专利名称：核酸探针固定化基体和用其检测标记的核酸存在的方法近年来伴随着基因工程学的发展，在医疗领域内已能利用基因进行疾病诊断和预防。这些称之为基因诊断。例如通过检测形成疾病原因的人类基因缺陷和变化，可在疾病发症前或者极早期阶段进行该疾病的诊断和预测。开展了对人类染色体组破译，及基因类型与疾病相关连的研究，与各种人的基因类型相吻合的治疗(テ一ラ一メイド医疗)也正在成为现实。因此，简便地进行基因的检测、和基因类型的确定是极为重要的。在这种基因解析中尤为引人注意的是一般称作DNA切片或DNA微阵列的装置(此处将两者统称为DNA切片)。DNA切片是具有将由多种碱基基序列构成的多个核酸探针固定在基板上的装置。通过使用这样的DNA切片，在一次试验中，可检测出多种的标记的核酸。然而，具有这样的长处，另一方面，存在于试料中不同标记的核酸的杂交效率不同，有时根据情况，只能得到非常低的杂交效率。发明公开鉴于上述状况，本发明的目的是提供可以高效率进行杂交的探针固定化基体。上述目的，通过如下本发明的形态即可达到。即，(1)核酸探针固定化基体，具有基体，和通过间隔基固定在上述基体上并含有与标记的序列互补的碱基基序列的核酸探针，其特征是，上述间隔基是如下的间隔基，即，将其长度取为X，对于上述核酸探针在其一部分含有上述标记的序列的标记的核酸进行杂交时，从该杂交部位的基体侧末端到上述标记的核酸的基体侧末端的长度取为Y时，X≥Y的关系成立。(2)使用了上述(1)记载核酸探针固定化基体检测标记的核酸存在的方法，包括如下工序，即，使用选择的引物，使其X和Y满足X≥Y的关系，对试料核酸进行扩增的工序、在获得适当杂交的条件下，使利用上述扩增得到的扩增产物，与固定在上述(1)中记载的核酸探针固定化基体上的核酸探针进行反应的工序、和通过检测利用上述反应工序生成的杂交，判断在试料核酸中存在标记的核酸的工序；和(3)核酸检测方法，在使用具有基体、和固定在上述基体上，并含有与标记的序列互补的序列的核酸探针的核酸探针固定化基体，检测含该标记的序列的标记的核酸的方法中，包括以下步骤(a)在用标记的序列将该标记的核酸与上述核酸探针进行杂交时，准备用于扩增该标记的核酸的引物，使上述标记的核酸的末端位于从该标记的序列部位的基体侧末端部到40碱基以内，(b)使用上述(a)中准备的引物，将试料核酸扩增，(c)将上述(b)中得到的扩增产物形成一个链，(d)将上述(c)中得到的一个链与上述核酸探针进行反应，(e)通过检测上述(d)中生成的杂交，检测出该试料核酸中标记的核酸的存在。图1A是表示本发明核酸探针固定化基体一例的平面图，图1B是沿图1A中B-B线剖切的剖面图。
图2是表示本发明核酸探针固定化基体一例的图。
图3是表示核酸探针和标记的核酸结合状态的图。
图4是实施例中表示所用核酸探针和标记的核酸的模式图。
图5是表示X和Y的关系曲线图。
图6A是实施例中表示所用的含各种间隔基的核酸探针与标记的核酸结合状态的图，图6B是实施例中表示根据进行试验所得结果的图。
图7A是实施例中表示所用的含各种间隔基的核酸探针与标记的核酸结合状态的图，图7B是实施例中表示根据进行试验所得结果的图。
图8A是实施例中表示所用的含各种间隔基的核酸探针与标记的核酸结合状态的图，图8B是实施例中表示根据进行试验所得结果的图。
图9是实施例中表示所用扩增片段与核酸探针的关系图。
图10是实施例中表示根据进行试验所得结果的曲线图。
图11是实施例中表示所用扩增片段与核酸探针的关系图。
图12是实施例中表示根据进行试验所得结果的曲线图。
图13是实施例中表示根据进行试验所得结果的曲线图。
实施发明的最佳形态1.发明概要本发明基本上是具有基体和通过间隔基固定在上述基体上核酸探针的核酸探针固定化基体。本发明就是基于本发明者们的如下发现，即，利用特定间隔基的长度，可有效地获得好的杂交。
即，在根据本发明形态的核酸探针固定化基体中，通过如下间隔基，使核酸探针对基体进行固定。即，将间隔基的长度取为X，对于上述核酸探针，其一部分上含有上述标记的序列的标记的核酸杂交时，从该杂交部位的基体侧末端到上述标记的核酸的基体侧末端的长度取为Y时，X≥Y的关系成立。
根据本发明形态的核酸探针固定化基体的测定原理如下。该核酸探针设计具有与标记的序列互补的序列。试料核酸中存在标记的序列时，在该核酸探针固定化基体上产生杂交。因此，本发明的装置，基本上通过检测该杂交的结果存在产生二个链核酸，或者通过检测存在与该核酸探针进行杂交的核酸，即可检测出存在于试料核酸中的标记的序列。此处使用的“检测杂交”术语，是总括起来表示检测产生的二个链核酸、或者预先利用某种标识物质对试料核酸进行标识中，检测杂交后来自该标识物质的信号，或者利用其自身公知的其他方法，根据反应检测二个链核酸的存在或杂交的产生的术语。
