癌症生物标志物的制作方法[0001]优先权要求[0002]本申请要求2010年10月7日提交的美国临时专利申请流水号61/390，956和2011年6月6日提交的61/493，800的权益。前述专利的全部内容在此通过提及而收录。发明领域[0003]本发明涉及基于检测存在卫星重复和/或Line-1表达水平升高诊断癌症的方法。[0004]发明背景[0005]全基因组测序方法已经揭示了越来越多的一批转录非编码序列，包括通过与转录沉默和染色体完整性联系的基因组异染色质区实现的“弥漫转录(pervasivetranscription)”(J.Berretta,A.MoriI1n, EMBO ReplO, 973 (2009 年 9 月)；Α.Jacquier, Nat Rev GenetlO，833 (2009年12月))。在小鼠中，异染色质由形成有丝分裂纺锤体复合物和可靠的染色体分离需要的着丝粒(次要)和臂间(pericentric)(主要)卫星重复构成(M.Guenatri, D.Bailly, C.Maison, G.Almouzni, J Cell Bioll66, 493 (2004年8月16日))，而人卫星重复已经分成具有相似功能的多个类别(J.Jurka等，CytogenetGenome ResllO, 462 (2005)) ?酵母中卫星的双向转录经由切酶介导的RNA诱导的转录沉默(RITS)及经由最近鉴定的切酶依赖性途径维持着丝粒DNA的沉默(M.Halic，D.MoaZed，Celll40，504(2月19日))，尽管哺乳动物中着丝粒卫星沉默机制限定得不太好(A.A.Aravin, G.J.Hannon, J.Brennecke, Science318, 761 (2007 年 11月 2 日))。小鼠和人细胞系中卫星转录物的积累源自切酶I缺陷(C.Kanellopoulou等，Genes Devl9, 489 (2005年 2 月 15 日)；T.Fukagawa 等，Nat Cell Biol6, 784 (2004 年 8 月))及源自 DNA 去甲基化、热休克、或凋亡的诱导(H.Bouzinba-Segard, A.Guais, C.Francastel, Proc Natl Acad SciU S A103, 8709(2006年6月 6 日)；R.Valgardsdottir 等，Nucleic Acids Res36, 423(2008年2月))。还已经将培养细胞中应激诱导的卫星转录与编码RNA聚合酶活性的反转录元件诸如 LINE-1 (LlTDl)激活联系起来(D.Ugarkovic, EMBO R印6，1035(2005 年 11 月)；D.M.Carone等，Chromosomal 18, 113 (2009年2月))。尽管有这些体外模型，尚未分析原发性肿瘤中重复ncRNA的全局表达，这是由于微阵列平台偏爱注释的编码序列及从标准分析程序明确排除重复序列所致。[0006]发明概述[0007]本发明至少部分基于鉴定肿瘤细胞中卫星重复的大规模表达，以及例如肿瘤细胞，包括循环肿瘤细胞(CTC)中Line-1的表达升高。本文中描述了基于存在卫星重复和/或Line-1的表达水平升高来诊断癌症，例如上皮起源的实体恶性，诸如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌的方法。
[0008]在第一个方面，本发明提供了检测受试者中癌症存在的方法，例如体外方法，包括测定来自所述受试者的样品中的LINE-1水平以获得测试数值；并比较所述测试数值与参照数值，其中与所述参照数值相比的测试数值指示所述受试者是否具有癌症。
[0009]在一些实施方案中，参照数值代表LINE-1的阈值水平，其中所述受试者中存在高于所述参照数值的LINE-1水平指示所述受试者具有癌症，且所述受试者中存在低于所述参照数值的LINE-1水平指示所述受试者不太可能具有癌症。
[0010]在第一个方面，本发明提供了检测受试者中癌症存在的方法，例如体外方法，包括测定来自所述受试者的样品中卫星转录物的水平以获得测试数值；并比较所述测试数值与参照数值，其中与所述参照数值相比的测试数值指示所述受试者是否具有癌症。
[0011]在一些实施方案中，所述卫星转录物包含下列一种或多种:ALR、HSATII, GSATI1、TARl、和SSTI。在一些实施方案中，所述卫星转录物是ALR和/或HSATII，且高于所述参照水平的ALR和/或HSATII卫星转录物水平的存在指示所述受试者具有肿瘤。
[0012]在一些实施方案中，所述卫星转录物是GSATI1、TARl和/或SSTl，且低于所述参照水平的GSATI1、TARl和/或SSTl卫星转录物水平的存在指示所述受试者具有肿瘤。
[0013]在另一个方面，本发明提供了评估受试者中癌症的治疗效力的方法，例如体外方法。该方法包括测定来自所述受试者的第一样品中的LINE-1水平以获得第一数值；对所述受试者施用癌症治疗；测定在后来的时间时自所述受试者获得的随后样品中的LINE-1水平，以获得治疗数值；并比较所述第一数值与所述治疗数值。低于所述第一数值的治疗数值指示所述治疗是有效的。
[0014]在又一个实施方案中，本发明提供了评估受试者中癌症的治疗效力的方法，例如体外方法。该方法包括测定来自所述受试者的第一样品中的卫星转录物水平以获得第一数值；对所述受试者施用癌症治疗；测定在后来的时间时自所述受试者获得的随后样品中的卫星转录物水平，以获得治疗数值；并比较所述第一数值与所述治疗数值，其中低于所述第一数值的治疗数值指示所述治疗是有效的。
[0015]在一些实施方案中，所述卫星转录物包含下列一种或多种:ALR、HSATII, GSATI1、TARl^P SSTl。
`[0016]在一些实施方案中，第一和第二样品已知或怀疑包含肿瘤细胞，例如，已知或怀疑包含循环肿瘤细胞(CTC)的血液样品，或已知或怀疑包含肿瘤细胞的活组织检查样品。在一些实施方案中,所述样品包含血清中游离的RNA或血液中外来体内的RNA。
