转录因子AtGT4及其编码基因与应用的制作方法【技术领域】，尤其涉及一种转录因子AtGT4及其编码基因与应用。[0002]环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如:EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。Trihelix转录因子是植物特有的一类转录因子家族。Trihelix转录因子因其蛋白质结构中的DNA结合域有3个α-螺旋(helix-loop-helix-loop-helix)而得名。该蛋白家族的成员根据其DNA结合元件的特异性而划分为3个蛋白亚家族，即GT-1，GT_2和GT-3 (Ayadi et al.，2004，Analysisof GT_3a identifies a distinct subgroup of trihelix DNA—binding transcriptionfactors in Arabidopsis, FEBS Letters562, 147-154，2004)。就蛋白质结构中 DNA 结合域数目而言，GT-1类和GT-3类仅在其N端有一个trihelix域，而GT-2类蛋白则具有两个trihelix域,分别位于C端和N端。Trihelix转录因子调控光应答基因的表达，也参与叶与花器官的正常发育(Brewer et al., 2004, PETAL LOSS, a trihelix ranscript ionfactor gene, regulates perianth architecture in the Arabidopsis flower, Developmentl31, 4035-4046)。[0003]目前已发现大豆Trihelix转录因子在植物耐受非生物胁迫机制中发挥作用(Xie ZM, Zou HF, Lei G, Wei W，Zhou QY, Niu CF, Liao Y, Tian AG, Ma B, Zhang WK, ZhangJS*, Chen SY*(2009)Soybean Trihelix transcription factors GmGT_2A and GmGT_2Bimprove plant tolerance to abiotic stresses in transgenic arabidopsis.PLoSONE,.2009Sep;4:4(9) e6898)，拟南芥中的此类家族与耐逆的相关性尚未见报道。
[0004]本发明的一个目的是提供一种转录因子AtGT4及其编码基因。[0005]本发明所提供的蛋白，名称为AtGT4,来源于(Arabidopsis thaliana cvColumbia-0, Col-Ο),是如下(a)或(b):[0006](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0007](b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
[0008]上述耐逆具体为耐盐。
[0009]其中，序列表中的序列2由372个氨基酸残基组成。
[0010]上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0011]编码上述蛋白AtGT4的基因AtGT4也属于本发明的保护范围。
[0012]编码上述蛋白AtGT4的基因如下(1)-(4)中任--种的DNA分子:
[0013](I)序列表中序列I所示的DNA分子；
[0014](2)序列表中序列I自5’末端第1-1116位核苷酸所示的DNA分子；
[0015](3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
[0016](4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
[0017]上述耐逆具体为耐盐。
[0018]上述基因中，所述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2 X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS、0.5M NaPOjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC，
0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C,0.1 XSSC,0.1%SDS 中漂洗；还可为:5(TC`，在 7% SDS、0.5M NaPO4和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在65°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC, 0.1%SDS和I X SSC, 0.1%SDS各洗膜一次。
[0019]其中，序列表中的序列I由1119个脱氧核苷酸组成，本序列为AtGT4基因的读码框，编码具有序列表中序列2的氣基酸残基序列的蛋白质。
[0020]含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0021]上述重组载体在本发明的实施例中具体为将上述编码基因(序列表中序列I自5’末端第1-1116位核苷酸所示的DNA分子)插入表达载体pCAMBIA1302的BamHI和HindIII识别位点间得到的重组载体。
[0022]扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0023]上述引物对在本发明的实施例中具体可为如下I)或2):
[0024]I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；
[0025]2)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成的引物对。
[0026]上述蛋白或其编码基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物耐逆性中的应用是本发明保护的范围。