这种杂交的检测，例如可利用下述的电化学检测或荧光检测进行。
这种电化学的检测时，核酸探针固定化基体，基本是对于配置在基体上可检测电化学信号的电极，可通过间隔基与所要求的核酸探针形成固定化而得到。
在使用荧光物质等标识物质进行检测时，核酸探针固定化基体，基本是可通过间隔基使所要求的核酸探针形成固定化而得到。
2.用语的说明此处使用的核酸”的术语是总括表示核糖核酸(即，RNA)、脱氧核糖核酸(即，DNA)、肽核酸(即，PNA)、甲基磷酸酯核酸、S-低聚、cDNA和cRNA等、及任何低聚核苷酸和多核苷酸等、核酸及核酸类似体的术语。这样的核酸可以是天然存在的，也可以是人工合成的。
此处所说的“核酸探针”是指在含有与标记的序列互补的碱基基序列核酸中，用于向基体上固定的核酸片段。核酸探针具有与所要求的标记的序列互补的序列。由此，可在适宜的条件下与标记的序列进行杂交。
此处所说的“标记的序列”是指要检测其存在的碱基基序列，或者利用核酸探针的碱基基序列要捕捉的序列。还有，将含有这种标记的序列的核酸称为标记的核酸。
此处使用的“互补”“互补的”和“互补性”的术语是指可以在50％～100％范围内互补的，最好是100％互补的。
此处使用的“间隔基”的术语是指配置在基床与核酸探针之间的，具有某长度的链状物质。构成间隔基的物质是核酸时，与标记的序列互补的或进行杂交部分为探针，除此之外的部分分类成间隔基。
此处使用的“间隔基长度”的术语是指在基体与核酸探针之间配置的链状分子长度。在基体上使用如图3所示的封闭剂时，将从上述间隔基的长度减去封闭剂的长度，取为“间隔基长度”。
3.发明的形态首先，以下说明本发明的基本构成实例。
(1)第1种形态使用图1，说明本发明的第1种形态。本发明的第1种形态核酸探针固定化基体1，在基体2上具有的电极3上，具有借助间隔基4固定的核酸探针5(图1A和图1B)。电极3与为读出电信号的小块6连接。图1B中，为方便起见，用粗线示出间隔基4，用链状线示出核酸探针5。
这种核酸探针固定化基体1，例如利用其自身公知的方法，将电极配置在硅基板上，对于该电极表面，通过间隔基使核酸探针固相化而使制造成为可能。
本形态中，虽然将电极数取为6，但配置在1个基体上的电极数并不限于这些。电极的配置图案也不限定于图1A所示，本领域人员可根据需要适当变更设计。也可根据需要设置参照电极和对电极。这样的核酸探针固定化基体也在本发明范围之内。
(2)第2种形态图2模式地示出了本发明第2种形态。本发明第2种形态的核酸探针固定化基体11，是在基体12上，具有借助间隔基13固定的核酸探针14(图2)。为方便起见，图2中也用粗线示出了间隔基13，用链状线示出了核酸探针14。
这样的核酸探针固定化基体11，例如利用其自身公知的方法，对于硅基板，借助间隔基使核酸探针固相化，可以此进行制造。
本形态中，配置在1个基体上的核酸探针数，并不限于此数，可根据要求适当变更，也可在1个基体上配置具有多种碱基基序列的核酸探针。多个和/或多种的核酸探针对基体的固相图案，本技术领域人员可根据需要作适当变更设计。这样的核酸探针固定化基体也在本发明范围之内。
4.构成根据本发明的形态，虽然具有上述的基本构成，但借助于间隔基固定核酸探针时，存在如下特征。详细讲，本发明中使用的间隔基是如下的间隔基，即，将间隔基的长度取为X并在其一部分含有上述标记的序列的标记核酸对上述核酸探针进行杂交时，从该杂交部位的基体侧末端到上述标记的核酸的基体侧末端的长度取为Y时，X≥Y的关系成立。
图3中示出一例核酸探针与标记的核酸的结合状态。在图3的左侧，模式地示出了核酸探针固定化基体30和一般标记的核酸的实例。对配置在基体31上的电极32表面，进行磷酸二氢钾剂33a和封闭剂33b的处理。通过该磷酸二氢钾剂33a，借助于间隔基34使核酸探针35固定在电极32上。对于这样的核酸探针35的序列，其一部分上具有使互补的标记的序列的标记的核酸36排列示出在其附近。
认为从个体和组织以及细胞等对象获得的试料，或从根据要求对其处理获得的试料，由这些试料获得的试料核酸中，即使是含有要检测的标记的序列的标记的核酸，存在标记的核酸的位置也是各式各样的。图3中左图的试料核酸36作为这种多样的标记的核酸中平均的一个实例在这里表示。