[0017]在一些实施方案中，所述治疗包括施用手术干预、化学疗法、放射疗法、或其组合。
[0018]在本文中所描述的方法的一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人或兽医受试者，例如实验动物。
[0019]在本文中所描述的方法的一些实施方案中，癌症是上皮起源的实体瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
[0020]在一些实施方案中，本文中所描述的方法包括测量LINE-1转录物水平。
[0021]在本文中所描述的方法的一些实施方案中，使用分支DNA测定法测定LINE-1转录物或卫星的水平。
[0022]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。本文中描述了本发明中使用的方法和材料；也可以使用本领域中已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和例子仅是例示性，而并不意图为限制性的。通过提及将本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它出版物完整收录。在冲突的情况中，应当以本说明书(包括定义)为准。
[0023]本发明的其它特征和优点通过以下详细描述和图，以及通过权利要求书会是显而易见的。
[0024]附图简述
[0025]图1A是一幅柱形图，其显示了不同肿瘤、细胞系、和组织中占所有基因组比对阅读的百分比的主要卫星水平。每种肿瘤类型和细胞系下面标示原发性肿瘤和细胞系的基因型。(Kras=KrasG12D ;Tp53、SMAD4、和 APC 代表缺失的基因)。
[0026]图1B是所有原发性肿瘤、癌细胞系、和正常组织中来自主要卫星的序列阅读分布的示意图。
[0027]图2Α显示了对三种KrasG12D、Tp531ox/+胰腺原发性肿瘤(肿瘤1_3)和源自肿瘤3的稳定细胞系(CL3)的Northern印迹分析的结果。
[0028]图2B显示了用DNA低甲基化剂(hypomethylating agent) 5-阿扎胞苷(azacitadine, AZA)处理之前(O)和之后(+)对CL3的Northern印迹分析的结果。
[0029]图2C显示了对来自多份成年和胎儿小鼠组织的总RNA的Northern印迹分析的结果。所有Northern印迹暴露于约30分钟。
[0030]图2D是一对显微照片，其显示了与Ikb主要卫星重复探针杂交的正常胰腺(左侦D和原发性胰管腺癌(右侧)的RNA原位杂交(ISH)的结果。
[0031]图2E是一组三幅显微照片，其显示了对新生物前(preneoplastic)PanIN(P)损伤、其相邻的PDAC(T)和正常胰腺(N)的ISH分析的结果，显示PanIN中的正染色，整个癌瘤中表达升高。PanIN(左侧)和PDAC (右侧)损伤的较高放大率(40x)。
[0032]图2F是一组三幅显微照片，其显示了对肝(其自身不表达卫星)转移性的PDAC细胞中卫星的明显表达(左侧) 。通过标准组织学评估和卫星染色容易地鉴定大的腺性转移性肿瘤沉积物(中间)。卫星ISH灵敏得足以检出通过标准组织学分析不容易察觉的肝实质中的微转移(右侧；箭头)。所有图像为20x放大率(比例尺=100 μ m)。
[0033]图3A是一幅柱形图，其显示了通过DGE定量的人胰管腺癌(PDAC)、正常胰腺、其它癌症(L:肺，K:肾，O:卵巢，P:前列腺)、和其它正常人组织(1:胎儿脑，2:脑，3:结肠，4:胎儿肝，5:肝，6:肺，7:肾，8:胎盘，9:前列腺，及10:子宫)中的总卫星表达。卫星表达以与人基因组比对的每百万的转录物显示。
[0034]图3B是一幅柱形图，其显示了作为占测序的人PDAC(黑色，n=15)和正常人组织(白色，n=12)中总卫星的百分比的卫星重复类别的分类。卫星从肿瘤中的最高绝对差异至正常组织中的最高绝对差异排序(左侧至右侧)。误差棒代表均值的标准误差。显示了顶部三种癌症(左侧，黑色柱形)和正常(右侧，白色柱形)组织卫星类别(柱形图，中心)的倍数差异。
[0035]图4A显示了所有小鼠肿瘤和正常组织中主要卫星与其它细胞转录物的多线性相关分析的结果，如通过热图(heat map)描绘的。x轴是根据主要卫星表达排序的样品，而y轴是根据与主要卫星表达的线性相关排序的基因。浅灰色(高)和暗灰色(低)颜色是log2(每百万的阅读)。主要卫星表达作为通过具有最高线性(R≤0.85)及卫星水平的顶部基因的展开图根据卫星阅读(X-轴)等级排序的百分比基因组比对阅读(y轴)。
[0036]图4B是一幅点图，其显示了所有基因的转录起始位点与Line-1元件的中值距离，其以与卫星表达的线性(暗灰色；左侧的最高线性)或随机(亮灰色)排序。通过在100s中二进制化(binned)的基因绘图[0037]图4C是一幅显示了具有最高线性(R>0.85)的顶部基因的点图，其限定与这些基因的预期频率(亮灰色)相比通过针对转录起始位点与LINE-1元件的距离的频率(暗灰色)绘图的卫星相关基因或SCG。
[0038]图4D是一组四幅显微照片，其显示了小鼠PDAC (KrasG 12D，Tp531ox/+)在神经内分泌标志物嗜铬粒蛋白A方面的免疫组织化学的结果。肿瘤以升高的嗜铬粒蛋白A染色(暗灰色)的函数描绘，其中在每幅图的底部对每个肿瘤记录主要卫星表达的相对水平(占所有转录物的百分比)。
[0039]图5是一幅柱形图，其标示CTC装置对对照装置中指定基因的倍数变化表达。受试者是新诊断的转移性胰腺腺癌患者。在某个点时在所有患者中看到LINE-1表达。