[0027]上述应用中，所述调节植物耐逆性具体为提高植物耐逆性或降低植物耐逆性；
[0028]所述耐逆性具体为耐盐性；
[0029]所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
[0030]本发明的第二个目的是提供一种培育转基因植物方法。
[0031]本发明提供的方法是为将所述蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。[0032]在上述方法中，所述耐逆性为耐盐性；上述蛋白的编码基因通过上述的重组载体导入目的植物；
[0033]上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥，在本发明的实施例中采用的是哥伦比亚生态型拟南芥(Col-O)；
[0034]上述耐盐性进一步具体通过提高存活率体现。
[0035]本发明的第三个目的是提供一种降低植物耐逆性的方法。 [0036]本发明提供的方法，是降低目的植物中上述蛋白编码基因的表达，得到耐逆性低于所述目的植物的植物；
[0037]所述耐逆性为耐盐性；所述耐盐性低于所述目的植物具体体现在莲座直径小于所述目的植物；
[0038]所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物一步具体为拟南芥，在本发明的实施例中采用的是哥伦比亚生态型拟南芥(Col-O)。
[0039]上述方法中的耐逆性低于所述目的植物的植物为T-DNA插入突变体gt4，购自ABRC, ABRC 编号:salk_095404。
[0040]上述的转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的耐逆性性状得到改良。
[0041]上述基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果:
[0042]I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%,优选为多于45%,更优选为多于50%,最优选多于约60% ；
[0043]2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
[0044]3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0045]4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
[0046]5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV, MCMV和AMV )。
[0047]在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。
[0048]携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0049]本发明的实验证明，本发明在拟南芥中发现一个新基因AtGT4，该基因的表达受高盐、300mM甘露醇模拟干旱和低温诱导，因此AtGT4可能与植物对非生物逆境应答的调控相关。将AtGT4导入拟南芥ColO中，获得了过量表达AtGT4基因的纯系株系，将该转基因株系与野生型拟南芥和AtGT4的突变体gt4相比，其耐盐性有显著提高，而突变体gt4的耐盐性则较对照显著下降。说明AtGT4基因的过量表达显著提高了植物的耐盐性。从而说明该基因AtGT4参与植物对高盐胁迫应答的调控，为培育耐盐植物品种，特别是培育耐盐作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐盐植物品种的培育和鉴定，对提高含盐土壤中的作物产量具有重要意义。
[0050]下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。



[0051]图1为AtGT4基因在不同处理时的表达模式
[0052]图2为植物表达载体pCAMBIA1302-AtGT4的示意图
[0053]图3为AtGT4过表达转基因植株的分子鉴定
[0054]图4为AtGT4突变体gt4的分子和耐盐性鉴定
[0055]图5为AtCT4`过表达株系、突变体与对照的耐盐性比较
[0056]图6为AtGT4过表达株系、突变体和对照经盐胁迫后的存活率统计

[0057]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059]下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。
[0060]所有植物材料均生长于22° C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗)。
[0061]pCAMBIA1302 载体记载在 Lim HS, Ko TS, Lambert KN, Kim HG, Korban SS, HartmanGLj Domier LL.Soybean mosaic virus helper component-protease enhances somaticembryo production and stabilizes transgene expression in soybean.Plant PhysioIBiochem.20050ct_Nov; 43 (10-11): 1014-21，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0062]农杆菌GV3101 菌株记载在 Clough-SJj Bent-AF.Floraldip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16:6，735-743中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0063]哥伦比亚生态型拟南芥(Col-O):种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下简称野生型拟南芥。[0064]所有植物材料均生长于22-25° C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗)。
