专利名称：癌症疫苗的制作方法近年来，在癌症免疫学中，依靠免疫细胞的癌症抗原识别机制已可非常清楚地判明。据此，首先，作为抗原呈递细胞的树突细胞(dendriticcell或DC)在细胞内、将由分解癌症中表达的蛋白质时所产生的8-10个氨基酸组成的抗原肽与主要组织相容性抗原复合体(majorhistocompatibility complex 或 MHC ;在人体中为 human Ieukocyteantigen 或HLA)一同在细胞表面上呈递。细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocyte或CTL)识别与树突细胞表面的HLA-1结合的抗原肽，活化并增殖，侵入肿瘤内，对具有来自抗原肽的蛋白质的癌症细胞产生细胞毒性(例如，参见Arch. Surg. (1990) 126:200-205)。利用所述机制，开发了作为癌症治疗方法的癌症疫苗。例如，在体外制造可在细胞表面上呈递来自癌症特异性蛋白质的抗原肽的树突细胞，使之增殖，并给药至癌症患者，或通过所述树突细胞，给药培育出的细胞毒性T细胞，由此在癌症患者体内诱导癌症免疫。或者，将癌症特异性蛋白质给药至癌症患者，从而在患者体内诱导癌症免疫机制的整个过程(例如，参见 Science (1991) 254:1643-1647; J. Exp. Med. (1996) 183:1185-1192; J.1mmunol.(1999) 163:4994-5004;Proc. Natl. Acad. Sc1. USA(1995)92:432-436;Science(1995)269:1281-1284;J. Exp. Med. (1997) 186:785-793)
发明要解决的问题然而，可有 效诱导癌症免疫的癌症特异性蛋白质在一部分癌症中，只知晓仅仅少数的实例。因此，本发明的目的是提供可有效诱导癌症免疫的肽、含有所述肽的组合物、呈递所述肽的抗原呈递细胞、由所述抗原呈递细胞刺激的T细胞和利用这些肽和细胞的癌症疫苗、以及使用它们治疗癌症患者的方法。解决问题的手段本发明的肽由KMHIRSHTL (序列号I)或RTFSRMSLL (序列号2)的序列组成。这些呈递肽的抗原呈递细胞和识别由所述抗原呈递细胞诱导而表达snail抗原的癌症细胞的T细胞都属于本发明的技术范围。所述T细胞优选细胞毒性T细胞。此外，表达snail抗原的癌症细胞优选胰脏癌细胞、黑色素瘤细胞、白血病细胞或结肠癌细胞。本发明的癌症疫苗的特征在于，其含有由序列号I或序列号2组成的肽之一或这两种肽、表达序列号I或2的肽的表达载体、在细胞表面上呈递由序列号I或2的序列组成的肽的抗原呈递细胞、或上述T细胞中的至少一种。此外，本发明的含有由序列号I或序列号2组成的肽之一或这两种肽的癌症疫苗也可含有这些肽以外的癌症抗原肽。进而，本发明的癌症疫苗优选针对表达snail蛋白质的癌症细胞的癌症疫苗。本发明的治疗和预防癌症的方法的特征在于，对人和人以外的脊椎动物使用本发明的癌症疫苗。在此，本说明书中的术语“癌症”意指源自上皮细胞的癌、非源自上皮细胞的肿瘤、血液癌症等新生物(neoplasm),而与癌症的来源无关。此外，在本说明书中，登记号为NM-005985 (序列号3)的基因称为人snail基因，当述及无动物种类限定的snail基因时，不只限于人基因，也包括其他动物种类的同源和直系同源。另外，登记号为NP-005976 (序列号4)的蛋白质称为人snail蛋白质，当述及无动物种类限定的snail蛋白质时，不只限于人蛋白质，也包括其他动物种类的同源和直系同源。交叉引用本申请主张基于2010年3月30日提交并申请的日本专利申请2010-78625的优先权，所述基础申请通过引用的方式包括在本说明书中。[图1]为示出本发明一个实施例中，健康人的正常组织中的snail基因的表达(A)和结肠癌患者的癌组织与同一患者的正常组织中的snail基因的表达(B)的图示。[图2]为示出本发明的一个实施例中，人胰脏癌细胞株、人黑色素瘤细胞株、人白血病细胞株、人结肠癌细胞株中的snail基因的表达的图示。