[0040]图6Α是经福尔马林固定的经石蜡包埋的组织(顶部图像)中人新生物前PanIN(P)损伤及相邻的非癌性基质组织(N)和PDAC的细针抽吸活组织检查(T)和正常相邻白细胞(N)中人卫星HSATII的RNA原位杂交(RNA-1SH)图像。。(暗灰色点=HSATII)。比例尺=100 μ m。
[0041]图6B是使用HB-芯片上捕获的潜在人胰腺循环肿瘤细胞的Affymetrix ViewRNA进行HSATII的RNA原位杂交的图像。HSATII (最亮的区域；最初为黄色)、DAPI核染色(中等灰色区域，最初为蓝色)。比例尺=20 μ m。
[0042]发明详述
[0043]本发明至少部分基于鉴定来自小鼠肿瘤模型中的主要卫星重复及来自人癌症中的ALR和HSATII卫星重复的LINE-1蛋白和双向ncRNA的大规模生成。这些癌症中卫星水平的异常幅度是无先例的。这可能源自影响卫星和LINE-1反转录转座子两者的染色体标志的一般性去阻抑，及接近潜在影响选定的细胞mRNA表达的LINE-1激活。总之，卫星的非常高的表达可以影响染色`体完整性和遗传稳定性，而共脱调节(co-deregulated)的编码序列可以影响癌细胞的细胞命运和生物学行为。另外，人胰腺癌中特定卫星子集的大规模表达的发现为在癌症的早期检测中应用提供一种新颖的生物标志物。最终，LINE-1水平在来自具有新诊断的转移性胰腺腺癌的受试者的循环肿瘤细胞中是升高的。如此，本方法可用于早期检测癌症，并且可以用于预测临床后果。
[0044]俥用转录物牛物标志物诊断癌症
[0045]可以使用本文中所描述的方法在受试者中诊断癌症及监测癌症治疗效力，所述癌症例如上皮起源的实体瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
[0046]如本文中所使用的，术语“过度增殖性”指具有自主生长(即，以快速增殖细胞生长为特征的异常状态或状况)的能力的细胞。过度增殖性疾病状态可以分类为病理学的，即表征或构成疾病状态，或者可以表征为非病理学的，即偏离正常，但是与疾病状态没有联系。该术语意图包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织、或器官，而不管组织病理学类型或侵入性阶段。“肿瘤”是过度增殖细胞的异常生长。“癌症”指例如以恶性肿瘤生长为特征的病理学疾病状态。
[0047]如本文中表明的，癌症，例如上皮起源的实体瘤，例如如由ICD-0(国际疾病分类:肿瘤学)代码(修正版3)，部分(8010-8790)限定的，例如早期阶段癌症的存在与由于胰腺癌细胞中卫星重复的转录和加工升高所致的卫星大规模水平，及循环肿瘤细胞中LINE-1表达水平升高的存在有关。如此，所述方法可以包括检测样品中卫星重复的表达水平，所述样品包含已知或怀疑是肿瘤细胞的细胞，例如来自上皮起源的实体瘤的细胞，例如胰腺、肺、乳腺(breast)、前列腺、肾、卵巢或结肠癌细胞。或者/另外，所述方法可以包括例如使用如本文中所描述的微射流装置来检测样品中LINE-1的水平升高，所述样品例如是已知或怀疑包含肿瘤细胞，例如循环肿瘤细胞(CTC)的样品。
[0048]上皮起源的癌症可以包括胰腺癌(例如，胰腺腺癌或管内乳头状粘液癌(IPMN，胰腺块))、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、或结肠癌。例如，可以使用本方法来区别良性IPMN(对其监视是标准的处理)和恶性IPMN(其需要切除，即一种与显著的发病率且小的但是显著的死亡概率有关的规程)。在一些实施方案中，在诊断为IPMN的受试者中，可以使用本文中所描述的方法来监视/监测受试者，例如，可以在选定的时间间隔(例如，每3、6、12、或24个月)重复所述方法以检测良性IPMN是否已经变为准许手术干预的恶性IPMN。另外，在一些实施方案中，可以在来自怀疑具有非小细胞肺癌的受试者的样品中使用所述方法来区别细支气管肺泡癌与反应性过程(例如，肺炎后反应性过程)。在一些实施方案中，在来自怀疑具有乳腺癌的受试者的样品中，可以使用所述方法来区别导管增生与非典型性导管增生和原位管癌(DCIS)。后两种种类接受切除/放射；前一种不需要干预。在一些实施方案中，在怀疑具有前列腺癌的受试者中，可以使用所述方法来区别非典型性小腺泡增殖和恶性癌症。在一些实施方案中，在怀疑具有膀胱癌的受试者中，可以使用所述方法来检测例如尿样本中移行细胞癌(TCC)。在一些实施方案中，在诊断为巴雷特(Barrett)氏食管的受试者中(Sharma, N Engl J Med.2009, 24; 361 (26): 2548-56.Erratum in:N Engl J Med.2010年4月15日；362 (15): 1450)，可以使用所述方法来区别巴雷特氏食管中的发育异常与反应性过程。临床含意是重大的，因为发育异常的诊断要求治疗性干预。其它实施方案包括但不限于诊断充分分化的肝细胞癌、壶腹和胆管癌、胶质瘤对反应性神经胶质瘤病(reactive gliosis)、黑素瘤对皮肤痣、低度肉瘤、和胰腺内分泌肿瘤，等等。
[0049]因此，本文中包括用于诊断受试者中的癌症的方法，所述癌症例如是上皮起源的肿瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。在一些实施方案中，所述方法包括自受试者获得样品，并评估样品中LINE-1或卫星的存在和/或水平，并与一种或多种参照比较所述存在和/或水平，所述`参照物例如是代表LINE-1或卫星的正常水平的对照参照，例如不受影响的受试者或来自同一受试者的正常细胞中水平，和/或代表与癌症有关的LINE-1或卫星的水平的疾病参照，例如具有胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌的受试者中的水平。
