花生柠檬酸转运蛋白AhFRDL1、其编码基因及应用的制作方法[0002]植物要维持正常的生长发育就必须不断的从土壤中获得多种营养元素，如大量元素N、P、K及微量元素铁、锰、铜、锌等。而铁是包括植物在内的大部分有机体的必需营养元素之一。铁在植物体中参与叶绿素的合成，参与植物体内的氧化还原反应和电子传递是植物细胞色素氧化酶、过氧化物酶等与呼吸有关的酶类的重要组成部分，具有催化功能，直接或间接参与植物体内的代谢过程(Imsande J, Touraine B.1994.N demand and theregulation of nitrate uptake.Plant Physiology.105:73-77)。虽然铁在自然界中的丰度很高，但大多以生物有效性低的氧化态形式存在，特别是石灰性土壤上，石灰性土壤占世界土地面积的三分之一以上，高pH和高重碳酸盐含量严重降低了土壤中铁的有效性(Guerinot ML, Yi Y.1994.1ron:Nutritious, noxious and not readily available.PlantPhysiology.104:815-820;Schmidt ff.2003.1ron solutions:acquisition strategiesand signaling pathway in plants.Trends in Plant Science.8:188-193)。而在我国典型的北方石灰性土壤上缺铁同样是影响植物生长的一个主要限制因子。[0003]土壤溶液中的有效铁含量非常低无法满足植物正常的生长发育需求，植物在长期的进化过程中形成了两种不同的活化和吸收铁的机制，1986年，德国著名科学家RiVmheld.和Marschner揭示了不同植物适应缺铁胁迫的两种反应机制:机理I植物和机理II植物。机理I植物包括双子叶植物和非禾本科单子叶植物，机理II植物是禾本科单子叶植物(Romheld V，Marschner H.1986.Evidence for a specific uptake system for ironphytosiderophores in roots of grasses.Plant Physiology.80:175 - 180)。[0004]机理I植物和机理II植物的缺铁适应性变化包括生理变化和形态变化，形态学变化包括:根的伸长受阻，根尖膨大，侧根和根毛形成增加，根表皮细胞壁向内褶皱，形成典型的转移细胞等(Landsberg EC.1994.Transfer cell formation in sugar beet rootsinduced by latent Fe deficiency.Plant Soil.165:197-205)。生理变化包括植物H+-ATP酶向胞外释放质子，使土壤的pH值降低，提高土壤中铁的有效性。[0005]对于机理I植物来说，主要通过两步来完成对铁的吸收:首先，质膜上的H+-ATP酶向根际释放质子酸化根际，提高铁的有效性。同时，根表皮质膜上的Fe3+还原酶将Fe3+还原为 Fe2+(Robinson NJ, Procter CM, Connolly EL, Guerinot ML.1999.A ferric-chelatereductase for iron uptake from soils.Nature.397:694-697)。然后，植物根系质膜上的铁转运蛋白IRT将Fe2+转运到细胞内。每一个铁吸收过程都有相对应的基因进行控制从而保证根系从土壤中充分吸收铁。而机理II植物在缺铁情况下分泌麦根酸铁载体，麦根酸在根际将铁溶解，再通过细胞质膜上的YSl转运蛋白将麦根酸铁转运到根细胞内(Curie C,Panaviene Z,Loulergue C，Dellaporta SL, Briat JF, Walker EL.2001.Maizeyellow stripe lencodes a membrane protein directly involved in Fe (III)uptake.Nature.409:346 - 349)。[0006]当铁进入根系之后，还需要经过运输作用，将其运往地上部加以利用，从而完成植物体对铁的吸收与利用。木质部是长距离运输通道之一，铁在木质部中是以柠檬酸铁的形式运输。最早被鉴定的负责将柠檬酸向木质部分泌的基因是拟南芥AtFRD3(Durrett TP, Gassmann ff, Rogers EE.2007.The FRD3_mediated efflux of citrateinto the root vasculature is necessary for efficient iron translocation.Plant Physiology.144:197-205)，随后在水稻中也发现了具有类似功能的基因OsFRDLl (Yokosho K, Yamaji N, Ueno D, Mitani N, Ma J F.2009.0sFRDLl is a citratetransporter required for efficient translocation of iron in rice.PlantPhysiology.149:297-305)。