将这样固定化的核酸探针35和标记的核酸36进行杂交时的状态示于图3右侧，比较基线37以上的部分。从图可明确知道，间隔基34的长度为“X”，对于核酸探针35，借助标记的序列与标记的核酸36进行杂交时，从标记的序列部分的基体侧末端到该标记的核酸的基体侧末端的长度为“Y”。
X＜Y时，具有与标记的序列互补的序列的核酸探针35和标记的核酸36的杂交效率很低，即，这种情况下，考虑标记的核酸的长度和该标记的核酸中标记出的序列位置时，被固定的核酸探针过度存在于基体表示附近。由此成为核酸探针彼此互为立体障碍的原因，固相的基体成为立体障碍的原因。结果，可以推知核酸探针和标记的核酸的杂交效率不可能充分。
与其相反，X≥Y时，具有与标记的序列互补的序列的核酸探针35与标记的核酸36的杂交效率很高。X≥Y时，从图3的右侧可知，标记的序列与核酸探针杂交时，存在于基体31侧的标记的核酸36比标记的序列形成部分过剩，即使如此，该过剩部分也很短，或者这种过剩部分就不存在。从标记的核酸的长度和标记的序列的位置看，间隔图34具有充分的长度，核酸探针在反应溶剂中自由活动的范围很宽(即，自由度充分大)。认为可提高在杂交反应中与标记的序列相遇的概率。
图5中示出X和Y的关系。图5的曲线图，横轴为X的长度，纵轴为Y的长度。中央的直线是Y＝X的曲线图。根据本发明的形态，Y与X的最好关系是X≥Y。图中，为了标记的核酸和固相的立体障碍变小，区域A是满足X≥Y的区域。区域B包含在区域A内，为了提高了核酸探针的自由度，是满足X-50?≥Y的区域。区域C包含在区域B内，是考虑合成核酸探针时的费用和数量时优选区域。区域D是即使Y短于数10?时，为确保自由度，考虑到X需要一定长度以上时可回避的优选区域。再有区域E是Y为0、或者由于极短，有无间隔基或其长度对杂交效率不产生影响的区域。
实际上进行检测时，多数情况是区域A，B，C和D，但本发明的形态中，优选区域是区域C和区域D。
根据本发明的旨意，例如X的长度界限可在20000?以下，也可在10000?以下。从合成核酸探针的侧面考虑时，X长度的上限可为2000?(这相当于核酸中约400个碱基)，优选为1000?更优选为500?即，X的长度设定很长时，在合成核酸探针时，有可能降低产量和纯度。
为了满足根据上述本发明形态的条件，可在选择标记的序列时下工夫，也可在对含标记的序列的标记的核酸进行扩增时，在从试料选择所用引物序列时下工夫。不仅调节间隔基的长度，而且通过这种调整，可达到更好的杂交效率。
用作该间隔基的物质实例，可以是有机链状分子，例如可以是核酸、烷烃和聚乙二醇、聚肽等。
例如间隔基是由核酸构成的核酸间隔基时，其碱基基序列优选是不与标记的核酸和可含在试料中的核酸相结合的序列。在利用下述电化学检测进行检测产生杂交的情况时，其中选取序列，最好考虑到与所用二个链的识别体核酸碱基的结合倾向。例如ヘキスト33258与胞嘧啶和乌嘌呤很难结合，与胸腺嘧啶和腺嘌呤很容易结合。另一方面，乌嘌呤的连接序列难以合成。因此，更优选只含有胞嘧啶或含有很多胞嘧啶的碱基基序列，优选由胸腺嘧啶形成的或含有很多胸腺嘧啶的碱基基序列，只含有乌嘌呤或腺嘌呤的或含有很多这些的碱基基序列不太好。
通过配置这样的间隔基，可使核酸探针和标记的核酸达到更高效率的杂交。
本发明中使用的核酸探针，可以是一般用作探针的长度。例如核酸探针的长度可从约3个碱基长到约1000个碱基长，优选从10～200个碱基长。
本发明中使用的基体，可以是为与标记的序列进行杂交可固定核酸探针的基体。这种基体的实例，例如可以是非多孔性、硬质或半硬质的材质，可以是具有坑、沟或平表面的板状，也可以是由球体和立方体等立体形状构成的形态。基体并不限于这些，也可以用硅、玻璃等含氧化硅的基质材料，及聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚碳酸酯等塑料和聚合物等进行制造。然而，也可以不使用基体，如下述将电极自身用作基体。
为进行荧光检测的核酸探针固定化基体时，对于上述任何基体，可借助间隔基固定核酸探针。为进行电化检测的核酸探针固定化基体时，可以在上述任何基体上配置可进行电化学检测的电极，再将核酸探针固定在该电极上。
本发明中可使用的电极，没有特殊限定，但可举出，例如石墨、精碳、热解石墨、碳糊、碳纤维一类的碳电极、铂、铂黑、金、钯、铑一类的贵金属电极、氧化钛、氧化锡、氧化锰、氧化铅一类的氧化物电极、Si、Ge、ZnO、CdS、TiO2、GaAs一类的半导体电极、钛等。这些电极可用导电性高分子被覆，也可用单分子膜被覆，根据要求还可用其他表面处理剂进行处理。