[图3]为示出 本发明的一个实施例中，将用snail1、2、3和HERV-Henv、NY-ESO_l的各肽刺激培养HLA-A24阳性健康人外周血单核细胞得到的CTL，在O.1、I或10 μ g/ml的各肽的存在下与HLA-A24阳性抗原呈递细胞共培养时，CTL所引起的Y-干扰素产生量的测定结果的图表。[图4]为示出本发明的一个实施例中，将用snail3或NY-ES0-1刺激培养HLA-A24阳性健康人外周血单核细胞得到的CTL与表达snail的肿瘤细胞接触时的肿瘤特异性毒性率的测定结果的图表。[图5]为示出本发明的一个实施例中，将用snail1、2、3和HERV-Henv、NY-ESO_l的各肽刺激培养HLA-A02阳性健康人外周血单核细胞得到的CTL，在10 μ g/ml的各肽的存在下与HLA-A02阳性抗原呈递细胞共培养时，CTL所引起的Y _干扰素产生量的测定结果的图表。

通过RT-PCR的基因表达分析方法使用RNeasykit (Qiagen公司)，从健康人的正常组织、对结肠癌患者的癌症组织进行肉眼判断而获得的结肠正常部位和各种人肿瘤细胞株(胰脏癌、黑色素瘤、白血病、结肠癌)(参见图1、2)中提取出RNA，用AMV反转录得到cDNA。然后，使用下述引物，用iCycler (Biorad公司)扩增基因，通过电泳检测基因表达。另外，使用GAPDH基因的表达作为内标。Snail 用引物Forward 5，-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG-3’(序列号 5)Reverse 5，-ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG-3’(序列号 6)GAPDH 用引物Forward 5，-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3’(序列号 7)Reverse 5，-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3’(序列号 8)如图1A所示，健康人的正常组织中，在胎盘(Placenta)、睾丸(Testis)、黑色素细胞(Melanocyte)和结肠(colon)中检测出弱的snail基因表达，而在脑(Brain)、心脏(Heart)、肾脏(Kidney)、脾脏(Spleen)、肝脏(Liver)、胰脏(Pancreas)、胸腺(Thymus)、肌肉(Muscle)、骨髓(Bone marrow)、外周血单核细胞(PBMC)中未能检测出表达。此外，从进展程 度不同的结肠癌患者中采集的结肠癌的癌症组织(Tu)和同一患者的结肠的正常组织(目视判断)(N)中的snail基因表达示于图1B。在基于世界范围内通用的“美国癌症联合委员会(AJCC)”所规定的癌症患病期诊断基准进行分类的I期、IIB期、IIIB期全部进展程度的结肠癌组织中，与正常组织相比，检测出高的snail基因表达。进而，如图2所示，胰脏癌、黑色素瘤、白血病和结肠癌的各细胞株分别与正常的胰脏组织、黑色素细胞、外周血单核细胞和结肠组织相比，snail基因表达低。如此,snail基因可癌症组织特异性地进行表达。因此,可将snail基因的表达用于癌症的诊断，与此同时，将snail作为癌症抗原靶标的治疗方法对于各种脏器的副作用小，可适用于广泛癌症种类的患者。[实施例2]使用HLA-A24阳性健康人PBMC的CTL诱导本实施例表明，通过使用snail I和snail 3肽，由健康人的HLA-A24阳性PBMC可诱导识别各种肽而活化的CTL。首先，从HLA-A24阳性健康人(A、B)中如以下所述分离PBMC。首先，在采集的外周血中，加入1/10量的4%朽1檬酸钠，在Ficoll-Paque (Amersham公司)上分层并离心(1500rpm, 20分钟，室温)。分离出作为PBMC级分的包含PBMC的中间层。将2. 5 X IO7个PBMC漂浮在含有20ml 10%的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)中，加入10 μ g/ml下述snail 1-3的各肽，在37°C、5%C02环境下刺激培养6天。