无论是拟南芥突变体frd3_l，还是敲除了 OsFRDLl的水稻转基因植株，叶片都出现了明显的缺铁失绿黄化现象，同时在根中出现过量的铁累积，结果表明AtFRD3、OsFRDLl是铁通过木质部由地下部向地上部运输不可或缺的基因。[0007]花生是我国北方地区大量种植的主要的油料作物，但是由石灰性土壤引发的缺铁现象已成为花生产量的主要限制因素之一(左元梅、刘永秀、张福锁，玉米/花生混作改善花生铁营养对花生根瘤碳氮代谢及固氮的影响，生态学报，2004,24(11) = 2584-2590 )。到目前为止，有关花生吸收铁的报道有AhIRTl基因(Ding H, Duan L，Li J, Yan H, Zhao M, ZhangF，Li WX.Cloning and functional analysis of the peanut iron transporter AhIRTlduring iron deficiency stress and intercropping with maize.Journal ofPlantPhysiology.2010)，但是与木质部铁运输有关的花生基因还没有任何报道。

[0008]本发明的目的是提供一种花生柠檬酸转运蛋白AhFRDLl、其编码基因，以用于提高花生木质部的铁向地上部运输。
[0009]本发明另一目的是提供含有上述基因的载体。
[0010]本发明又一目的是提供含有上述基因或载体的宿主细胞。
[0011]本发明再一目的是提供花生柠檬酸转运蛋白AhFRDLl或其编码基因在提高花生木质部的铁向地上部运输中的应用，及制备高铁营养农产品中的应用。
[0012]本发明所述花生柠檬酸转运蛋白AhFRDLl，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0013]本发明所述花生柠檬酸转运蛋白AhFRDLl基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，共有2034bp，包括5’ -端UTR，蛋白编码区和3’ -UTR包含ployA尾巴，表明是完整的核苷酸编码序列。通过DNAman基因分析软件分析得到了 SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，该AhFRDLl蛋白由520个氨基酸组成。
[0014]应当理解，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞，利用所述宿主细胞制备花生根系柠檬酸转运蛋白的方法等。
[0015]所述该序列经替换一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，是指该序列的活性功能域之外的位点进行有限氨基酸的保护替换所得的序列仍能保持原来的活性。
[0016]本发明通过一对引物扩增上述花生根系柠檬酸转运蛋白编码基因:
[0017]AhFRDLl-F: TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG
[0018]AhFRDLl-R:AACATGATTGCATTCATCTCCAT
[0019]把AhFRDLl基因转入到拟南芥frd3_l突变体中。正常营养液培养的条件下，相对于拟南芥frd3-l突变体，转入AhFRDLl基因的拟南芥frd3_l突变体植株木质部柠檬酸和铁的浓度显著增加，根系铁含量显著降低，叶片叶绿素总量上升，新叶活性铁含量显著增加，老叶活性铁含量降低。
[0020]本发明有益效果:
[0021 ] I)本发明首次公开了一种花生根系柠檬酸转运蛋白，获得了该基因cDNA全长，并分析得到了其编码的蛋白序列；
[0022]2)本发明的AhFRDLl基因可调控柠檬酸向木质部分泌，并且参与木质部铁向地上部运输的过程；
[0023]3)本发明深入了植物铁营养分子机制的研究，为从植物分子育种角度获得高铁营养高品质农产品奠定了基础，为从分子育种及基因工程技术角度培育耐铁花生品种提供必要的基础。



[0024]图1为AhFRDLl基因与各物种同源基因之间的氨基酸序列相似性分析图；
[0025]图2为转入AhFRDLl基因的拟南芥植株木质部汁液柠檬酸含量图；
[0026]图3为转入AhFRDLl基因的拟南芥植株木质部汁液铁含量图；
