专利名称：一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用的制作方法原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补原则，将标记的DNA或RNA探针与经过变性后的单链DNA片段或组织、细胞上特定的核苷酸序列，在适宜条件下结合形成专一的核酸杂交分子，再经过相应的检测手段，将待测核酸在染色体、组织或细胞上的位置显示出来。原位杂交技术是由Gall和Parue (1969)利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交首次获得成功。随着植物染色体制备技术的改进，Rayburn(1985)最早将非放射性检测系统应用到植物染色体原位杂交。目前，该技术在基因定位、多倍体起源、非整倍体鉴定以及系统进化和亲缘关系等方面均得到广泛应用。 现有的原位杂交探针包括DNA探针、寡聚核苷酸探针、RNA探针,这些探针需要信号级联放大反应才能观察结果，而且要有一定的Tm值才能保证实验的正确性和准确性。而且为了增强信号，目前多采取长的核酸序列做为探针的靶向序列或采用信号扩大系统。miRNA是短的非编码的RNA，是致癌基因或抑癌基因的潜在调节子。RT-PCR、Northern印迹法以及生物芯片可以检测miRNA的表达量,但是并不能检测在单个细胞中miRNA的表达也不能在原位研究moRNA的表达，达到研究miRNA在癌细胞增殖或凋亡的机制的目的。为了验证miRNA表达的特异性以及它在癌细胞或癌组织中的定位，需要进行原位杂交。针对miRNA，因为miRNA的片段长度在18 — 22nt范围内，比较小，Tm值比较小不能满足原位杂交的需要，以上方法均不能很好的解决这些问题。目前，为了解决Tm值偏小，丹麦的一家公司生产检测miRNA的探针，他们的探针是将碱基五碳环上2’氧4’碳亚甲基连接，然后人工合成，该方法有效提高了 Tm值，但是其售价昂贵。
为克服上述技术缺陷，并降低经济成本，本发明的目的是提供一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。为实现上述目的，采用如下的技术方案本发明提供了一种miRNA的原位杂交探针，所述杂交探针的碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。修饰的探针是其大部分碱基进行2-F修饰，即在第2位碳原子上修饰一个氟原子，提高Tm值；用长18-22nt的序列和microRNA互补作为探针将修饰后的RNA合并到到探针中。其中，修饰位点如下式本发明提供了一种miRNA的原位杂交探针及其检测试剂盒和应用。杂交探针的碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。优选序列如SEQ ID NO:1，其中第3、6、15、20个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。另一优选序列如SEQ ID NO:2，其中第3、8、13、21个碱基五碳环第2位碳原子修饰了氟原子。探针的5’和3’端修饰地高辛。本发明还提供了一种含有上述杂交探针的miRNA的原位杂交检测试剂盒。本发明的探针可以分别应用于制备肺癌细胞系或肺癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中和制备食管癌细胞系或食管癌组织的miRNA原位杂交检测试剂盒中。本发明的试剂盒价格比较便宜，具有较好的特异性。