[0050]也可以使用本方法来测定癌症的阶段，例如样品是否包含来自癌前损伤、早期阶段肿瘤、或晚期肿瘤的细胞。例如，可以使用本方法来测定受试者是否具有癌前胰腺、乳腺、或前列腺损伤。在使用的标志物是LINE-1、或卫星转录物ALR和/或HSATII的情况中，升高水平与晚期阶段相关联。对于卫星转录物GSATI1、TAR1和/或SST1，降低水平与渐增的阶段相关联。另外，LINE-1和卫星ALR和/或HSATII的水平对于临床结果可以是预后的且预测的。
[0051]样品
[0052]在本方法的一些实施方案中，样品是或者包括血液、血清、和/或血浆、或其部分或亚级分，例如血清中游离的RNA或血液中外来体内的RNA。在一些实施方案中，样品包含(或怀疑包含)CTC。在一些实施方案中，样品是或者包含尿液或其部分或亚级分。在一些实施方案中，样品包含已知或怀疑的肿瘤细胞，例如是活组织检查样品，例如细针抽吸物(FNA)、内窥镜活组织检查、或芯针活组织检查；在一些实施方案中,样品包含来自受试者的胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠的细胞。在一些实施方案中，样品包含自痰样品或通过刷、清洗、支气管镜活组织检查、经支气管活组织检查、或FNA，例如支气管镜、荧光镜、或CT引导的FNA(也可以使用此类方法来自其它组织获得样品)自受试者的肺获得肺细胞。在一些实施方案中，将样品冷冻，固定和/或透化，例如是经福尔马林固定的经石蜡包埋的(FFPE)样品。
[0053]卫星表达水平
[0054]在一些实施方案中，例如在已知或怀疑包含肿瘤细胞的样品中检测卫星转录物的水平。在一些实施方案中，将已知或怀疑的肿瘤细胞(例如，测试细胞)中的卫星转录物水平与参照水平比较。
[0055]在一些实施方案中，所述方法包括检测alpha(ALR)卫星转录物(D.Lipson等，NatBiotechnol27, 652 (2009 年 7 月))或 HSATII 卫星转录物(J.Jurka 等,Cytogenet GenomeResllO, 462(2005))的水平；在一些实施方案中，将那些水平与参照比较。在一些实施方案中，参照水平是正常(非癌性)细胞，例如来自同一受试者的正常细胞中的ALR和/或HSATII卫星转录物水平，或自正常细胞分组测定的参照水平；测试细胞中高于正常细胞中的ALR和/或HSATII水平的ALR和/或HSATII水平的存在指示测试细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。在一些实施方案中，ALR和/或HSATII转录物的参照水平是阈值水平，并且高于阈值水平的ALR和/或HSATII卫星转录物水平的存在指示细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。
[0056]在一些实施方案中，所述方法包括检测GSATI1、TARl和/或SSTl转录物的水平；在一些实施方案中，将那些水平与参照比较。在一些实施方案中，参照水平是正常(非癌性)细胞，例如来自同一受试者的正常细胞中的GSATI1、TARl和/或SSTl卫星转录物水平，或自正常细胞分组测定的参照`水平；测试细胞中低于正常细胞中的GSATI1、TAR1和/或SSTl水平的GSATI1、TAR1和/或SSTl水平的存在指示测试细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。在一些实施方案中，GSATI1、TARl和/或SSTl转录物的参照水平是阈值水平，并且低于阈值的GSATI1、TAR1和/或SSTl卫星转录物水平的存在指示细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。
[0057]在一些实施方案中，相对非变体转录物诸如GAPDH、肌动蛋白、或微管蛋白标准化卫星转录物水平，例如将卫星的表达水平与非变体转录物比较。例如，可以计算表达水平的比率，并且可以将该比率与正常(非癌性)细胞中的比率比较。例如，在一些实施方案中，超过10:1，例如超过50: 1、超过100: 1、或超过150:1 ^ ALR:GAPDH比率的存在指示测试细胞是癌细胞；在一些实施方案中，约3:1或5:1的ALR:GAPDH比率的存在指示测试细胞是正常细胞。在一些实施方案中，超过10:1，例如20:1、30:1、40:1、或45:1的HSATII卫星:GAPDH转录物比率的存在指示测试细胞是癌细胞。在一些实施方案中，HSATII的显著(例如，t匕对的每百万的超过约100个转录物)水平的存在指示测试细胞是癌细胞。在一些实施方案中，HSATII的非常低的水平(例如，比对的每百万的小于约20个转录物)的缺乏或存在指示测试细胞是正常细胞。[0058]下文是可以用于ALR(包括其变体)和HSATII转录物的例示性参照序列:
[0059]>ALR SAT 人
[0060]aattctcagtaacttccttgtgttgtgtgtattcaactcacagagttgaacgatcctttacacagagcag acttgaaacactctttttgtggaatttgcaagtggagatttcagccgctttgaggtcaatggtagaatag gaaatatcttcctatagaaactagacagaat(SEQ ID NO:1)
[0061]>ALR1 SAT 人
[0062]teattctcagaaactretttgtgatgtgtgcrttcaactcacagagtttaacctttcttttgatagagca gtttggaaacactctgtttgtaaagtctgcaagtggatatttggacctctttgaggccttcgttggaaac gggatttcttcatataatgctagacagaaga(SEQ ID NO:2)
[0063]>ALR2 SAT 人
