专利名称：miR-202实时荧光定量PCR检测方法microRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度为18 24个核苷酸的非编码单链RNA分子，普遍存在于各种生物中。miRNA在各种生理和病理过程中起重要的作用，并参与生命过程中一系列的重要进程，包括细胞增殖、分化和凋亡，个体发育，机体代谢及免疫调节。这些miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或断裂靶mRNA而调节基因的表达。miRNA并不是在发育的特定时段表达，而是更倾向于在特定细胞类型中表达。miRNA的这种表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNA有可能作为参与调控基因表达的分子。现有技术尚无完整的miR-202的检测方法。
本发明的目的在于提供一种准确、易操作的miR-202实时荧光定量PCR检测方法。本发明的技术解决方案是一种miR-202实时荧光定量PCR检测方法，其特征是包括下列步骤(I)外周血中单个核细胞的分离取新鲜血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴细胞分离液，加入到15ml锥形离心管中，淋巴细胞分离液与血液的重量比为1:2 ;再将血液沿管壁铺到淋巴细胞分离液上面，2000r/min下离心20min,取血楽；层与分层液交界处浑池的富含单个核细胞的灰白层,用生理盐水洗涤2次，1500r/min离心lOmin，最后弃去上清，得分离的外周血中单个核细胞，_80°C冰箱保存；(2 )细胞中总RNA的提取取分离的外周血中单个核细胞5X IO6个，加入Iml Trizol，混匀，室温静置5min ;加入0. 2ml氯仿，振荡15sec,室温静置2min ;4°C离心，12000r/min 15min,吸取上清至另一个I. 5ml离心管中；加入0. 5ml异丙醇，混匀，室温静置IOmin ;4°C离心，12000r/minI Omin,吸弃上清；加入1111175%乙醇，洗漆沉淀,4°C离心,7500r/min 5min,吸弃上清；晾干，加入20iil0. I %焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O溶解，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取A260/A280在I. 8 2. I用于实验；(3)逆转录合成cDNA反应体系用RNA template 2 u g, RT Primer2 u I, ddH20 补足至 11 U I,混勻离心,70°C放置lOmin，冰育 2min，再加入以下试剂RT buffer5X5u 1，dNTP mix2 u l,40U/u I 的 RNaseinhibitorO. 5u l,200U/u I 的 RT 酶 0. 1，ddH20 补足至 25 u 1，混匀，42°C 60min,70°CIOmin ;合成得到的cDNA放_80°C冰箱保存备用；(4)荧光定量PCR扩增检测反应体系MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ) 22. 5 ii 1，正反向5 ii M 的 Bulge-LoopTM miRNA Primer 各 5 y 1，RT-PCR 产物 2 y 1，RNase-free H2O 补足至50ii I ;95°C预变性 20sec，I 个循环；95°C 10sec,60°C 20sec,70°C 31sec，40 个循环；每管设立三个复孔；整个荧光定量PCR扩增反应过程冰上操作。步骤(4)后，还经下列步骤(5)荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。步骤(2)中加入0. 1% DEPC H2O溶解是在65°C下促溶10 15min。本发明操作方便、检测准确；所采用的实时荧光定量PCR检测方法，巧妙地运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏地检测miR-202。 下面结合实施例对本发明作进一步说明。2.I用于实验。(3 )逆转录合成cDNA反应体系RNA template2 U g, RT Primer2 U I, ddH20 补足至 11 U I,混勻离心，70 °C 放置IOmin,冰育 2min,再加入以下试剂RT buffer5X 5 u I, dNTP mix2 u I, RNase inhibitor(40U/u I) 0. 5 u 1，RT 酶(200U/ii I) 0. 5u 1，ddH20 补足至 25 y 1，混匀，42°C 60min,70°CIOmin。合成的cDNA放_80°C冰箱保存备用。(4)荧光定量PCR扩增反应反应体系MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X ) 22. 5 ii 1，正反向Bulge-LoopTM miRNA Primer (511]