用于癌症治疗的方法

M·古埃拉巴莱斯皮, J·R·费尔南德斯马索, A·穆萨奇奥拉萨, J·希尔巴尔德斯, O·雷伊斯阿考斯塔, B·M·奥利瓦阿古雷斯

2013年2月6日

2011年5月31日

2010年5月31日

遗传工程与生物技术中心

A61P35/00GK102917725SQ201180026853

癌症 治疗 用于

1.用于癌症治疗的方法，其特征在于，增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位，这引起所述细胞的增殖的降低或阻断2.根据权利要求I的方法，其特征在于，使癌细胞与增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位的试剂相接触，或者向受试者施用包含增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位的试剂的组合物3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位的试剂包括具有标识为SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽4.根据权利要求3的方法，其特征在于，抑制与炎症相关的肿瘤的发展以及其转移5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述与炎症相关的肿瘤以及其转移位于结肠、直肠、食道、肺、前列腺、乳腺、胰腺或肝脏中6.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位的试剂包括哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有核定位序列(NLS)的COMMDl蛋白的DNA序列7.增加COMMDl蛋白的核定位的试剂在制备用于癌症治疗的药物中的用途8.根据权利要求7的用途，其中所述增加COMMDl蛋白的核定位的试剂为蛋白质、合成肽、核酸或用于基因疗法的载体9.根据权利要求8的用途，其中所述合成肽为具有标识为SEQIDNo. 3的氨基酸序列的肽10.根据权利要求8的用途，其中所述用于基因疗法的载体为哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列11.用于癌症治疗的药物组合物，其包含一种或多种增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位的试剂，以及药学上可接受的赋形剂或载体12.权利要求11的组合物，其中所述增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位的试剂为具有标识为SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽13.权利要求11的组合物，其中所述增加在癌细胞中COMMDl蛋白的核定位的试剂为哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列14.用于治疗癌症的药物组合，其包含一种或多种增加COMMDl蛋白的核定位的试剂，以及一种或多种对于癌症的标准化学疗法特异的药物15.权利要求14的药物组合，其中所述增加COMMDl蛋白的核定位的试剂包括具有标识为SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽，并且所述对于标准化学疗法特异的药物选自顺钼和5-FU16.权利要求14的药物组合，其中构成所述药物组合的一部分的所述试剂和所述药物在同一治疗过程中同时地、分开地或顺次地进行施用17.用于预防与慢性炎症相关的癌症的方法，其特征在于，增加在细胞中COMMDl蛋白的 核定位18.权利要求17的方法，其中在细胞中COMMDl蛋白的核定位的增加通过向有此需要的个体施用具有标识为SEQ ID No. 3的氨基酸序列的肽或包含所述肽的组合物来实现19.用于确定癌症患者的预后的方法，其特征在于，通过测定在所述患者的样品中COMMDl的核定位的存在或不存在，来将COMMDl用作预后标志物20.具有与COMM结构域结合的能力的肽，其特征在于，所述肽具有标识为SEQID No. 3的氨基酸序列21.权利要求20的肽用于治疗疾病的用途，其中COMMD家族的成员牵涉所述疾病的进展