[0064]agctttctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctttcttttgattcagc agtttggaaacactgtttttgtagaatctgtgaagggatatttgggagctcattgaggcctatggtgaaa aagaaaatatcttcagataaaaactagaaggaagctatc(SEQ ID NO:3)
[0065]>ALRa SAT 灵长类
[0066]ctatctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctttcttttgattcagcag tttggaaacactgtttttgtagaatctgcgaagggacatttgggagctcattgaggcctatggtgaaaaa gcgaatatccccagataaaaactagaaagaag(SEQ ID NO:4)
[0067]>ALRa—SAT 灵长类
[0068]ttgtagaatctgcgaagggacatttgggagctcattgaggcctatggtgaaaaagcgaatatccccagat aaaaactagaaagaagctatctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcatctcacagagttaaacctt tcttttgattcagcagtttggaaacactgttt(SEQ ID NO:5)
[0069]>ALRb SAT 灵长类
[0070]ttgtggaatttgcaagtggagatttcaagcgctttgaggccaawnktagaaaaggaaatatcttcgtata aaaactagacagaataattctcagtaacttctttgtgttgtgtgtattcaactcacagagttgaaccttc ctttagacagagcagatttgaaacactcttt(SEQ ID NO:6)
[0071]>ALR—SAT 灵长类
[0072]ttgtagaatctgcaagtggatatttggasckctttgaggmcttcgktggaaacgggaatatcttcacata aaaactagacagaagcattctcagaaacttctttgtgatgtttgcattcaactcacagagttgaacmttc cttttgatagagcagttttgaaacactcttt(SEQ ID NO:7)
[0073]>HSATII SAT 灵长类
[0074]ccattcgattccattcgatgattccattcgattccattcgatgatgattccattcgattccattcgatga ttccattcgattccattcgatgatgattccattcgattccattcgatgattccattcgattccattcgat gatgattccattcgattccattcgatgatt(SEQ ID NO:8)
[0075]Line-1 水平
[0076]长散在核苷酸元件(LINE)非LTR反转录转座子(Singer, Cell28 (3):433 - 4 (1982))是一组大量存在于真核基因组中，并且生成插入突变，促成基因组不稳定性及革新，并且可以改变基因表达的遗传元件。
[0077]规范的全长LINE-1元件是长度约6千碱基(kb)，并且包括具有内部RNA聚合酶11启动子的 5’非翻译区(UTR) (Swergold, Mol Cell Biol.10(12): 6718-29 (1990))、两个可读框(称作ORFl和0RF2)和含有以可变长度的富含寡dA的尾部结束的多聚腺苷酸化信号的3’UTR(Babushok and Kazazian, Hum Mutat.28 (6): 527-39 (2007))。虽然存在有人基因组中插入的超过500，000个LI元件，但是仅约80-100个拷贝是有反转录转座能力的(Brouha等，Proc Natl Acad Sci USA.100 (9): 5280-5.(2003))。关于更多详情，见 Cordaux andBatzer, Nat Rev Genet.10(10):691 - 703(2009))。
[0078]例示性LINE-1序列包括变体(1)的GenBank参照号(Ref.N0.)NM_001164835.1 (核酸)和NP_001158307.1 (蛋白质);和变体2 (其是较短的转录物)的GenBank参照号ΝΜ_019079.4 (核酸)和ΝΡ_061952.3 (蛋白质)。变体2与变体I相比在5’UTR中有所不同，但是变体I和2两者都编码相同蛋白质。还可见Gene ID: 54596。
[0079]在一些实施方案中，本文中所描述的用于诊断癌症的方法包括测定细胞(例如，在存在于受试者血液中的CTC中)中的LINE-1mRNA水平以获得LINE-1数值，并将该数值与合适的参照数值比较，所述参照数值例如是代表阈值水平的数值，高于所述阈值水平，受试者可以诊断为癌症。参照也可以是数值范围，例如其指示受试者中癌症的严重性或阶段。可以通过本领域中已知的方法测定合适的参照数值。
[0080]在一些实施方案中，参照水平是正常(非癌性)细胞，例如来自同一受试者的正常细胞中的LINE-1转录物水平，或者自正常细胞分组测定的参照水平；测试细胞中高于正常细胞中的LINE-1水平的LINE-1水平的存在指示测试细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。在一些实施方案中，LINE-1转录物的参照水平是阈值水平，并且高于阈值水平的LINE-1转录物水平的存在指示细胞是肿瘤细胞(例如，测试细胞来源的受试者具有或可以诊断为癌症)。
[0081]检测方法