通过所述刺激培养，分化对各抗原肽反应的CTL。通过Myltenyi公司的抗体结合MACS磁珠方法，对所述CTL进行分离。另外，使用HERV-Henv肽(序列号10)和NY-ES0-1肽(序列号11)作为阳性对照。HERV-Henv肽和NY-ES0-1肽在HLA-A24阳性抗原呈递细胞上呈递而由CD8阳性T细胞诱导CTL、以及所述CTL识别HERV-Henv肽、NY-ES0-1肽而产生Y -干扰素是已知的。snaill:KMHIRSHTL (序列号 I)
snai 12:KAFSRPffLL (序列号 9)snai 13:RTFSRMSLL (序列号 2)HERV-HenviSYLHHTINL (序列号 10)NY-ES0-1:LLMWITQCF (序列号 11)通过刺激培养IX IO6个得到的CTL，在IL-2 (100U/ml, Peprotech公司)和用于分化诱导CTL的相同的肽(O.1、I或10 μ g/ml)的存在下，在含有10%FCS的RPMI1640培养基中与抗原呈递细胞共同培养，由此用肽刺激CTL。抗原呈递细胞通过以下方法制备将从用于分化诱导CTL的PBMC相同的健康人中得到的PBMC (完整细胞)在添加了 10 μ g/ml丝裂霉素C的含有IOml的10%FCS的RPMI1640培养基中漂浮培养2小时(37°C，5%C02)而钝化，然后用RPMI1640培养基洗涤。当呈递各肽的抗原呈递细胞以HLA-A24限制性的方式刺激 CTL 时，CTL 产生 Y-干扰素。使用人 Cytometric Bead Array 试剂盒(BDBiosciences公司)测定包含在培养上清液中的Y -干扰素值，检查CTL是否可识别在抗原呈递细胞上呈递的妝。图3示出添加O. 1-10 μ g/ml的各浓度的肽来共同培养CTL和抗原呈递细胞时，由健康人A和B的CTL所产生的Y-干扰素的产生量。另外，健康人A的图表中最左边的点为不添加任何肽的无添加组，健康人B的图表中的最左边的点为添加10 μ g/ml的阴性对照肽(KSPWFTTL，小鼠反转录病毒抗原pl5e肽，序列号12)的阴性对照组。在无添加组和阴性对照组中，仅产生100-500p g/ml的Y -干扰素。另一方面,在用snail I肽、snail 3肽、作为阳性对照的HERV-Henv肽和NY-ES0-1肽刺激的组中，Y -干扰素的产生量随着肽浓度的上升而显著增加(P < O. 01, t检验)如图3所示，Y-干扰素的产生量在肽浓度为10 μ g/ml时显示出最高值。明显的是，健康人A或B中Y-干扰素的产生量在添加10μ g/ml的snail I肽或snail 3肽的组中，与无添加组或阴性对照组相比显著地高(P < 0.01，t检验)，与作为阳性对照的HERV-Henv肽和NY-ES0-1肽相比程度相当或更高。由此,使用健康人的HLA-A24阳性PMBC，可得到在细胞表面上呈递snail I肽(序列号I)或snail 3肽(序列号2)的抗原呈递细胞。此外，用所述抗原呈递细胞刺激⑶8阳性T细胞，可分化诱导能识别在HLA-A24阳性抗原呈递细胞上呈递的各肽的CTL。[实施例3]识别snail3的CTL的肿瘤细胞毒活性本实施例表明，通过使用snail 3肽刺激培养PMBC而得到的CTL以HLA依赖性的方式对snail抗原阳性的肿瘤细胞具有毒活性。将从HLA-A24阳性健康人的血液中采集的PBMC用snail 3肽刺激培养而制备的CTL (参见实施例2，识别snail 3的CTL)和作为靶标细胞的人结肠癌细胞株C0L0320(HLA-A24 阳性，snail 阳性，NY-ES0-1 阳性)以 CTL:C0L0320=6. 25:1、12· 5:1、25:1 或 50:1的比例混合，在含有10%FCS的RPMI1640培养液中在37°C、5%C02的条件下培养6小时。使用Immunocyto Cytotoxity Detection Kit (MBL公司)检测杀伤的肿瘤细胞,按照所附说明书计算出肿瘤特异性毒性率。