前列腺癌分子标志物miR-301a及其应用的制作方法【技术领域】，具体涉及一种前列腺癌分子标志物miR-301a及其在制备诊断前列腺癌试剂中的应用，尤其涉及前列腺癌分子标志物miR-301a在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中的应用。[0002]MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链微小RNA分子，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性以及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物而在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥越来越重要的作用。[0003]前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95%发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随年龄增长而增加。在美国，前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。中国等亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视。当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80%的病人首先发现远处转移病灶，然后才发现前列腺癌。此时，病变已属晚期，预后不良。[0004]目前，前列腺癌的临床诊断方式主要有以下几种:直肠指检、血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要是通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但上述方法均存在一定的局限性。如直肠指检的局限性是:(1)当患者的前列腺肿块不大时，容易漏诊；(2)有的患者前列腺癌肿大不明显，但已属晚期，不易根治；(3)对患者有一定的不适和危害，当患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)当医生经验不足时有漏诊或误诊可能。正常情况下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时PSA升高，成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但其也存在一定局限性:(1)需要取血检测，对患者有一定的损伤；(2)PSA增高也常见于非前列腺癌疾病，如 前列腺炎症、前列腺肥大等，因此不易确诊；(3) PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已属中、后期，达不到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简便直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形态、有无钙化以及钙化的形态、大小、数目、分步以及周围的晕环、皮肤改变等提供定位及定性征象并判断病变的性质:其局限性是:(1)对致密性的小癌灶容易漏诊；(2)有时不能提供明确的定性诊断；(3)因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所以诊断符合率很低；(4)对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与其他方法技术连用。[0005]近年来的研究表明，前列腺癌和miRNA密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。与前列腺癌相关的miRNA种类较多且作用不一，已有研究表明在前列腺癌患者中上调的 miRNA 包括 miR-375，miR_148a，miR-200c, miR-106a, mir-128, miR-218, miR_20a，和 miR-30b 等；下调的 miRNA 包括 miR-143, miR-145, miR-199a_5p，miR-223, miR_27a，miR-152和miR-424等。虽然已在该领域进行了一些研究，但现有的miRNA标志物的准确性、灵敏性方面均有不足，在临床和研究中仍然存在寻找更加准确和灵敏的前列腺癌miRNA标志物的需求。
[0006]为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子标志物，并提供了该分子标志物在制备诊断前列腺癌试剂中的应用。
[0007]该前列腺癌的分子标志物为miR_301a,其核苷酸序列为5’ -GCUCUGACUUUAUUGCACUACU -3’ (SEQ ID NO:1)。在研究过程中发明人发现，miR_301a 在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高，而当前列腺癌患者在接收手术后，其血清中的miR-301a的含量就回落到与正常人血清中的含量一样的正常水平。由此可见，患者在患病期间增加的miR-301a与前列腺癌的肿瘤存在着密切的相关性。在上述发现的基础上，本发明提供了一种前列腺癌分子标志物，以及该分子标志物在制备诊断前列腺癌试剂中的应用。
[0008]本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0009]一种前列腺癌分子标志物miR_301a，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的序列，为5， - GCUCUGACUUUAUUGCA `CUACU -3，。
[0010]所述的前列腺癌分子标志物miR-301a在制备诊断前列腺癌试剂中的应用在于，所述诊断前列腺癌试剂通过检测被试者血清中miR-301a的含量，并将该miR_301a含量与正常水平miR-301a含量相比较来诊断前列腺癌。
[0011]所述被试者血清中miR-301a的含量通过定量PCR方法进行检测。
[0012]所述前列腺癌分子标志物miR_301a用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒。
[0013]所述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒包括:
[0014](I)血清总RNA提取试剂，
[0015](2) RNA 加 polyA 试剂，
[0016](3) RT-PCR 试剂，
[0017](4)定量 PCR 试剂；
[0018]其中所述定量PCR试剂中包括所述前列腺癌分子标志物miR_301a的特异性正向引物(即GSP外源对照-3)，该特异性正向引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.7所示的序列，为5， - UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3，。
[0019]所述诊断试剂盒中血清总RNA提取试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.2的外源对照-1，为 5’ - CAACCTCCTAGAAA GA -3’。
[0020]所述诊断试剂盒中RNA加polyA试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.3的外源对照-2，为 5’ - TGAGCAACGCGAACA A-3’。
[0021 ] 所述诊断试剂盒中RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID N0.4的RT-引物，为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，其中 V 为 A、C 和 G 中的任一种，N为A、T、C和G中的任一种。
[0022]所述诊断试剂盒中定量PCR试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.5的通用反向引物UPM-短片段，为5’ - CTCACAC GACTCACGACAC-3’ ；和核苷酸序列为SEQ ID N0.6的通用反向引物 UPM-长片段，为 5’ -CTCACACGACTCACGACACC AGTGGTATCAACGCACTC-3’。
[0023]本发明的有益技术效果是:本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物miR-301a，并将该分子标志物应用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒中，使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，该分子标志物特别适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中。

[0024]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0025]1.血清或血浆中总RNA的提取: [0026]抽取3名前列腺患者手术前7天及手术后7天的血液各2毫升，同时抽取同期3名正常人血液各2毫升作为对照。将上述血液凝血后进行离心，最后取上层血清I毫升置于1.5毫升的无DNA和RNA污染的离心管中。
[0027]使用康维世纪公司生产的RNA提取试剂盒自上述血清中提取总RNA，每250微升血清中加入I微升外源对照-1 (北京旷博生技术有限公司提供)来监控上述血清中RNA的提取质量。提取的总RNA通过使用Therm NanoDrop 2000c仪器，测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓度测定。所述外源对照-1的序列为5’ - CAACCTCCTAGAAAGA -3’ (SEQ IDNO:2)。
[0028]2.定量检测血清中的microRNA:
[0029]I)加 poly (A)尾:
[0030]在无RNA酶的PCR管(VWR公司生产，200微升)中配制加A尾的反应液，体系总量为20微升。每20微升体系反应液中加入I微升特异的外源对照_2(北京旷博生技术有限公司提供)来监控miRNA的加尾及反转录质量,所述反应液体系如表1所示。将装有配置好反应液的PCR管放入PCR仪(Thermo)中，在37°C下孵育I小时，得到孵育反应液I。所述外源对照-2 的序列为 5’ - TGAGCAACGCGAACAA -3’(SEQ ID NO:3)。
[0031]表1
[0032]