[0065]实施例1、大豆AtGT4及其编码基因的筛选及其cDNA的克隆
[0066]1、拟南芥AtGT4及其编码基因的获得
[0067]前期的研究表明大豆Trihelix类转录因子家族中某些成员参与植物对非生物胁迫的应答反应，并与植物耐逆性相关，例如GmGT2A和GmGT2B等(Xie ZM, Zou HF, Lei G, WeiW，Zhou QY, Niu CF, Liao Y, Tian AG, Ma B, Zhang WK, Zhang JS, Chen SY,Soybean Trihelixtranscription factors GmGT_2A and GmGT_2B improve plant tolerance to abioticstresses in transgenic arabidopsis.PLoS ONE, 2009Sep; 4:4 (9) e6898)。通过 Blast 搜索拟南芥基因组数据库，聚类了拟南芥Trihelix类基因，共有26个，应用Rt-PCR方法鉴定了 26个基因在非生物胁迫，包括高盐、低温和干旱下的表达特征，其中9个基因的表达受至少一种非生物胁迫的诱导。选取9个诱导表达基因中的AtGT4作进一步研究。AtGT4具有序列表中序列I的核苷酸序列，由1119bp组成，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基的蛋白，该蛋白命名为AtGT4，序列表中序列2由372个氨基酸残基组成。
[0068]根据AtGT4基因序列设计引物:
[0069]AtGT4F: 5 ‘ -CGGGATCCATGTTTGTTTCCGATAAC-3，，(序列 3 )
[0070]AtGT4R:5 ‘-GGGGTACCCCTCTCATTCCTCTGTATAAG-3 ’(序列 4)
[0071 ] 应用RT-PCR方法，从拟南芥总RNA中扩增AtGT4基因，具体方法如下:
[0072]取野生型拟南芥 叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μ g总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20 μ IPCR反应体系为:1μ I—链cDNA(0.05 μ g)、I μ I引物(20 μ Μ)、
2μ 110 X PCR缓冲液、0.4 μ IdNTP(IOmM)和IU Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20 μ 1，液面覆盖液体石蜡油。反应在ΡΕ9600型PCR仪上进行，其程序为94°C变性5min;再94°C lmin,56°C lmin, 72°C lmin，共30 — 32个循环；然后72°C延伸10min;4°C保存。所获得的PCR产物约llOObp。经回收后序列分析表明，该PCR产物的大小为1119bp，具有序列表中序列I自5’末端第1-1116位核苷酸，即为AtGT4基因。
[0073]将上述PCR产物克隆于pMD18-T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDAtGT4，并且测序验证构建成功。
[0074]2、AtGT4基因在非生物胁迫下的表达特征
[0075]对野生型拟南芥进行300mM甘露醇模拟的干旱、200mM NaCl和0°C低温处理，用于分析拟南芥AtGT4在非生物胁迫下的表达特征。将拟南芥种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行下述胁迫处理:
[0076]干旱处理:将拟南芥幼苗的根系置于300mM甘露醇水溶液中，分别在光照条件下干旱培养O小时、I小时、3小时、6小时和12小时后取样。
[0077]盐处理:将拟南芥幼苗的根系置于200mM NaCl水溶液中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时和12小时后取样。
[0078]低温处理:将拟南芥幼苗置于0°C培养箱中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时和12小时后取样。
[0079]总RNA的提取上述I。应用RT-PCR分析AtGT4基因在上述处理时的转录特征，所用引物同上述。结果如图1所示，IA中从左到右依次为盐处理、干旱处理、低温处理下AtGT4基因的的RT-PCR扩增；1B为盐处理后AtGT4基因的相对表达量；IC为干旱处理后AtCT4基因的相对表达量；可以看出，随着不同的处理时间，AtCT4基因的表达有变化，表明AtGT4参与植物对非生物胁迫的应答反应，可能与植物的耐逆性相关。
[0080]实施例2、AtCT4的应用
[0081]一、转AtGT4拟南芥株系(过量表达AtGT4拟南芥株系)的获得
[0082]1、重组表达载体pCAMBIA1302_AtCT4的构建
[0083]从野生型拟南芥中提取总RNA，反转录得到cDNA为模板(也可以序列I为模板)，用Primer-F+和Primer-R-作为引物进行PCR扩增，获得约1.1Kb的PCR产物，经测序鉴定该PCR产物具有序列表中序列I自5’末端第1-1116位核苷酸。
[0084]Primer-F+:5，-CGGGATCCATGTTTGTTTCCGATAAC-3，(序列 3，下划线为 BamH I 位点)
[0085]Primer-R-:5’ -CCCAAGCTTTCTCATTCCTCTGTATAAG-3’ (序列 5，下划线为 HindIII位点)