本发明属于生物医学领域，特别是涉及癌症治疗的生物医学领域，通过揭示出用于抗癌药物开发的新的治疗靶所述药物由于其更大的选择性和效力而有助于改进癌症患者的目前治疗描述了用于通过COMMDl蛋白的核表达和积累来治疗癌症的方法在肽HARIKPTFRRLKffKYKGKFff的一级结构中所引入的化学修饰增加了 COMMDl的核定位并提高了该肽的体外和体内抗肿瘤活性现有技术尽管在癌症治疗方面有着巨大的进展，但是由于肿瘤细胞形成对于目前的抗癌药物的抗性，因而在开发具有新的作用方式的新的抗肿瘤试剂方面存在有大利益由于其作为重要生物学功能的介体的作用以及其独特的固有特性(这使它们成为特别有吸引力的治疗试剂)，因而肽作为新的治疗药物仍然具有大利益肽显示出高的生物学活性，伴有低的毒性和高的特异性由于这些特征而造成的益处包括增高的对于所希望的靶标的结合特异性，使药物-药物相互作用最小化，和表现出更小的在组织中的积累，从而降低了由于中间代谢物而引起的并发症的风险(Vlieghe等人，2010，Drug Discovery Today, 1540-56)目前，存在有这样的抗癌治疗，其使用具有对于特定靶蛋白的结合选择性的肽和/或小分子，所述靶蛋白在癌症发展中具有重要的生物学功能在第一种情形下，可以将这些治疗导向抑制蛋白质的特定功能，并且作为主要事件而引起癌细胞凋亡，例如热休克蛋白(HSP)的抑制剂(Subbarao 等人，2004，Pharmacology & Therapeutics, 101227-257);酪氨酸激酶的抑制剂(Garrido等人，2007，Rev Med Chil，101327-1332)在大多数情况下，这些蛋白质在恶性过程中是异常的，如果与正常组织相比较在第二种情形下，药物与靶蛋白相结合，所述靶蛋白在恶性过程中可以是或不是异常的(与正常组织相比较)；在这种情况下，在恶性过程中被激活的信号传导途径受到影响，例如脱氧核糖核酸(DNA)复制的抑制剂、微管装配的抑制剂和转录因子NFkB的抑制剂尽管第一种情形在特定的造血系统恶性肿瘤中是高度有效的，但是它们中的大多数在实体肿瘤的复杂性下具有有限的有效性相反地，第二种情形包括一些在肿瘤学药典中最有效和甚至最具有毒性的药物为此原因，需要在 寻找新药物方面有所前进，所述新药物越来越是选择性的和有效的，从而使其毒性最小化在这个意义上，鉴定新的治疗靶和了解其在癌症发展中的作用有助于鉴定出新的药物抗性机制，并促进设计出保留更大的活性并可以与现有的药物相组合的新药物，从而降低这些药物的毒性并提闻癌症患者的生活质量COMMDl 蛋白，以前称为 MURRl (van de Sluis 等人，2002，Human MolecularGenetic, 11165-173)，属于一个新的蛋白质家族，其首字母缩写为COMMD (铜代谢基因MURRl结构域，缩写为C0MMD)该家族的十个蛋白质成员在多细胞生物中是高度保守的并且遍在地表达，然而其大多数成员的生物学功能尚不知晓该家族的主要特征是存在有保守且独特的COMM结构域(铜代谢Murrl结构域)，其包含在C-末端的氨基酸残基 110-190 之间(Burstein 等人,2005, The Journal of BiologicalChemistry, 28022222-22232)COMMDl牵涉各种不同的生物学过程，例如铜代谢的控制(Tao 等人，2003，Journal of Biological Chemistry, 27841593-41596);钠的细胞内运输的调节(Biasio 等人，2004，Journal of Biological Chemistry, 2795429-5434);转录因子 NFkB 的抑制(Maine 等人，2007，The EMBO Journal, 26436-447);由低氧诱导因子HIF-I α 所调控的基因的表达的抑制(van de Sluis 等人，2007，Molecular and CellularBiology, 274142-4156)COMMDl显现出与 转录因子NFkB的RelA(p65)亚基、与因子HIF-1 α的催化性亚基-α和与上皮钠通道中的Delta ENaC的物理相互作用在所有情况下，该相互作用导致这些“客户”蛋白质的降解，其通过涉及遍在蛋白化和经由蛋白酶体的降解的机制已证明，COMM结构域参与蛋白质-蛋白质相互作用，不仅对于C0MMD1的“客户”蛋白质，而且还对于该家族的成员之间的相互作用存在有关于C0MMD1的N-末端区域的三维结构的提议，但还不存在关于COMM结构域的三级结构(Sommerhalter等人，2007, Journal