[0027]图4为转入AhFRDLl基因的拟南芥植株根系总铁含量图；
[0028]图5为转入AhFRDLl基因的拟南芥植株新叶、老叶活性铁含量图；
[0029]图6为转入AhFRDLl基因的拟南芥植株叶片总叶绿素含量图；
[0030]其中，WT代表野生型、FRD3代表突变体、53、54、63、64代表不同的转基因株系。

[0031]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032]实施例1花生AhFRDLl基因的克隆
[0033](1)花生水培培养
[0034]将花生种子鲁花14(购于中国农业科学院)用10%双氧水消毒20-30分钟，清洗干净后置于饱和硫酸钙溶液中约8小时，并通气避光。之后置于铺有吸水纸的托盘中，浇适量的水后避光置于人工培养室中。培养室设置条件为光照14小时30度，黑暗10小时22度。1-2天左右花生发出小芽后移入石英砂中培养，待长出1-2片叶子后转入水培营养液中培养。水培营养液配方如下=KH2PO4 (0.5mM)、K2SO4 (0.75mM)、KCl (0.1mM)、MgSO4.7H20(0.65mM)、CaSO4.2H20(2mM) ,H3BO3Cl μ M),MnSO4.4H20(1 μ M)、ZnS04.7H20(1 μ M)、CuSO4.5H20 (0.1 μ M)、(NH4) 6Μο7024.4Η20 (0.005 μ Μ)、EDTA-Fe (80 μ Μ)，pH 值为 5.8-6。
[0035](2)花生RNA提取
[0036]把保存于-80°C的花生根系及叶片样品放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨植物样品直至成粉末状，取出约0.1g粉末样品于1.5ml无RNase离心管中，加入ImlTrizol0涡旋震荡15s，室温静置5min，加入200 μ I氯仿，充分混匀，静置5min，4°C离心，12000rpm，15min，取上清液入1.5ml的离心管中，加入500 μ I异丙醇，混匀，室温静置lOmin，于4°C 12000rpm离心lOmin，取出后倒掉上清液，加入Iml 75%的乙醇，涡旋震荡数秒，4°C 7500rpm离心5min，重复洗涤两次，倒掉乙醇并吸去剩余上清液后，离心管于室温下风干。加入适量的DEPC水和RNA酶抑制剂，放于_20°C或_80°C冰箱中贮存备用。[0037](3)基因全长克隆
[0038]通过抑制性差减杂交获得了花生AhFRDLl基因片段，用已知的片段序列设计引物，以花生根系RNA为模板,用invitrogen公司Super Script II逆转录酶试剂盒，Oligo(dT)15为引物，42°C反应得到反转录cDNA模板。通过clonetech公司RACE试剂盒(SMARTRACE cDNA Amplification Kit)进行PCR反应，分别克隆测序得AhFRDLl基因5’及3’端，5’端克隆引物为:
[0039]AhFRDL 1-5， -GSP ATCCGTGGCGCGCAGCTAAAGACG
[0040]3’端克隆引物为:
[0041]AhFRDL 1-3’ -GSP GCAGCCATTGCCCATGTCATTTCTCA
[0042]然后拼接得到全长序列。
[0043]利用拼接的理论全长序列，设计扩增该基因全长的引物，分别为:
[0044]AhFRDLl-F: TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG
[0045]AhFRDLl-R:AACATGATTGCATTCATCTCCAT
[0046]PCR反应体系为:将根系cDNA稀释5倍后取2 μ 1，10X反应缓冲液2 μ 1，dNTP(10mM)0.5μ IjMgCl2 (50mM)0.5μ 1，正向引物 AhFRDLl-F (0.01mM)0.5μ 1，反向引物AhFRDLl-R (0.01mM) 0.5 μ I, ddH2013.7μ I，TaqDNA 聚合酶(invitrogen 公司)0.3 μ 1.将上述混合后进行PCR反应，程序为:94°C预变性3min ;94°C变性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸2min ；30个循环；72°C延伸IOmin0
