠结合的)、以及基于抗体的测定系统而进行。在间接方法中，还通过体外或体内报告基因测定来进一步测量微 RNA的活性。例如，本领域技术人员能在没有掌握本发明技能的情况下设计基于miRNA-29 家族的种子序列的报告基因测定，其允许简单筛选候选miRNA-29拮抗剂。在这类方法中，miRNA的靶序列能被引入所选报告基因的3’或5’未翻译区域。该miR-敏性构造则转化为合适的细胞表达系统，其随后开始与候选化合物接触。在与对照样本中报告基因的活性比较下，与化合物接触的样本中报告基因的活性产生与测试化合物的抑制作用相关的信息。
在另一实施方案中，本发明的用于鉴定miRNA29a至c拮抗剂的方法包括评价由 miRNA-29a至c调节的基因的表达或活性，例如，胶原、原纤维蛋白或弹性蛋白的基因，例如，COLl AUCOLl A2、C0L1 A3、ELN 和 / 或 FBNl。
在本发明另一方面中，通过包含miRNA-29、特别是miRNA_29a至c的拮抗剂的药物组合物解决上述问题。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包括选自以下的 miRNA-29拮抗剂反义DNA-和/或RNA-寡核苷酸、反义2’_0_甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰键的反义寡核苷酸、包含锁核酸LNA 碱基的反义寡核苷酸、吗啉代反义寡核苷酸、 PPAR- Y激动剂、微RNA拮抗剂及其混合物，特别是miRNA-29a至c的微RNA拮抗剂。在特别优选的实施方案中，miRNA-29a至c拮抗剂包括与miRNA_29a、miRNA_29b、miRNA-29c或其组合的成熟序列互补的序列。
尽管可能地，对于治疗用途，miRNA_29a至c表达和/或功能的拮抗剂可以以化学原料的形式而给予，但优选以药物组合物的形式提供活性成分。因此，在其他方面，本发明提供了药物组合物，其包含与药物可接受的载体和/或赋形剂相联合的miRNA-29a至c表达和/或功能拮抗剂或其药物可接受的衍生物。载体和/或赋形剂必须在与制剂的其他成分相容且对其接受者无害的含义上为“可接受的”。
在其他方面，通过预防和/或治疗有需要的个体中的主动脉瘤形成的方法来解决本发明的目的，所述方法包括下列步骤
(a)确定患有主动脉瘤的个体；以及
(b)向所述个体给予miRNA-29表达或功能拮抗剂。
在本发明的语境中需要预防和/或治疗主动脉瘤形成的个体优选为哺乳动物，更优选为人类，其被诊断患有主动脉中的动脉瘤。此外，还包括具有发展主动脉瘤的增加的风险的个体，优选哺乳动物，更优选为人类。
在一个实施方案中，本文上述所公开的方法是优选的，其中miRNA-29拮抗剂选自反义DNA-和/或RNA-寡核苷酸、反义2’ -O-甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰键的反义寡核苷酸、包含锁核酸LNA 碱基的反义寡核苷酸、吗啉代反义寡核苷酸、PPAR- Y激动剂、 微RNA拮抗剂及其混合物，并且特别选自miRNA-29a至c的微RNA拮抗剂。在特别优选的实施方案中，miRNA-29a至c的拮抗剂包括与miRNA_29a、miRNA_29b、miRNA-29c或其组合的成熟序列互补的序列。
在接下来的实施方案中，预防和/或治疗有需要的个体中的主动脉瘤的方法是优选的，其中通过肠胃外给药或直接注射进主动脉组织来给予miRNA-29拮抗剂。拮抗剂的这类给药优选包括口服给药、经皮给药、缓释给药、控释给药、延时释放给药、栓剂给药、导管给药、药物_洗脱支架给药、气球给药或舌下给药。
在其他实施方案中，本发明的预防和/或治疗主动脉瘤形成的方法包括向所述个体给予第二治疗。优选地，所述第二治疗选自引入支架或气球。更优选地，所述第二治疗与 miRNA-29拮抗剂同时给予，或其中所述第二治疗在miRNA-29之前或之后给予。
优选本发明的预防和/或治疗年龄相关性主动脉瘤形成的方法的其他实施方案，其中在给予miRNA-29拮抗剂之后，在所述个体中改善了血管壁变薄和/或细胞外基质蛋白形成降低或破坏的一个或多个症状。
下列附图
和实施例仅用于阐述本发明，而不应解释为将本发明的范围限制在实施例所述的本发明具体实施方案中。对于本发明的目的，所引用的所有参考以其整体形式通过引用并入本文。
本发明的实施例涉及附图，其中
图I表示miRNA和mRNA表达的生物信息学分析，以鉴定靶向mRNA表达的miRNA。 (A)使用6核苷酸长度的字段的Sylamer图片。具有最高峰的“字段”反应了 miRNA-29种子序列。(B)miRNA分数的柱状图。分数如下


本发明涉及微RNA(miRNA-29)的表达和/或功能的拮抗剂，其用于预防和/或治疗主动脉瘤。还公开了用于鉴定miRNA-29拮抗剂的方法、包含所述miRNA-29拮抗剂的药物组合物以及用于在需要这类治疗的个体中预防和治疗年龄相关性主动脉瘤形成的方法。