of MolecularBiology, 365715-721)借助于遍在蛋白化和蛋白酶体降解(通过位于COMM结构域中的一系列亮氨酸残基)的过程，在细胞中C0MMD1的基础表达受到控制(Maine等人，2009，BiochemicalJournal, 417601-609)最近，描述了 C0MMD1具有这样的机制，该机制构成通过也位于其COMM结构域中的核输出信号(NES)的细胞质-细胞核转运已报道，亮氨酸序列的破化和/或抑制蛋白酶体降解的试剂造成在细胞中C0MMD1的表达的增加此外，C0MMD1中的NES序列的破坏增强因子NFkB和HIF-I α的转录活性的抑制(MulIer等人，2009，Traffic, 10514-527)异常的赘生性细胞过表达不同的抗凋亡蛋白质，例如抑制凋亡的蛋白XIAP和簇集蛋白(CLU)，其加速非雄激素依赖型前列腺癌的进展这两种蛋白质都有利于C0MMD1的遍在蛋白化和蛋白酶体降解，从而促进NFkB的激活和肿瘤细胞的存活据报道，蛋白酶体的抑制剂，例如 MG132 (Shirley 等人，2005，Neoplasia, 71104-1111 ；Zhou 等人，2009, Cancer Research, 21333-339)，具有通过抑制遍在蛋白化和蛋白酶体降解的机制的抗肿瘤效应与XIAP结合的化合物通过阻断该蛋白质对于胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9激活的抑制效应来诱导凋亡(Vogler等人，Cancer Research, 2009, 692425-2434)已提出，被设计用于抑制CLU的功能的干扰核糖核酸(iRNA)具有抗肿瘤效应，通过使因子NFkB的细胞质抑制剂(称为I-kB)稳定化(Zoubeidi等人，2010，Molecular CancerResearch, 819-30)在国际专利申请WO 07/095867中，发明的实质涉及源自LALF (鲎抗脂多糖因子)蛋白的32-51区域的肽，其中进行了确保瓦解与细菌脂多糖(LPS)结合的能力的氨基酸置换，并且其具有抗肿瘤和免疫调节效应这些肽之一为称为肽L2的肽此外，在另一个发明(国际申请PCT/⑶2008/000006)中，揭示了上面所提及的肽穿透入细胞中的能力然而，在所述发明中，既没有公开也没有暗示这些肽的作用机制目前,存在有众多旨在治疗癌症的疗法(化学疗法、放射疗法、免疫疗法等),它们中的许多还处于临床试验阶段中但是，仍然有着与这些疗法相关的缺点，例如低选择性、毒性和形成药物抗性在该领域中要考虑的另一个重要方面是选择可用作药物效力的诊断物和/或预测物的生物标志物因此，仍存在有研究和发现新分子的需要，所述新分子在癌症的治疗和/或诊断中，以及在具有更低毒性的、越来越选择性和有效的药物的设计中是有用的发明描述本发明通过描述用于通过增加COMMDl蛋白的核定位来治疗癌症的方法而解决了上面提及的问题所述增加引起癌细胞的增殖的降低或阻断在本发明中，首次揭示了，在癌细胞中肽L2 (其序列为HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW，SEQ ID No. I)与COMMDl相互作用，并且COMMDl的核定位与癌细胞的的死亡相关由此，本发明提供了 COMMDl蛋白在鉴定具有抗肿瘤活性的化合物中的用途，所述化合物促进COMMDl的核积累和定位在本发明中所提供的数据证明，抗肿瘤肽L2与COMMDl相互作用，特别是在包含于COMMDl的氨基酸110-190之间的区域中此外，肽L2引起COMMDl的核积累此外，在本发 明中首次报道了，携带核定位序列(NLS)的COMMDl蛋白的表达足以诱导癌细胞的死亡因此，本发明首次证明了 COMMDl在癌症的治疗中作为治疗靶的用途此外，从肽L2的序列(SEQ ID No. I)开始，优化了肽L552 (SEQ ID No. 3)，以引起COMMDl在核中的积累并提高所述肽的体外和体内抗肿瘤效应经优化以促进COMMDl的核定位的在本发明中所描述的肽L552 (SEQ ID No. 3)具有下述序列Ac-HARIKpTFRRIKffKYKGKFff SEQ ID No. 