[0047]PCR反应后琼脂糖凝胶电泳得到预期约1.6kb的DNA条带，进行胶回收纯化，获得DNA全长。然后将回收得到的DNA连接到pMD20-T载体(TaKaRa公司)，16°C过夜，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞(TIANGEN公司)，涂于含Amp抗生素的LB板，37°C过夜培养，挑单克隆于LB液体37°C过夜摇菌，送菌液测序(上海生物工程公司)确定序列的正确性。对得到的cDNA进行分析，利用DNAman软件翻译得到蛋白序列。AhFRDLl基因序列如SEQ ID N0.1所示(2034bp)，对应氨基酸序列为SEQ ID N0.2。本发明基因与目前已经鉴定的各个物种中的同源基因之间的氨基酸序列相似性分析如图1所示。
[0048]实施例2转入AhFRDLl基因的拟南芥遗传转化
[0049](I)将实施例1中构建好的质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中，划板培养，挑取单克隆到培养基中，在恒温振荡培养器中28°C过夜培养。所述培养基为5ml的LB培养基(每升培养基中含IOg氯化钠，IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，用NaOH调节pH值为7.0)中加入50mg/L Rif，25mg/L Gen, 50mg/L Kan ;将过夜培养的农杆菌接种到500ml的培养瓶中，加入50mg/L Rif,50g Sucrose, 500ul Silwet-L77, IL MQ water，28°C过夜培养约 12h ;取上述菌液离心，4000-6500rpm, 15_20min,弃去上清液,用转化介质重悬沉淀至OD值达到
0.8左右备用。
[0050](2)用1%的琼脂糖浸泡拟南芥frd3_l突变体种子(由美国康奈尔大学植物生理系 Leon Kochian 教授惠赠，参见 “Durret TP, Gassmann ff, Rogers EE.2007.TheFRD3_mediated efflux of citrate into the root vasculature is necessary forefficient iron translocation.Plant Physiology.144:197-205.，，)，装盆，点种前烧水至饱和。在20-22°C的温室，光照16h黑暗8h光照处理，2-3天浇一次水。第一个花序长到5-15cm,第二个花序刚出现时移苗到另一个盆中。
[0051]将拟南芥植株的花浸入含有农杆菌的培养基中lmin，保湿暗培养过夜。每天浇水，拟南芥正常生长。当种子成熟时，将种子收集到15ml或50ml的管子中。
[0052]种子灭菌:将种子放入50ml的灭菌管中，加入下列灭菌混合液:100 μ I TritonX-100, 3ml Bleach, 6.9ml MQ water,混合15min,短暂离心后将灭菌液倒出。用无菌水清洗种子4次。
[0053]筛选转化子:将种子均匀的悬浮在1%的琼脂糖中，将种子点到MS培养基上，点种后放置25-35min晾干培养基。培养基配方:4.3g/L MS salts，1%的蔗糖，5g/L MES8%phytagar,加琼脂粉之前用IMNaOH调节pH值到5.7,高压灭菌20min,冷却后加入50mg/L Kan，在培养基凝固之前将培养基倒板。
[0054]培养基置于4°C的冰箱中`春化两天后放在培养箱中黑暗培养；观察拟南芥的生长是否受细菌的威胁，如果被污染将拟南芥移到另一个培养基中生长；拟南芥幼苗至少有一个真叶时，将其移到拟南芥培养室的小盆中，将根上的琼脂糖冲洗掉，将根系埋在土中，黑暗培养，2-3天浇一次水；拟南芥长到一周后，用2μ 1/L的除草剂喷转基因植株，每两天喷一次，连续喷4-5次，约10-20%的植株能够生存下来。
[0055]实施例3转基因植株T3代种子的获得
[0056]将T2代种子放入1.5ml灭菌管中，加入里面Iml灭菌水，放入4°C的冰箱中春化2天。将蛭石和营养灭菌，120°C，20min。将蛭石与营养土以1:1的比例混合均匀，装盆，点种前烧水至饱和。
[0057]将春化后的种子点种，点种后用塑料薄膜覆盖住盆子，放在拟南芥培养室中培养，室内温度21_22°C，光照16h黑暗8h光照处理，光照植物出苗后，将塑料薄膜揭开，适当浇水。
[0058]拟南芥长到4-6片叶子时喷100mg/L的除草剂，每隔两天喷一次连续喷三次，部分拟南芥死亡。拟南芥成熟时,收种子。
[0059]实施例4花生AhFRDLl基因生物学功能的验证
[0060]将T3代种子放入1.5ml离心管中，加入Iml灭菌水。将离心管放入4°C冰箱春化至少48h。配制母液(营养液配方见表1 )，使用时将其稀释1000倍，NaOH调节pH值在5.8-6.0之间。盆中装入适量营养液使点种板刚好漂浮起来，点种子。三天换一次营养液。
[0061]点完种子后，放在拟南介培养室中黑暗培养72h。再培养5天后间苗留一棵。以后每3天换一次营养液，等拟南芥长即将抽薹的时候，收集拟南芥木质部汁液，取样测定。
[0062]表1拟南芥营养液配方