猪amy2基因的一个可用于溯源的snp分子标记及其检测方法[0002]猪肉制品作为人膳食中重要的蛋白质来源，如何确保其安全卫生，保障消费者的身体健康和生命安全已成为全球性的热点问题。世界各国政府纷纷采取一系列的技术措施来強化对肉产品的安全管理，以期最大程度上減少食品安全事件的发生。我国各大城市也纷纷建立了肉产品的追溯系统，通过肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个获取有效可靠信息的途径。更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，将有助于社会的安定。[0003]但是我国肉产品追溯系统所采用的标签技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等缺点；而国外发达国家所采用的DNA溯源技术是基于个体DNA指纹图谱的生物学技术，有着绝对的不可更改性和唯一性，不受人为因素影响。而且因为DNA溯源技术容易分型、重复性好、检测手段简单快捷、成本低廉等成为目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技木。[0004]DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异，用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR标记(微卫星标记)和SNP标记(单核苷酸多态性)。[0005]AFLP具有的高度可靠·性和操作简便性，但是AFLP存在着对模板反应表现迟钝、谱带可能发生错配与缺失、成本相对比较高等缺点。相比SNP标记，微卫星标记的等位基因众多，多态丰富，但也正因如此，使得SSR标记的带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难。SNP标记是第三代分子遗传标记，是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，一般表现为二等位基因，非常适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。[0006]但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记，对于单个的SNP标记，它必须至少具有以下特征:(1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布频率差异小；(3)杂合度大于等于0.3。[0007]在长期的育种工作中，研究者积累了大量的SNP标记，但是这些SNP标记往往集中分布在某些染色体上，如I号染色体，12号染色体等，而另外部分染色体，如4号，8号，14号，18号染色体等则缺乏SNP标记，因此为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的要求，我们进行新SNP标记的研究工作。[0008]猪AMY2 (amylase, alpha 2B)基因称为胰腺淀粉酶基因，位于猪的第4号染色体上。AMY2基因在人类，羊和鸡中已有研究，该基因跟代谢途径存在关联。

[0009]本发明所要解决的技术问题在于提供猪AMY2基因的ー个可用于溯源的SNP分子标记及其检测方法，该SNP分子标记在商品猪培育中，可以广泛用于猪肉产品DNA溯源及其检测，特别是用于猪肉产品的安全性溯源。
[0010]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
[0011]所述的猪AMY2基因的ー个可用于溯源的SNP分子标记，共1060bp，包含部分第五外显子，部分第七外显子和完整的第五内含子，第六外显子和第六内含子序列，且第104位碱基处有ー个碱基突变104C — 104T，其DNA序列具体如SEQ ID NO I所示。
[0012]所述的SNP分子标记编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0013]所述的SNP分子标记是通过DNA池(pool)测序获得，并在包括10个猪品种或品系的试验群体(共计235个个体)中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，初歩判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
[0014]所述的猪AMY2基因的ー个可用于溯源的SNP分子标记的检测方法，采用PCR-Eco911-RFLP方法进行，包括以下步骤:
[0015](I)构建猪的 DNA 池(pool);
[0016](2)设计正、反向引物分离AMY2基因的DNA片段，测序并分析；
[0017](3)PCR-Eco911-RFLP检测方法的建立及突变位点的检测；
[0018](4)采集10个品种和品系的耳组织样，共计235个个体；
[0019](5)检测SNP分子标记在试验群体的分布，统计分析，并进ー步试验验证是否适用于猪肉产品溯源。
[0020]其中，上述检测方法中，分离AMY2基因的DNA片段的正、反向引物序列如下:
[0021]正向引物:5’-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3’(序列SEQ ID No 3)
[0022]反向引物:5’-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3’(序列SEQ ID No 4)
[0023]本发明采用DNA池检测到猪AMY2基因存在的ー个SNP分子标记，在包括10个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该SNP分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，初歩判定该SNP分子标记可用作猪肉产品DNA溯源以及猪肉产品的安全性溯源中。