3所述优化基于进行化学修饰，通过在特定位置(其在上面所包括的序列中以小写和粗体来表示)处用非天然氨基酸(D-氨基酸)置换天然氨基酸和借助于乙酰化(在上面所包括的序列中标明为Ac-)的对于N-末端的保护这些对于肽L2的序列(SEQ ID No. I)所进行的并且导致产生肽L552 (SEQ ID No. 3)的修饰，确保了 COMMDl在核中的更大的积累以及肽L552相对于原始肽L2而言的抗肿瘤活性的提高因此，肽L552是新的一个类别的分子，其与COMMDl相互作用，从而促进COMMDl的核定位并引起癌细胞增殖的抑制增加COMMDl蛋白的核定位的试剂在制备用于癌症治疗的药物中的用途也是本发明的目标在促进COMMDl的核积累的试剂或化合物之中，可以包括例如蛋白质(包括抗体)、突变蛋白、肽、多核苷酸、适体、核酸和有机小分子这些化合物可以从天然来源分离，以合成或重组方式进行制备，或者它们的任何组合在一个特别的实施方案中，增加COMMDl蛋白的核定位的试剂为肽L552(SEQ ID No. 3)在本发明的背景下，提高或增加COMMDl的核定位与使COMMDl蛋白在细胞核中积累具有相同的含义在另一个特别的实施方案中，增加COMMDl蛋白的核定位的试剂可以是核酸类型的，例如哺乳动物细胞表达载体，其包含编码含有NLS的COMMDl蛋白的DNA序列该类型的载体可以用作基因疗法此外，用于治疗癌症的药物组合物也是本发明的一部分，所述药物组合物包含增加COMMDl蛋白的核定位的试剂在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含有效量的增加COMMDl蛋白的核定位的试剂(通过其半数抑制浓度(IC5tl)而测定的)以及药学上可接受的赋形剂或载体该组合物可以通过肠胃外途径或通过局部途径进行施用包含增加COMMDl蛋白的核定位的试剂的药物组合物的施用构成了用于治疗或预防受试者中的实体肿瘤的方法，其中该方法包括以有效量施用促进COMMDl的核定位的试齐U，以降低或阻断肿瘤细胞的生长在本发明的一个实施方案中，可以向白血病(特别是髓细胞白血病)患者施用增加COMMDl蛋白的核定位的试剂，从而阻断癌细胞的增殖，甚至在炎症刺激存在下在本发明中证明，可以将肽L552与标准化学疗法相联合地进行使用，以产生协同效应和减少细胞抑制剂(例如，顺钼和5-氟尿嘧啶(5-FU))的剂量因此，用于治疗癌症的药物组合也是本发明的目标，所述药物组合包含一种或多种增加COMMDl蛋白的核定位的试剂，以及一种或多种对于癌症的标准化学疗法特异的药物在本发明的一个实施方案中，所述试剂为肽L552，并且所述对于标准化学疗法特异的药物选自顺钼和5-FU在所述药物组合中，构成所述药物组合的一部分的所述试剂和所述药物可以在同一治疗过程中同时地、分开地或顺次地进行施用另一方面，炎症与癌症之间的关系是现今已接受的事实目前，炎症微环境被列为肿瘤的特点，其归类在由Hanahan和Weinbergs (Perwez等人,2007, Int JCancer, 1212373-2380)所描述的癌症的六个最重要的特征之中本发明中所提供的数据表明，在炎症刺激存在下，肽L552在阻断癌细胞生长方面 是有效的同样地，携带NLS的GFP-NC0MMD1蛋白的表达在癌细胞中促进相同的效应更特别地，结果显示，肽L552在炎症刺激例如LPS和肿瘤坏死因子(TNF-α )存在下促进癌细胞的死亡同样地，体内实验数据证明了该肽在结肠肿瘤的鼠类模型中的有效性，其中用通过注射LPS而造成的炎症刺激来攻击小鼠为此，本发明还提供了用于抑制与炎症相关的肿瘤的发展以及其转移的方法，其包括向有此需要的受试者施用肽L552在与炎症相关的肿瘤以及其转移中存在有例如下述类型的癌症结肠直肠癌、食道癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌此外，还可以以预防的方式进行肽L552的施用，以预防与慢性炎症(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、肝硬化等)相关的癌症的发展因此，用于预防与慢性炎症相关的癌症的方法也是本发明的目标，所述方法的特征在于，向有此需要的个体施用肽L552或包含所述肽的组合物关于用包含肽L552 (作为增加COMMDl的核定位的试剂)的组合物要遵从的治疗剂量和方案，技术人员可以容易地确定(预防性或治疗性)治疗的剂量和方案有效量可以依据各个组合物的相对功效而变化，并且可以基于该肽的分子量和在体外或在动物研究中的IC5tl来进行计算例如，在知晓所述化合物(化学结构)的分子量和有效实验剂量(IC5tl)的情况下，可以常规地计算出以mg/Kg体重表示的剂量通常,所述剂量为O. 