借助间隔基对核酸探针的固定，可利用其自身公知的任何方法进行。例如也可以将间隔基对电极进行固定，之后，再对间隔基固定核酸探针。或者也可以预先使间隔基与核酸探针结合，再通过该间隔基固定在电极上。或者也可以利用其自身公知的方法，在电极上使核酸探针与间隔基进行合成。借助间隔基对核酸探针的固定，对于处理或没有处理的基体或电极表面也可以通过共有结合、离子结合或物理吸附等直接固定该间隔基。或者也可以借助间隔基，使用磷酸二氢钾剂邦助核酸探针固定，也可以利用这样的磷酸二氢钾剂，借助于间隔基，对基板或电极固定核酸探针。为防止试料核酸对电极的非特异结合，也可使封闭剂和磷酸二氢钾剂一起对电极进行处理。此处使用的磷酸二氢钾剂和封闭剂，例如可以是有利于进行电化学检测的物质。
具有不同碱基的序列的核酸探针，也可分别借助间隔基对不同的电极进行固定，在混合具有不同碱基基序列的多种核酸探针的状态下，也可借助间隔基对电极进行固定。
5.检测根据本发明的核酸探针固定化基体，作为用于检测固定在上述基体上核酸探针和标记的核酸之间存在杂交反应结果生成的二个链的方法，可利用电化学方法和荧光检检测法。
(1)电化学检测利用电化学对二个链核酸的检测，例如可用其自身公知的二个链识别物质进行。
此处使用的二个链识别体，没有特殊限定，例如可使用ヘキスト33258、吖啶橙、喹吖因、道诸霉素、金属嵌入剂、二吖啶等双嵌入剂、三嵌入剂和多嵌入剂等。也可用电化学活性的金属络合物，例如二茂铁、生物原等对这些嵌入剂进行修饰。其他公知的任何二个链的识别物质也可用于本发明。
在按照本发明的核酸探针固定化基体中，借助于间隔基将核酸探针固定在电极上。使用这种电极的二个链核酸的检测，和其他一般的电化学检测法相同，进而也可使用配极和参照极。配置参照极时，例如可使用银/氯化银电极和汞/氯化汞电极等一般的参照电极。
例如在检测试料核酸中是否含有标记的核酸时，可进行如下试验。例如从包括人在内的动物等个体、组织或细胞等对象中采取的试料，提取核酸成分作为试料核酸。得到的试料核酸，根据需要进行逆复制、延伸、扩增和/或酶处理等处理。将前处理的试料核酸与固定在核酸探针固定化基体上的核酸探针接触，在可适宜杂交的条件下进行反应。这种适宜条件，本技术领域人员可根据如下诸条件作适当选择，即，标记的序列中所含碱基的种类、核酸探针固定化基体上具有的间隔基和核酸探针的种类、试料核酸的种类以及它们的状态等。并不限定于这些，例如也可在如下条件下进行反应。
即，杂交反应溶液，在离子强度为0.01～5的范围、pH5～10的范围的缓冲液中进行。在这种溶液中，也可添加杂交促进剂的硫酸葡聚糖、鲑鱼精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂等。向其中添加得到的试料核酸，90℃以上进行热变性。向热变性的试料核酸插入核酸探针固定化基体，可在刚变性后或急冷到0℃后进行。还有，可向基体上滴加液进行杂交反应。
反应中用搅拌、或振荡等操作，可提高反应速度。反应温度，例如在10℃～90℃的范围，反应时间可进行1分钟以上到1夜。杂交反应后，洗净电极。洗净，例如可使用离子强度0.01～5的范围，pH5～10的范围的缓冲液。试料核酸中存在含标记的序列的标记的核酸时，与核酸探针进行杂交，由此生成二个链核酸。
接着，利用电化学方法，按以下顺序检测生成的二个链核酸。一般是在杂交反应后，洗净基体，使二个链识别体作用于电极表面形成的二个链部分，以电化学测定由此产生的信号。
二个链识别体的浓度，随其种类不同，一般使用范围为1ng/ml～1mg/ml。此时可使用的缓冲液，离子强度0.01～5的范围，pH5～10的范围。
例如电化学的测定可以是施加使二个链识别体进行电化学反应电位以上的电压，测定来自二个链识别体的反应电流值。这时，电压以定速扫描，或以脉冲施加，或施加定电压。测定时，例如使用恒电位计、数字万用表和函数发生器等装置，可控制电流、电压。例如可根据得到的电流值，从检量线算出标记的核酸的浓度。
其自身公知的电化学检测方法，例如以下文献中公开的(Hashimoto et al.1994，Wang et al.1998)方法等，也可适用于本发明的方法中。该文献中桥本等人报导了使用由DNA探针修饰的金电极和电化学活性色素检测序列特异的基因。来自色素的阳极电流与标记的DNA的浓度相关。王等人报导了无指示剂的电化学DNA的杂交。这种生物传感器的构成包括向碳糊电极固定肌苷置换探针(不含乌嘌呤)，和利用该标识的乌嘌呤氧化峰的存在检测二重链形成的定时电位。这些文献中记载的检测方法也可在本发明中使用。