[0024]由于单个SNP分子标记是无法完成溯源的，因此在溯源模拟试验中，将本发明获得该AMY2基因的SNP分子标记的位点与其它现有已公开的SNP分子标记位点结合在一起进行溯源实验(共计12个SNP位点)，在屠宰场随机挑选的100个个体中，检测每个个体12个SNP位点的基因型，统计每个个体的基因型結果，发现100个个体均拥有各自不通的基因型，能实现个体区分；同时，随机在这100个个体中挑取20份肌肉样，同样检测统计12个SNP分子标记位点的基因型，然后跟100个个体的基因型进行比对分析，发现均能找到与20份肌肉样品基因型完全一致的个体，即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体，因此判定本发明的该SNP分子标记可以用于猪肉产品溯源。
[0025]以下结合具体实施例进ー步详细描述本发明的技术方案。
[0026]实施例1分子标记的查找
[0027](1)DNA 池(pool)的构建
[0028]分别随机采集杜洛克猪、梅山猪个体各2头(不分性別)的耳组织，提取DNA后，等量吸取4个个体的DNA放入同一离心管中，混匀待用。
[0029](2)引物设计
[0030]以猪AMY2基因的DNA序列(Genbank:NC_010446)为模板，设计引物分离猪AMY2基因(以ー头申农猪的DNA为PCR扩增的模板)，引物如下:
[0031]正向引物:5’-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3’(SEQ ID No 3)
[0032]反向引物:5，-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3’(SEQ ID No 4)
[0033]PCR反应总体积为 20 μ1，其中猪 AMY2 基因组DNA约 lOOng，含 1 Xbuffer(Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2, dNTP (上海生工生物公司)终浓度为150 y mol/L，引物终浓度为
0.2 u mol/L, 2U Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)。
[0034]PCR 扩增程序为:94°C 4min, (94°C 30s，62°C退火 40s，72°C 40s)循环 30 次，最后72°C延伸 lOmin。
[0035]PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0036](3)克隆测序分析
[0037]将得到的猪AMY2基因PCR产物按照下述方法进行克隆。
[0038]PCR产物的纯化:在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mlEpendorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化。
[0039]连接反应:将纯化的PCR产物与pMD 18-T载体(大连宝生物公司)连接，连接反应总体积是1Oul，其中包括5 μl solution I (大连宝生物公司)，0.5 μl的T载体(大连宝生物公司)，2.5μI的纯化PCR产物，最后加入2 μl灭菌水置4°C水浴过夜。
[0040]转化:无菌状态下取100-120 μl感受态细胞(天根生化科技有限公司)于1.5mlEpendorff管中，将5yl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42°C热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3_4min，加入400 μl无抗生素的LB液体培养基，37°C平放1h后倒置培养。
[0041]菌落PCR鉴定:经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37°C培养过夜，随即挑取多个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。
[0042]经测试，该经拼接后的猪AMY2基因的DNA序列共1060bp，包含部分第五外显子，部分第七外显子和完整的第五内含子，第六外显子和第六内含子序列，其DNA序列如SEQ IDNo 1所示。且分析发现该DNA序列的第104碱基处存在ー个碱基突变(104C — 104T)，通过分子生物学软件分析，发现该第104碱基处的碱基突变导致Eco911-RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism,即Eco91I_RFLP位点)多态性。该DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0043](4) PCR-Eco91IRFLP检测方法的建立及突变位点的检测
[0044]酶切反应总体积lOμl，其中IXbuffer 1Ou l, PCR产物3-5 yl，限制性内切酶Eco91I 为 0.5μl (5U)，用 H2O 补足 10 yl，37 °C 水浴 4h，称取 0.6g 琼脂糖溶于 15.75mlDEPC (上海生エ生物公司)处理水中，稍冷却(60°C)，加入5ml的5X甲醛凝胶电泳缓冲液和4.25ml的37%甲醛溶液，混匀制胶，电泳后检测酶切結果。结果发现:SEQ ID No I序列中T等位基因只有1060bp —个片段，C等位基因有98bp和962bp两个片段，这两个等位基因可组成三种基因型:CC，CT, TT。且该序列的第984位碱基，发生C — T的替代。
[0045]实施例2等位基因的分布情况
[0046]( I)试验群体的设计
[0047]试验组:采集皮特兰(21头)、申农(17头)、大白(43头)、大申(52头)、长申(16头)、杜申(23头)、皮大申(11头)、长大申(25头)、杜大申(7头)和杜皮大申(20头)个体的耳组织，提取DNA，共计235个DNA样本。
[0048]试验群体的目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。
[0049](2)基因型检测
[0050]正向引物:5’-GCAAGTGGAGTGGAGAGAAG-3’(序列SEQ ID No 3)
[0051]反向引物:5’-ACTCGTGTGAATCCGTAAGG-3’(序列SEQ ID No 4)
[0052]进行扩增(条件如实施例1)，用相同的RFLP方法检测试验群体所有的个体基因型。
[0053](3)统计分析
[0054]记录所有个体的基因型，并计算等位基因频率和杂合度，结果如下表1所示。
[0055]表1
[0056]