专利名称:检测肝硬化的miRNA血清标志物及其应用的制作方法肝硬化(liver cirrhosis)是我国一种常见的慢性肝病,可由一种或多种原因引起肝脏损害,肝脏呈进行性、弥漫性、纤维性病变。具体表现为肝细胞弥漫性变性坏死,继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生,这三种改变反复交错进行,结果肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建,使肝变形、变硬而导致肝硬化。该病早期无明显症状,后期则出现一系列不同程度的门静脉高压和肝功能障碍,直至出现上消化道出血、肝性脑病等并发症死亡。因此,肝硬化的尽早诊断就愈发显得迫切。任何事物的发生发展都处于内外因共同作用之下,内因为主,外因为辅。基因作为生命的遗传介质,在生物体的生、老、病、死中处于基础的内因地位。绝大部分基因通过转录生成核糖核酸,再翻译生成蛋白质而发挥生物学功能。microRNA (miR或miRNA,微小RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的,长度约18-26个碱基的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些mRNA上的靶位点相结合,引起靶mRNA降解或翻译抑制,进而在转录后水平对靶基因进行调控。microRNA来源于长度约IOOObp的长链RNA初始转录产物(Pr1-miRNA),Pr1-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60_80nt的具有茎环结构的miRNA前体(PreniRNA)。PreniRNA转运至胞质后,被Dicer酶进一步切割成长约22nt的双链miRNA。双链miRNA解开后,成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-1nducedsilencing complex, RISC),与互补mRNA完全或不完全配对,降解祀mRNA或阻遏其表达。尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小,但由于它可以高效地对所有具有靶位点的mRNA产生调控作用,microRNA在生物体的发育乃至疾病的发生、发展过程所起的作用仍不可小视。然而,迄今为止,本领域对于与肝脏疾病(尤其是肝硬化)相关的microRNA 了解甚少,因此本领域迫切需要进一步地分离标志物microRNA,尤其是与肝硬化的发生、转移、复发或检测有关的microRNA。
本发明的目的就是提供一种新的、可用于区分肝硬化样本及正常样本的microRNA标志物及其用途。本发明的另一目的是提供检测所述疾病的芯片和试剂盒。 在本发明的第一方面,提供了一种分离的miRNA,所述的miRNA选自:(i)序列如 SEQ ID NO:1 所示的 miRNA,或(ii)与 SEQ ID NO:1 所示序列互补的 miRNA。在另一优选例中,所述的miRNA分离自人。在本发明的第二方面,提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA,所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成如本发明第一方面所述的miRNA。在本发明的第三方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成如本发明第一方面所述的miRNA。在另一优选例中,所述的多核苷酸具有式I所示的结构:Seq正向-X-Ueq反向式I式I 中,能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列;Seqi反向为与Seq基本上互补或完全互补的核苷酸序列; X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列,并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补;并且式I所示的结构在转入人细胞后,形成式II所示的二级结构:
本发明涉及用于区分肝硬化与正常组织的microRNA标志物。具体地,本发明涉及可用于区分肝硬化组织及正常组织的microRNA标志物hsa-miR-181b。经检验证明,该特异性的microRNA标志物可非常有效地区分肝硬化组织及正常组织。本发明还涉及标志物microRNA hsa-miR-181b的应用及用于检测肝硬化的试剂盒。
检测肝硬化的miRNA血清标志物及其应用制作方法
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