[0082]可以使用本领域中已知的任何方法来检测和/或量化生物标志物的水平，如本文中所描述的。例如，可以使`用本领域中已知的方法,例如Northern印迹、RNA原位杂交(RNA-1SH)、RNA表达测定法,例如微阵列分析、RT-PCR、深度测序(deep sequencing)、克隆、Northern印迹、和定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)来评估卫星转录物或LINE-1mRNA(转录物)的水平。测定RNA表达的分析技术是已知的。见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, NY(2001)。
[0083]在一些实施方案中，检测LINE-1蛋白的水平。可以使用本领域中已知的方法，例如，使用定量免疫测定方法诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶免疫测定法(EIA)、放射性免疫测定法(RIA)、和Western印迹分析来评估蛋白质的存在和/或水平。
[0084]在一些实施方案中，所述方法包括使选择性结合生物标志物，例如卫星转录物或LINE-1mRNA或蛋白质(诸如寡核苷酸探针、抗体或其抗原结合部分)的药剂与样品接触，以评估样品中生物标志物的水平。在一些实施方案中，所述药剂携带可检测标记物。术语“标记的”就药剂而言涵盖通过将可检测物质与所述药剂偶联(即，物理连接)直接标记药剂，及通过与可检测物质的反应性间接标记所述药剂。可检测物质的例子是本领域中已知的，并且包括化学发光、荧光、放射性、或比色标记物。例如，可检测物质可以包括各种酶、非朊基(prosthetic)基团、荧光材料、发光材料、生物发光材料、和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的非朊基基团复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和亲合素/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪基胺(dichlorotriazinylamine)突光素、丹磺酰氯、量子点、或藻红蛋白；突光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白，而合适的放射性材料的例子包括1251、m1、35S或3H。一般地，在要检测蛋白质的情况中，可以使用抗体。抗体可以是多克隆，或更优选的是单克隆。可以使用完整的抗体，或其抗原结合片段(例如Fab或 F(ab’)2)。
[0085]在一些实施方案中，可以使用高通量方法，例如如本领域中已知的蛋白质或基因芯片(见例如第12章，“Genomics, ”于Griffiths等编Modern geneticAnalysis，1999，ff.H.Freeman and Company;Ekins and Chu，Trends in Biotechnology,1999;17:217-218;MacBeath and SchreiberjScience2000，289 (5485):1760-1763;Simpson，Proteins and Proteomics:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress;2002;Hardimanj Microarrays Methods and Applications:Nuts&Bolts,DNAPress, 2003)来检测卫星或LINE-1的存在和/或水平。
[0086]在一些实施方案中，所述方法包括使用经修饰的RNA原位杂交技术使用分支链DNA测定法来直接检测并评估样品中的生物标志物mRNA的水平(见例如Luo等，美国专利 N0.7，803，541B2, 2010; Canales 等，Nature Biotechnology24 (9):1115-1122(2006) ;Nguyen等，Single Molecule in situ Detection and Direct Quantiication of miRNA inCells and FFPE Tissues,告不在 panomics.com/index.php?id=product_87 可获得)。用于实施此测定法的试剂盒可购自Affymetrix(ViewRNA)。
[0087]CTC中LINE-1和下星转录物的检测
[0088]在一些实施方案中，微射流(例如“芯片上的实验室(lab-on-a-chip) ”)装置可以在本方法中使用。此类装置已经成功用于微射流流式细胞术、基于大小的连续分离、和层析分离。一般地，可以使用在循环肿瘤细胞(CTC)中检测卫星或LINE-1的表达的方法来早期检测癌症，例如早期检测上皮起源的肿瘤，例如胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
[0089]可以使用所述装置来从细胞混合物分离CTC，或者制备富集的CTC群体。具体地，可以使用此类装置来从复杂的混合物诸如全血分离CTC。
[0090]可以使用多种办法来从异质样品分离CTC。例如，所述装置可以包含在区块屏障上游的微射流通道中以六边形包装样式排列的多个立柱(post)的阵列。可以用不同结合模块使立柱和区块屏障功能化。例如，可以用抗EPCAM抗体功能化立柱以捕捉循环肿瘤细胞(CTC)；见例如Nagrath等，Nature450:1235-1239 (2007)，任选地将下游区段屏障功能化以捕捉LINE-1核酸或蛋白质、或卫星。见例如(S.Maheswaran等，N Engl JMed.359，366 (2008 年 7 月 24 日)；S.Nagrath 等，Nature.450，1235 (2007 年 12 月 20 日)；S.L.Stott等，Sci Transl Med2, 25ra23 (3月31日))及本文中应用的申请和参考文献。