(2)荧光检测法在使用荧光标识物质的方法中，试料核酸可用以下物质标识，即，FITC、Cy3、Cy5或罗丹明等荧光色素、或生物素、半抗原、氧化酶或磷脂酶等酶、或者二茂铁或苯醌类等电化学活性物质。或者使用用上述物质标识的第二探针进行检测。也可同时使用多种标识物质。
在几种形态中，从试料物质提取的核酸成分和固定在探针固定化切片上的探针的杂交反应，例如可按如下进行。即，杂交反应溶液，在离子强度0.01～5的范围、pH5～10的范围的缓冲液进行。在该溶液中还可添加杂交促进剂的硫酸葡聚糖、及鲑鱼精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂等。向其中添加提取的核酸成分，在90℃以上进行热变性。插入探针固定化切片，可在刚变性后或急冷到0℃后进行。也可将液体滴加在基体上进行杂交反应。反应中可进行搅拌或振荡等作业，以提高反应速度。反应温度，例如10～90℃的范围，反应时间，可进行1分钟以上到一夜。杂交反应后，进行洗净。洗净时，例如使用离子强度0.01～5的范围、pH5～10的范围的缓冲液。
荧光检测时，检测杂交反应，可根据标识的种类，使用适宜的检测装置，通过检测试料中标识的碱基基序列或2次探针中的标识进行。标识为荧光物质时，例如使用荧光检测器，检测标识。
使用上述的本发明核酸探针检测任何标记的核酸或标记的序列存在的方法，也在本发明范围之内。
特别是使用为获得上述X和Y的关系的引物对试料核酸进行扩增，将得到的扩增产物，与根据本发明形态在核酸探针固定化基体上固定的核酸探针进行反应，通过检测生成的杂交，通过检测标记的核酸的存在，可更有效地获得杂交效率。这样的方法也包含在本发明中。在这样的方法中可使用的扩增，例如是聚合酶连锁反应(一般称为PCR，以下记作PCR)等的扩增，也可是使用逆复制酶的逆复制扩增等的逆复制PCR，此外，还包括任何自身公知的扩增。
根据本发明的形态可使用的扩增，例如是Nucleic acid strandamplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primerinitiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)、Rolling circle amplication(RCA)法等扩增法。
根据本发明形态的核酸解析方法，可利用在实施样品中所含检体核酸的解析，例如通过标记的序列存在的检测和定量、基因发现的出现消失等的发现解析、染色体组中单碱基多型(Single Nucleotide Polymorphism，即，SNP)和微附属序列等的多型解析、与病患相关基因的解析而对病患诊断和并发症危险率的预测、感染存在的检测、病毒型解析、以及毒性试验等场合。因此，可应用于临床诊断和并发症预测等各种临床的目的。例如可广泛应用于食品的检测、检疫、药品检查、法医学、农业、畜牧业、渔业及林业等各种基础的研究和应用研究等中。
实施例以下对本发明核酸检测方法的实施例进行说明。
本实施例是研究核酸探针的间隔基长度(X)与标记的核酸中从核酸探针结合部位到该基体侧末端的长度(Y)之间的关系，和杂交效率的关系。
(1)核酸探针和标记的核酸的关系本实施例中使用的核酸探针和标记的核酸的关系示于图4。以下讲述标记的核酸与核酸探针的详细序列，但开始对它们的大概构成和相关性进行说明。
图4是同时以20碱基的标记的序列及与标记的序列互补序列作为基准，一同绘制核酸探针C-0、核酸探针C-10、核酸探针C-20及核酸探针C-30、和标记的核酸70-0、标记的核酸70-20及标记的核酸70-40的图。
此处使用的核酸探针为4种。与核酸探针的标记的序列互补的序列是20碱基，在图4中相当于斜线所示部分。
核酸探针C-0，在其5′末端上不付与间隔基。
核酸探针C-10，在其5′末端上付与由10碱基构成的间隔基X1。
核酸探针C-20，在其5′末端上付与由20碱基构成的间隔基X2。
核酸探针C-30，在其5′末端上不付与由30碱基构成的间隔基X3。这些4种核酸探针，关于除间隔基外都是相等的。这些核酸探针，任何一个都是以5′端固定在基体上。
此处使用的标记的核酸为3种。这3种具有标记的核酸的标记的序列，是长度相等为20碱基。图4中，标记的序列相当于网状部分。3种标记的核酸中所含标记的序列的碱基基序列相等。
标记的核酸70-0，全长为70碱基的核酸，在其3′端存在20碱基的标记的序列。
