一种miR-27a的应用及其诊断试剂盒的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于生物技术和医学【技术领域】，特别涉及一种miR-27a对结肠癌发生或转移诊断的应用。[0002]结肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，结肠癌发生发展的原因尚未完全清楚。结肠癌的淋巴转移和其他脏器远端转移是结肠癌病人死亡的主要原因，结肠癌远端转移的患者预后极差，因此，对结肠癌的发生和转移的研究一直是基础和临床研究的热点。结肠癌的常规治疗手段主要是手术治疗、放化疗。近年来迅速发展的免疫治疗和基因治疗显示了巨大的应用潜力。近年来研究表明表观遗传的改变和癌信号分子的激活是恶性病变发生和进展的主要原因。表观修饰尤其是miRNAs的异常表达与肿瘤的形成、转移相关，并在肿瘤治疗中起关键作用。miciORNAs (miRNAs)是一类内源性小分子非编码RNA，结构高度保守，具有表达时序性和组织特异性，通过与靶基因3’非编码区互补序列特异性结合，导致翻译抑制或mRNA降解，从而调苄基因的表达。基于miRNA的以上特点，以及随着大规模、高通量miRNA检测技术的推广应用，发现新的miRNA不仅为肿瘤的诊断和预后提供了颇具价值的标准，同时也为寻找新的肿瘤生物治疗靶点奠定基础。[0003]miR-27a位于19号染色体，其表达水平和生物功能随肿瘤类型而异，一些研究报道miR-27a是一种癌基因，例如，在乳腺癌、结肠癌细胞系，肝细胞腺癌细胞中表达增高，而且miR-27a的高表达与乳腺癌的进展和不良预后密切相关。另外一些研究也发现miR_27a通过促进转录因子特异蛋白(Sp)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体I (VEGFRl)的表达来发挥其作为癌基因的功能。另一方面miR-27a也扮演着抑癌基因的角色，例如，miR-27a在食管癌、口腔鳞癌和非小细胞肺癌中表达降低。在非小细胞肺癌中，miR-27a靶作用于MET和EGFR的3’ UTR导致MET和EGFR的表达降低。[0004]我们的研究发现，miR-27a在结肠癌组织中表达显著降低(41例结肠癌标本中33例miR-27a表达降低)，另外miR-27a的低表达和结肠癌的远处转移(二者正相关)以及临床分期(3-4期的表达低于1-2期)密切相关。miR-27a通过靶作用于smad2、SGPPl抑制肿瘤的生长和转移。我们对miR-27a在结肠癌组织中的表达水平以及其生物功能的研究尚属首次，该研究对结肠癌的发生和转移以及治疗具有重大的意义。
[0005]针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种miR_27a的应用及其诊断试剂盒。[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种miR_27a在制备结肠癌发生或转移诊断试剂盒中的应用。
[0007]本发明还提供了一种miR_27a在制备抑制结肠癌发生或转移药物中的应用。
[0008]本发明还提供了一种结肠癌发生或转移诊断试剂盒，试剂盒含有miR_27a的实时荧光定量PCR引物，所述引物分别为:[0009]上游引物序列为:5’-TTCGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，如 SEQ ID NO:1 所示；
[0010]通用下游引物序列为:5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，如 SEQ ID NO:2 所示。
[0011]该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。作为优选，试剂盒包括:组织总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、逆转录试剂、定量PCR试剂。
[0012]其中，逆转录试剂中包括miR-27a的特异逆转录引物，其序列为:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTT GCGGAAjn SEQ ID NO:3 所示；
[0013]内参snord47 的逆转录引物，其序列为:GTGCAGGGTCCGAG GTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCTdn SEQ ID NO:4 所示；
[0014]定量PCR试剂中包括miR_27a的特异引物:
[0015]上游引物:TTCGGTTCACAGTGGCTAAGjnSEQ ID NO:1 所示；
[0016]内参snord47的特异引物:
[0017]上游引物:CGCCAA TGATGTAATGATTCTGjnSEQ ID NO:5 所示；
[0018]通用下游引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTjnSEQ ID NO:2 ；
[0019]通用Taqman 探针:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAT TT/3 IABkFQ0
[0020]本发明的有益效果:本发明提供的试剂盒通过检测miR_27a的表达，可以对结肠癌发生进行早期诊断，通过检测其表达水平与临床分期以及转移的关系，对病人预后作出评价。基于miR-27a靶作用于smad2、SGPPl的特点，可以设计抑制肿瘤生长、转移的干预策略，提出了 miR-27a在制备抑制结肠癌肿瘤生长和转移药物中的作用。本发明在医学和生物制药领域有重大实际意义和巨大的应用价值。



[0021]图1为miR_27a在41例标本中的表达情况；
[0022]图2为miR_27a转染HCTl 16细胞后划痕实验的结果；
[0023]图3为SGPPl和smad2在结肠癌组织和邻近正常组织中表达的免疫组化染色结果;
[0024]图4为P-STAT3在结肠癌组织和邻近正常组织中表达的免疫组化染色结果；
[0025]图5为miR_27a转染HCTl 16细胞后SGPPl的表达变化；
[0026]图6为miR_27a转染HCTl 16细胞后smad2的表达变化；
[0027]图7为psiCHECKTM-2载体的图谱；
[0028]图8为miR_27a转染HCTl 16细胞后SGPPl和smad2报告基因活性的变化；
[0029]图9为MTS实验检测miR_27a转染SW480、HCTl 16、Caco2后细胞增殖情况；
[0030]图10为miR_27a转染后细胞的凋亡变化；
[0031]图11 为 miR_27a 转染 HCTl 16 和 SW480 细胞后影响 STAT3 和 Caspase3 水平；
[0032]图12为miR_27a转染HCTl 16细胞后抑制SGPPl和Smad2蛋白水平；
[0033]图13为miR_27a转染SW480细胞后抑制SGPPl和Smad2蛋白水平；
[0034]图14为实验组(miR_27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠在肿瘤细胞接种后增生物的体积随时间的变化情况；
[0035]图15为实验组(miR_27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠中增生物的重量情况(NC 为 negative control)；[0036]图16为实验组(miR_27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠中增生物的情况；
[0037]图17为实验组(miR_27a转染)和对照组(阴性对照miRNA转染)小鼠中增生物的miR-27a的表达情况。

[0038]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
[0039]实施例lmiR_27 a在结肠癌组织标本中的差异性表达
[0040]1、人结肠组织标本收集
[0041]从新乡市中心医院和新乡医学院第一附属医院，收集2012年11月至2013年12月间的共41例结肠癌标本及其临近的正常结肠组织标本。一部分储存于液氮、-80°C冰箱中，提取RNA和蛋白质用来做实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹。另一部分用10%福尔马林固定，后用石蜡包埋。病人的临床和病理信息如表1所示。所有病人均书面告知，标本收集均经新乡医学院伦理审查委员会同意。
[0042]表lmiR-27a与临床病理资料间的联系