[0091]用于从样品富集特定颗粒的方法一般基于序贯加工步骤，每个所述步骤减少混合物中不想要的细胞/颗粒的数目，但是一个加工步骤在一些实施方案中可以足够。用于实施多个加工步骤的装置可以是分开的或者整合到一个微射流系统中。所述装置包括用于细胞/颗粒结合的装置、用于细胞裂解的装置、用于排列细胞的装置、和用于颗粒分离(例如基于大小、形状和/或变形性或其它标准进行)的装置。在某些实施方案中，使用加工步骤来减少细胞数目，之后将它们导入装置或系统中。在一些实施方案中，与初始样品混合物相t匕，装置保留至少75%，例如80%、90%、95%、98%、或99%期望的细胞，同时相对于一种或多种不想要的细胞类型，将期望细胞的群体富集至少100倍，例如1000、10，000、100，000、或甚至 1，000, 000 倍。
[0092]用于分离颗粒的一些装置依赖于在有或没有同时细胞结合情况下基于大小的分离。一些基于大小的分离装置包括引起CTC和其它流体组分的侧向移位，由此提供富集或以其它方式加工此类组分的机制的一个或多个障碍物阵列。依照大小分离颗粒的障碍物阵列通常限定缺口网络，其中将通过缺口的流体不相等地分入随后的缺口中。基于筛和阵列大小的分离装置两者可以相对于细胞结合装置选择性并入如上文所描述的透性障碍物。
[0093]包含形成缺口网络的障碍物阵列的装置可以包括例如交错的二维障碍物阵列，例如使得每个连续行以前一行的时段的小于一半补偿。也可以以不同样式排列障碍物。可能的障碍物性状和样式的例子在W02004/029221中更为详细地讨论。
[0094]在一些实施方案中，所述装置可以提供CTC的分离和/或富集，其使用基于阵列的大小分离方法进行，例如如记载于美国专利公开文本N0.2007/0026413的。一般地，所述装置包括选择性透性障碍物的一个或多个阵列，所述选择性透性障碍物引起流体样品中悬浮的大颗粒诸如CTC和其它组分的侧向移位，由此提供富集或以其它方式加工此类组分的机制，同时还提供选择性结合其它较小的颗粒的可能性，所述其它较小的颗粒可以穿过构成障碍物的纳米管(nanotube)的密集矩阵中的空隙。采用此类选择性透性障碍物进行颗粒的基于大小、形状、或变形性的富集的装置，包括滤器、筛、和富集或分离装置记载于国际公开文本 N0.2004/029221and2004/l 13877, Huang 等 Science304:987-990 (2004)，美国公开文本N0.2004/0144651，美国申请N0.5，837，115和6，692，952，及美国申请N0.60/703，833，60/704，067，和11/227，904 ;可用于亲和力捕捉的装置，例如那些记载于国际公开文本N0.2004/029221和美国申请流水号11/071,679的；可用于优先裂解样品中的细胞的装置，例如那些记载于国际公开文本N0.2004/029221,美国专利N0.5，641，628，及美国申请N0.60/668, 415的`；可用于排列细胞的装置，例如那些记载于国际公开文本N0.2004/029221,美国专利 N0.6，692，952，及美国申请流水号 10/778，831 和 11/146，581的；及可用于流体投递的装置，例如那些记载于美国申请N0.11/071，270和11/227，469的。两种或更多种装置可以连续组合，例如如记载于国际公开文本N0.W02004/029221的。所有前述参考文献通过提及并入本文。
[0095]在一些实施方案中，装置可以含有包含选择性结合特定细胞类型，例如上皮起源的细胞，例如肿瘤细胞的结合模块，例如单克隆抗EpCAM抗体或其片段的障碍物。装置的所有障碍物可以包含这些结合模块；或者，仅障碍物的亚组包含它们。装置还可以包含别的模块，例如细胞计数模块或检测模块，其与微射流通道装置处于流体通信中。例如，检测模块可以配置为显现装置的输出样品。
[0096]在一个例子中，检测模块可以与分离或富集装置处于流体通信中。检测模块可以使用本文中公开的任何检测方法，或本领域中已知的其它方法运行。例如，检测模块包括显微镜、细胞计数器、磁体、生物空腔(biocavity)激光器(见例如Gourley等，J.Phys.D:Appl.Phys.，36:R228-R239 (2003))、质谱仪、PCR 装置、RT-PCR 装置、微阵列、RNA 原位杂交系统、或超光谱(hyperspectral)成像系统(见例如Vo-Dinh等,IEEE Eng.Med.Biol.Mag.，23:40-49 (2004)) ο在一些实施方案中，可以连接计算机终端与检测模块。例如，检测模块可以检测选择性结合感兴趣的细胞、蛋白质、或核酸，例如LINE-lDNA、mRNA、或蛋白质、或卫星DNA或mRNA的标志物。
[0097]在一些实施方案中，微射流系统包含(i)用于分离或富集CTC的装置；(ii)用于裂解富集的CTC的装置；和(iii)用于检测LINE-lDNA、mRNA、或蛋白质、或卫星DNA或mRNA的装置。[0098]在一些实施方案中，使用如本文中所描述的微射流装置制备的CTC群体用于使用已知的分子生物学技术分析LINE-1和/或卫星的表达，例如如上文及在Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Cold Spring HarborLaboratory Press;第 3 版(2001 年 I 月 15 日))；及 Short Protocols in MolecularBiology, Ausubel 等编(Current Protocols;第 52 版(2002 年 11 月 5 日))中描述的。
[0099]一般地，本文中描述了用于检测和/或量化富集的CTC群体中卫星或LINE-1表达的装置，并且可以用于早期检测癌症，例如上皮起源的肿瘤，例如早期检测胰腺、肺、乳腺、前列腺、肾、卵巢或结肠癌。