标记的核酸70-20，全长为70碱基的核酸，在标记的序列的5′侧存在30碱基，标记的序列3′侧存在20碱基的序列Y1。
标记的核酸70-40，全长为70碱基的核酸，在标记的序列5′侧存在10碱基，标记的序列3′侧存在40碱基的序列Y2。
(2)核酸探针与核酸探针所含标记的序列互补的序列为20碱基。核酸探针C-0、C-10、C-20、C-30，是在上述20碱基的核酸探针序列5′末端上，分别以0碱基、10碱基、20碱基和30碱基作为间隔基加成上C(即，胞嘧啶)的探针。序列如下。
C-05′-SH-TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列号1)C-105′-SH-(C10)TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列号2)C-205′-SH-(C20)TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列号3)C-305′-SH-(C30)TGGACGAAGACTGACGCTC-3′(序列号4)上述4种探针，即，在C-0、C-10、C-20和C-30的5′末端上由硫醇基修饰的。核酸探针C-0、C-10、C-20、C-30的X，分别是0碱基、10碱基、20碱基和30碱基。
(3)标记的核酸另一方面，作为标记的核酸的模型，对上述20碱基的序列含有互补的序列，准备70碱基的低核苷酸。这种低核苷酸，从探针结合部位的末端到3′末端的长度，为0碱基20碱基、40碱基的3种。各个序列如下所示。
标记的核酸70-0(序列号5)5′CTATAAACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)标记的核酸70-20(序列号6)5′CTATAAACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAA(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)CAAATGGGACCGTGCATTGC标记的核酸70-40(序列号7)5′CTATAAACAT(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)
GCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC用括号“()”括着的序列是探针结合部位，5′末端上标识荧光色素。这些标记的核酸序列号5、序列号6和序列号7的Y分别为0碱基、20碱基、和40碱基。
(4)核酸探针的固定化本实施例中，作为基体使用金基板。将金基板分别在含有核酸探针C-0、C-10、C-20和C-30的缓冲液中浸渍，在室温静置1小时。之后，用蒸馏水洗，干燥，制作成核酸探针固定化金基板。
(5)标记的核酸的杂交将分别含3种标记的核酸的缓冲液，在95℃延续5分钟进行热变性。之后，在冰水中急冷，形成标记的核酸溶液。将固定了各核酸探针的核酸探针固定化金基板浸渍在该标记的核酸溶液中。将其在35℃静置1小时。之后，将上述核酸探针固定化金基板，在不含任何核酸的缓冲液中浸渍，在35℃静置1小时进行洗净。
(6)杂交的标记的核酸检测通过检测来自在标记的核酸5′末端修饰的荧光色素的荧光强度，可对该固定化的核酸探针，检测出杂交的标记的核酸的存在。
(7)结果(i)使用标记的核酸70-0的情况使用标记的核酸70-0时的结果示于图6。标记的核酸70-0和核酸探针C-0、C-10、C-20和C-30结合形式模式地示于图6A。任何核酸探针时都是X≥Y。这时，如图6B所示，从检测出的荧光强度，可知各个核酸探针C-0、核酸探针C-10、核酸探针C-20、核酸探针C-30、与杂交标记的核酸70-0的量大致相等。
(ii)使用标记的核酸70-20的情况使用标记的核酸70-20时的结果示于图7。标记的核酸70-20和核酸探针C-0、C-10、C-20和C-30结合形式模式地示于图7A。在核酸探针C-0和C-10中，X＜Y，在核酸探针C-20中，X＝Y，在核酸探针C-30中，X＞Y。
此时，检测的荧光强度，如图7B所示，核酸探针依赖于间隔基的长度而增强。同样，依赖于间隔基的长度，标记的核酸70-20的杂交量增加，使用含有与从核酸探针结合部位到标记的核酸3′末端的碱基数相同的胞嘧啶20碱基(即，C20)间隔基的核酸探针时，达到最大，与使用含其以上碱基间隔基时比较大致相等(图7B)。