另外，在本实施例中，作为阳性对照，使用NY-ES0-1肽代替snail 3肽来进行PMBC的刺激培养。如图4所示，由识别snail 3的CTL引起的肿瘤特异性毒性率与识别作为阳性对照的NY-ES0-1的CTL的程度相当。此外，所述肿瘤特异性毒性率随着CTL混合比的增加而增加。由此，通过使用snail 3肽刺激培养PMBC而得到的CTL表现出对表达snail的肿瘤细胞的毒活性(参见图4A、B,白圈的图示)。此外，为了说明由识别snail 3的CTL引起的肿瘤细胞上的snail I抗原的识别是HLA依赖性的，在抗HLA抗体(HLA中和抗体，BioLegend公司，最终浓度10 μ g/ml)的存在下对识别snail 3的CTL和C0L0320细胞进行共同培养。如图4所示，与不添加抗HLA抗体的情况(参见图4A、B，白圈的图示)相比，在添加抗HLA抗体的组中，由识别snail 3的CTL引起的肿瘤特异性毒性率显著降低(参见图4A、B，黑圈的图示)。其结果表明，由识别snail 3的CTL引起的肿瘤特异性毒性以HLA依赖性的方式识别肿瘤细胞上的snail抗原。这些结果表明，通过使用snail 3肽刺激正常人的HLA-A24阳性的PMBC，可诱导对snail抗原阳性的靶标细胞具有细胞毒性的CTL，另外，由所述CTL引起的靶标细胞的snail抗原识别是HLA依赖性的。[实施例4]使用HLA-A02阳性健康人PBMC的CTL的分化诱导本实施例表明，使用snai 11肽分化诱导的CTL可以以HLA-A02依赖性的方式识别呈递snail I肽的细胞。首先，按照实施例2记载的方法从HLA-A02阳性健康人(D、E)中采血并分离PBMC，使用snail I肽进行一次刺激培养。本实施例使用HERV-Henv肽作为阳性对照，使用NY-ES0-1肽作为阴性对照。另外，已悉知，HERV-Henv肽通过在HLA-A02阳性抗原呈递细胞上呈递而由⑶8阳性T细胞诱导CTL，所述CTL识别HERV-Henv肽而产生Y -干扰素。此夕卜，还悉知，NY-ES0-1肽不与HLA-A02阳性抗原呈递细胞结合，不发生CTL的诱导。由此得到的CTL，在与实施例2相同的方式制备的HLA-A02阳性抗原呈递细胞和IL-2的存在下，在包含各肽(10 μ g/ml)的含有10%FCS的RPMI1640培养基中刺激24小时。当呈递肽的抗原呈递细胞以HLA-A02限 制性的方式刺激CTL时，CTL产生Y -干扰素。用人CytometricBead Array试剂盒(BD Biosciences公司)测定培养上清液中含有的Y-干扰素值,检查CTL是否可识别呈递肽的抗原呈递细胞。图5示出由健康人D、E的PBMC制备的CTL所产生的Y -干扰素的产生量。在健康人D和E中，用snail I肽和HERV-Henv肽(阳性对照)刺激的组，与用作为阴性对照的NY-ES0-1肽刺激的组相比，观察到显著更高的Y-干扰素的产生(P < O. 01，t检验)。另一方面，用snail2肽或snail 3肽刺激的组，与阴性对照相比，Y-干扰素的产生量降低。由此，snail I肽(序列号I)在来自健康人的HLA-A02阳性PBMC的抗原呈递细胞上呈递，由⑶8阳性T细胞诱导识别肽的CTL。进而，所述CTL可识别HLA-A02阳性呈递细胞上的snail I肽。工业适用性通过本发明，可提供可有效诱导癌症免疫的肽、在细胞表面上呈递所述肽的抗原呈递细胞、由所述抗原呈递细胞诱导的T细胞，以及含有这些肽、表达这些肽的表达载体、呈递这些肽的抗原呈递细胞或由所述抗原呈递细胞诱导的T细胞的癌症疫苗，还可提供使用所述癌症疫苗治疗和预防癌症的方法。


本发明的目的是提供用于预防和治疗癌症的癌症疫苗。可提供含有由序列号1(KMHIRSHTL)或序列号2(RTFSRMSLL)组成的可有效诱导癌症免疫的肽、在细胞表面上呈递所述肽的抗原呈递细胞、由所述抗原呈递细胞诱导的T细胞、以及含有这些肽、表达这些肽的表达载体、呈递这些肽的抗原呈递细胞或由所述抗原呈递细胞诱导的T细胞的癌症疫苗，还可提供使用所述癌症疫苗治疗和预防癌症的方法。