[0100]监测疾病进展或治疗效力的方法
[0101]在一些实施方案中，一旦测定出对象具有癌症，或者具有升闻的形成癌症的风险，则可以施用治疗，例如如本领域中已知的。可以使用本文中所描述的方法来监测治疗的效力；可以治疗后(或期间)，例如在施用一剂或多剂治疗后评估别的样品，并且LINE-1j/或ALR和/或HSATII卫星表达水平降低，或样品中表达LINE-1jP /或ALR和/或HSATII卫星的细胞数目减少会指示治疗是有效的，而LINE-1jP /或ALR和/或HSATII卫星表达水平或表达LINE-1、和/或ALR和/或HSATII卫星的细胞没有变化或升高会指示治疗不是有效的(相反的事物对于GSATI1、TARl和/或SSTl卫星的水平当然会是正确的)。在治疗过程期间和/或已经终止治疗后可以将该方法重复几次，例如以监测潜在的疾病复发。
[0102]在一些实施方案中，例如，对于已经诊断为可导致癌症的良性状况的受试者，已经成功治疗癌症的受试者，或具有升高的癌症风险的受试者(例如由于遗传素因或环境暴露于癌症引起剂)，可以在选定的时间间隔，例如在3、6、12、或24个月时间间隔时重复所述方法，以监测受试者中的疾病，从而早期检测对恶性的进展或受试者中癌症的形成。
实施例
[0103]本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例没有限制权利要求书中描述的本发明的范围。
[0104]实施例1:与细胞系和IH常组织相比，主要卫星水平在肿瘤组织中大规模升高
[0105]利用来自Helicos BioSciences的下一代数字基因表达(DGE)应用(D.Lipson等，Nat Biotechnol27，652(2009年7月))来比较原发性癌症及其衍生的转移前体中的肿瘤标志物的表达。我们首先测定经由组织靶向性表达激活的Kras和Tp53的丧失生成的原发性小鼠胰管腺癌(PDAC) (KrasG12D, Tp53lox/+)的 DGE 概况(N.Bardeesy 等，Proc Natl AcadSci U S Α103，5947(2006年4月11日))。这些肿瘤是人PDAC的组织病理学和遗传模拟物，其展现出实质上普遍的突变体KRAS (>90%的病例)和ΤΡ53的损失(50-60%)。[0106]将具有不同基因型的胰腺癌的小鼠繁殖，如先前记载于Bardeesy实验室(Bardeesy 等，Proc Natl Acad Sci U S A103, 5947 (2006))的。正常的野生型小鼠购自Jackson laboratories。按照动物方案指南将动物实施安乐死。将胰腺肿瘤和正常组织在无菌情况下提取，然后用液氮快速冷冻。将组织于-80° C贮存。对于动物AH367和AH368生成新鲜的细胞系，如先前描述的(Aguirre等，Genes Devl7，3112 (2003))，并将建立细胞系在RPM1-1640+10%FBS+l%Pen/Str印(Gibco/Invitrogen)中培养。来自结肠和肺的其它小鼠肿瘤由 Kevin Haigis (Massachusetts General Hospital)和 Kwok-Kin Wong (DanaFarber Cancer Institute)懷慨提供。
[0107]将新鲜冷冻的组织在干冰上在微量离心管中用无菌杵棒磨碎。将细胞系培养，并在液氮中快速冷冻，之后进行核酸提取。来自细胞系及快速冷冻的肿瘤和正常组织的RNA
和DNA均以相同的方式加工。使用TR丨ζοΗ式剂(Invitrogen)按照制造商的用法说明书
提取RNA。使用QIAamp微量试剂盒(QIAGEN)按照制造商的方案提取来自组织和细胞系的DNA。[0108]将纯化的RNA进行数字基因表达(DGE)样品制备，并在来自Helicos BioSciences的HeliScope?单分子测序仪上分析。此方法先前已经描述过(Lipson等，NatBiotechnol27, 652(2009))。简言之，用 dTU25V 引物和 Superscript III cDNA 合成试剂盒
(Invitrogen)从RNA逆转录单链cDNA。将RNA消化，并用AgetlCOUrt? AMPure?磁珠使
用固相可逆固定化(SPRI)技术纯化单链cDNA。将单链cDNA变性，然后，使用末端转移酶(New England Biolabs)将多聚-A尾部添加至3’端。
[0109]将纯化的DNA进行来自Helicos的DNA测序样品制备方案，其先前已经描述过(Pushkarev, N.F.Neff, S.R.Quake, Nat Biotech27, 847 (2009))。简言之，用 Covaris S2 声学近距离声波定位器(sonicator)剪切基因组DNA,所述Covaris S2声学近距离声波定位器生成平均值200bp和范围为100-500bp的片段。然后，用SPRI清洁剪切的DNA。然后，将DNA变性，并使用末端转移酶将多聚A尾部添加至3’端。
[0110]然后，使加尾的cDNA或DNA与测序流动池杂交，接着是“填充和锁定(Fill andLock) ”和单分子测序。然后，使用DGE程序将基因表达序列阅读与已知的人或小鼠转录物组文库比对。将基因组DNA序列阅读与小鼠基因组比对，并计数以测定主要小鼠卫星(CNV)的拷贝数目。
[0111]分析的第一小鼠胰腺肿瘤AH284是值得注意的，因为与来自相同小鼠的正常肝转录物的3-4%差异相比，DGE序列与注释的小鼠转录物组展示48-52%差异。几乎所有差异的序列定位至臂间(主要)小鼠卫星重复。与正常胰腺或肝中的0.02-0.4%(196-4，115tpm)相比，卫星转录物占肿瘤中所有细胞转录物的约49%(495，42Itpm)(表1)。
[0112]表1
[0113]总基因组比对阅读及主要卫星和转录物组阅读的分类。括号中为占总基因组比对阅读的百分比