(iii)使用标记的核酸70-40的情况作为标记的核酸使用标记的核酸70-40时，标记的核酸70-20和核酸探针C-0、C-10、C-20和C-30结合的形式模式地示于图8A。任何核酸探针时都是X＜Y。此时，与各核酸探针杂交的标记的核酸，任何一种情况都大致相同，杂交效率降低(图8B)。
(iv)总结从以上结果可以确认，在将核酸探针与固定载体结合时使用的间隔基长度(X)，和对于上述核酸探针与其一部分上含有标记的序列标记的核酸进行杂交时，从该杂交部位的基体侧末端到上述标记的核酸的基体侧末端的长度(Y)之间成立X≥Y的关系时，可提高杂交效率。通过提高杂交效率，可以更高精度检测标记的核酸的存在。
(8)通过使用了引物的试料核酸扩增的调节1根据本发明的又一形态、是基于上述本发明的形态，在使核酸探针固定化基体和试料核酸反应之前，提供具备使用可获得最好标记的核酸的核酸探针扩增试料核酸的工序的方法。这样的核酸探针在用标记的序列使标记的核酸与核酸探针进行杂交时，可以是用于扩增试料核酸的引物，上述标记的核酸的末端位于从该标记的序列部位的基体侧末端部到约40碱基以内，优选26碱基～12碱基以内。
图9是表示本发明另一形态的扩增片段和核酸探针的关系图。此处示出了检测人类染色体组中MxA基因的体系。图9中示出了序列号8的核酸探针和两种PCR产物。序列号8的核酸探针具有20碱基的间隔基部分(图中，记作“Spacer-20”。PCR产物A(以下记作“A”)，用以将5′末端生物素化的序列号9的碱基基序列示出的引物，和以cy5标识的序列号10的碱基基序列示出的引物，进行制作。PCR产物B(以下记作“B”)，用以将5′末端生物素化的序列号11的碱基基序列示出的引物，和以cy5标识的序列号12的碱基基序列示出的引物，进行制作。用卵白素标识磁微粒子进行一个链的调制。图9中，A是离核酸探针结合部位末端的距离为12碱基(图中记作“12mer”)，B是26碱基(“26mer”)。使用这种靶子进行杂交反应，测定荧光强度。结果示出A是B约10倍的荧光强度(图10)。
B约在1小时内反应达到饱和，与其相反，A约在10分钟反应达到饱和。研究SNP检测的特异性，结果是在A、B之间，S/N约形成2倍差异。
(9)通过使用了引物的试料核酸扩增的调节2图11是表示根据本发明另一形态的扩增片段与探针关系图。图11中示出为确定人类染色体组中MBL基因的多型进行扩增所得扩增产物和核酸探针实例的结果。图11中示出以序列号13的碱基基序列表示的核酸探针和三种PCR产物。PCR产物C(以下记作“C”)，用以5′末端磷酸化的序列号14碱基基序列表示的引物、和以cy5标识的序列号15碱基基序列表示的引物进行制作。PCR产物D(以下记作“D”)，用以5′末端磷酸化的序列号16碱基基序列表示的引物、和以cy5标识的序列号15碱基基序列表示的引物进行制作。PCR产物E(以下记作“E”)，用以5′末端磷酸化的序列号18碱基基序列表示的引物、和以cy5标识的序列号17碱基基序列表示的引物进行制作。进而使用离PCR产物的核酸探针结合部位末端的距离达到40碱基的引物。使用λ核酸酶进行一个链的调制。图11所示PCR的各产物，C离探针结合部位末端的距离为13碱基(图中记作“13mer”)，D为33碱基(图中记作“33mer”)、E为48碱基(图中记作“48mer”)。虽然没有图示，但也可以获得离探针结合部位末端的距离达到40碱基的PCR产物。用这些靶子测定进行杂交反应的荧光强度。结果是，C是D约6倍、E的约40倍荧光强度(图12)。
图13示出了使用电化学方法的MBL检测系统的检测结果。与各个靶子进行杂交反应后，进行ヘキスト33258的电流测定。结果是，靶子C是D的约3倍、E的约10倍以上的电流值。
从以上结果可知，从核酸探针结合部位的中心40碱基以上引物的3′末端位于离开的部位时，杂交效率大幅度降低。也见到了特异性降低的现象，为了以高速、高选择性、高感度进行核酸检测，最重要的是使用位于离核酸探针结合部位中心40碱基以内的引物进行扩增。
根据上述的本发明，提供了一种检测感度和特异性高的检测核酸序列的方法以及该方法中使用的引物。
本技术领域中的人员还可能更容易地发现其他优点和变更。因此，从更广范围看，本发明并不限于此处所示的详细说明和典型的形态。因此，根据附上的权利要求范围及其等同物，可作的种种变更，很明显都不会脱离整个发明的思想精神或范围。