[0086]将上述PCR产物经BamH I和HindIII双酶切，得到的该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体PCAMBIA1302得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中序列I自5’末端第1-1116位核苷酸插入pCAMBIA1302的BamH I和HindIII酶切位点之间得到的载体，将该载体命名为pCAMBIA1302 - AtGT4，且序列表中序列I自5’末端第1-1116位核苷酸位于CaMV35S启动子之 后。重组表达载体pCAMBIA1302 - AtCT4结构示意图如图2所示。
[0087]2、转AtCT4拟南芥株系的获得及鉴定
[0088]将重组载体pCAMBIA1302 - AtGT4用电击转化法导入农杆菌GV3101中，得到重组菌，提取重组菌的质粒，测序，结果为该质粒为PCAMBIA1302 -AtGT4，含有该质粒的重组菌命名为 GV3101/pCAMBIA1302-AtGT4。
[0089]挑取GV3101/pCAMBIA1302 - AtGT4的单菌落在5ml LB培养基中，于28°C培养8小时，再转接到200mlLB中继续培养3小时，收菌后重悬于LB培养基中得到转化液。将野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana) Col-O的花浸泡于转化液中10秒,取出后放入MS培养基中避光培养8小时，获得Ttl代转化种子，将其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培养基上，获得54株过表达的Ttl代转AtGT4拟南芥。
[0090]提取上述54个单株Ttl代转AtGT4拟南芥植株叶的RNA，并反转录获得cDNA，进行Real Time PCR鉴定，探针为:
[0091 ] AtGT4-Real+: 5，-CGGGATCCATGTTTGTTTCCGATAAC
[0092]AtGT4-Real-: 5，-GGGGTACCCCTCTCATTCCTCTGTATAAG
[0093]以野生型拟南芥(col-Ο)为对照。
[0094]结果如图3所示，可以看出，在54个转基因株系中，有53个株系的GmGT4的相对表达量明显大于野生型对照，为阳性Ttl代转AtGT4拟南芥；筛选2个Ttl代转AtGT4拟南芥株系命名为GT4-3和GT4-47作进一步研究。
[0095]将T1单株收获种子，此为T2代种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复筛选，直至T3代获得遗传稳定的转基因株系，共获得稳定遗传的转AtGT4基因株系。其中包括用以进行进一步实验的T3代转AtGT4拟南芥GT4-3和T3代转AtGT4拟南芥GT4-47。
[0096]采用同样的方法将空载体pCAMBIA1302转入野生型拟南芥中，得到Ttl代转空载体拟南芥，采用上述引物进行鉴定，未得到目标片段，说明该Ttl代转空载体拟南芥构建正确；播种筛选如此重复直至得到T3代转空载体拟南芥。
[0097]二、AtGT4突变体gt4的分子及耐盐性鉴定
[0098]T-DNA 插入突变体 gt4 购自 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC编号:salk_095404，已经证明仅AtGT4基因失活，其他基因与野生型一致)。
[0099]将野生型拟南芥和gt4突变体种子在培养皿生长2周后移栽(生长于22° C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗))至盆中待开花后，取全株提取RNA做RT-PCR鉴定。引物同 Primer-F+ (序列 3)和 Primer-R-(序列 5)。
[0100]结果如图4A所示，突变体gt4中未能检测出AtGT4基因的转录，进一步验证该突变体为AtGT4基因的突变。
[0101]将萌发后5天的野生型对照和突变体gt4，分别置于含O、100、125和150mM NaCl的MS培养基中培养，各处理15株，生长18天后统计莲座直径。
[0102]表型观察结果如图4B所示，可以看出，随着NaCl的浓度增加，突变体gt4的生长明显差于野生型。
[0103]统计莲座直径结果如图4C所示，在正常条件下生长(未含NaCl的MS培养基)的野生型对照和突变体莲座直径分别约为1.63cm和1.7cm ;在含有125mM NaCl的MS培养基中野生型对照和突变体莲座直径分别约为:1.0cm和0.78cm ;在150mM NaCl的MS培养基中野生型对照和突变体莲座直径分别约为0.95cm和0.63cm ;结果表明，盐胁迫下，突变体莲座直径明显小于对照。
[0104]三、转AtGT4拟南芥株系的耐盐鉴定
[0105]实验样本为作为对照的野生型拟南芥Co 10、T3代纯系转AtGT4拟南芥GT4_3、T3代纯系转AtGT4拟南芥GT4-47、T3代转空载体拟南芥和AtGT4突变体gt4。每个株系15粒种子。
[0106]将各个株系植株的种子同时播种在MS平板上，萌发后10天后将幼苗分别移栽到含有0、125mM和150mM NaCl的蛭石中生长35天，比较表型。
[0107]表型观察结果如图5所示，A为正常条件生长的各个株系(0mMNaCl)，B为125mM和150mM NaCl的蛭石生长的各个株系；可以看出，正常条件下各株系的生长无显著差异。在NaCl处理后，各株系的幼苗生长均受到严重抑制，突变体萎蔫严重，对照次之，而AtGT4过表达株系基本仍然存活。
[0108]存活率统计结果如图6所示，正常条件下(OmM NaCl)，各株系存活率均约为100%，在 125mM NaCl 处理时，GT4-3、GT4-47、gt4 和 ColO 的存活率分别约为 56%、59%、8%、48%，当蛭石中NaCl浓度为150mM时，GT4-3、GT4-47、gt4和ColO的存活率分别约为50%、38%、0%和27%。结果表明，过表达株系(T3代纯系转AtGT4拟南芥)在高盐胁迫下的存活率显著或极显著高于对照，而突变体gt4的存活率极显著低于对照。
[0109]T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0110]上述结果表明AtGT4基因的表达与植物的耐盐性相关，其过表达明显提高了转基因植株的耐盐性。