序列表<110>株式会社 东芝高桥匡庆冈田纯桥本幸二<120>核酸探针固定化基体和用其检测标记的核酸存在的方法<130>02S1022P<150>JP 2002-218644<151>2002-7-26<160>18<210>1<211>19<212>DNA<213>E.Coli<400>1TGGACGAAGA CTGACGCTC 19<210>2<211>29<212>DNA<213>人工合成<400>2CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC29<210>3<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>3CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 39
<210>4<211>45<212>DNA<213>人工合成<400>4CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 45<210>5<211>70<212>DNA<213>人工合成<400>5CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC CGTGCATTGC GAGCGTCAGT 60CTTCGTCCAG 70<210>6<211>70<212>DNA<213>人工合成<400>6CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG CAAATGGGAC 60CGTGCATTGC 70<210>7<211>70<212>DNA<213>人工合成<400>7CTATAAACAT GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC 60CGTGCATTGC 70<210>8<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>8CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GTTTCTGCTC CCGGA 35
<210>9<211>20<212>DNA<213>人类<400>9GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC 20<210>10<211>22<212>DNA<213>人类<400>10GGCCTCCGCT CTCGCTTCGC CT 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人类<400>11AGGTGCGGGG CCAGGAGCTA GG 22<210>12<211>20<212>DNA<213>人类<400>12TCCGCTCTCG CTTCGCCTCT 20<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>13CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CTTGGTGTCA TCACG35<210>14<211>20<212>DNA
<213>人类<400>14CCCCCTTTTC TCCCTTGGTG 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人类<400>15TGTGAGGATG CCCAAAAGAC 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人类<400>16AGCCCAACAC GTACCTGGTT 9<210>17<211>20<212>DNA<213>人类<400>17TTGCCTGTAG CTCTCCAGGC 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人类<400>18TTGCAGAGAC AGAACAGCCC 20


核酸探针固定化基体，具有基体、和借助间隔基固定在上述基体上并含有与标记的序列互补的碱基基序列的核酸探针，其特征是，上述间隔基是如下的间隔基，即，将其长度取为X，在其一部分含有上述标记的序列的标记的核酸与上述核酸探针杂交时，从该杂交部位的基体侧末端到上述标记的核酸的基体侧末端的长度取为Y时，X≥Y的关系成立。