2-4mg/Kg体重该肽或包含其的组合物可以每周地或甚至每几个月地施用一次或多次本发明还涉及COMMDl作为新的用于癌症患者的预后标记物的用途，通过测定在样品中COMMDl的核定位的存在或不存在同样地，肽L552提供了用于治疗疾病的活性试剂，在所述疾病中COMMD蛋白起作用或者牵涉该疾病的进展这是可能的，例如在那些这样的疾病中，在所述疾病中COMMD家族的一些成员的量增加或减少和/或其活性提高或降低，并且这造成该疾病肽L552与包含在COMMD蛋白的C-末端的氨基酸残基110-190之间的COMM结构域相结合的能力支持了该肽的治疗活性附图简述图I.图解说明了肽L2与COMMDl蛋白之间的物理相互作用，其中使用酵母双杂交技术作为阴性对照，采用用空载体PGBKT7转化的酵母菌株AH109与转化到菌株Y187中的COMMDl片段的每种构建物的交配为了鉴定相互作用，进行用携带L2序列的载体转化的菌株AH109与转化到菌株Y187中的COMMDl片段的每种构建物的交配作为阳性对照，采用携带转录因子GAL4的pCLl的交配如所观察到的，用携带COMMDl基因的完整序列的质粒和包含COMMDl蛋白的氨基酸110-190的构建物，出现相互作用图2. (A)图解说明了肽L2与COMMDl的相互作用的验证，通过在SW948细胞中的免疫沉淀技术(pulldown)在该实验中，添加100 μ g的总蛋白质(TP)和在大肠杆菌(Escherichia coli)中获得的重组COMMDl蛋白(C0MMDlr)，MW (分子量标准)(B)图解说明了在用肽L2处理的SW948细胞中COMMDl的亚细胞定位在核中COMMDl的表达(N)，在细胞质中COMMDI的表达(C)，未处理的细胞(NT )β -肌动蛋白为细胞质级分的对照，hnRNP为核级分的对照图3. (A)图解说明了通过经优化的肽L552而引起的更大的COMMDl的核积累(B)显示了在免疫沉淀(pulldown)实验中，在不同的肿瘤细胞系中L552与COMMDl蛋白之 间的相互作用用滞蛋白7 (CUL7)未检测到相互作用在所述不同的细胞系中，显示了在总蛋白质提取物中β_肌动蛋白的存在图4.在不同组织学来源的肿瘤细胞中所述肽的抗增殖效应，L0(从外周血分离的人淋巴细胞)图5.在TC-I肿瘤模型中肽L552的抗肿瘤效应(A)显示了肿瘤块的生长抑制曲线(B)显示了不同实验组的累积存活百分比图6.图解说明了含有核定位序列的COMMDl蛋白的表达足以诱导细胞死亡显示了在72小时时用溴化乙锭染色的非活细胞的百分比，作为用携带作为阴性对照的绿色荧光蛋白(GFP)的构建物、构建物GFP-C0MMD1和核定位构建物GFP-N-C0MMD1进行的转染的结果图7. (A)显示了在用构建物GFP-NC0MMD1转染的结肠癌细胞HT-29中对于5-FU的化学敏感性指明了 IC5tl值(B)图解说明了通过添加LPS和TNF-α而引起的炎症环境对于IC5tl的影响图8.图解说明了在不同的炎症刺激存在下，肽L552对于癌细胞增殖的效应在用LPS和TNF-α处理的人髓细胞白血病细胞(THP-1) (A)和鼠类结肠癌细胞(CT-26) (B)中测定ic5(l图9.在经历了通过注射LPS而引起的炎症刺激的BALB/c小鼠中，在结肠癌模型中肽L552的抗肿瘤效应(A)显示了不同实验组的累积存活百分比(B)显示了关于每个实验组的肿瘤块的体积的平均值实施例实施例I.肽L2与COMMDl之间的物理相互作用为了鉴定抗肿瘤肽L2-蛋白质相互作用，使用酵母双杂交系统为了克隆相应于该肽的序列，设计了下列寡核苷酸L2F CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGGGTAAGTTCTGGTAAL2R GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTTGATTCTAGCGTG其相应于肽序列L2 HARIKPTFRRLKWKYKGKFW为了将这些序列克隆在载体pGBKT7 NcoI-BamHI中，在这些寡核苷酸的末端添加与这些位点互补的序列通过限制酶切分析和测序来验证携带肽序列L2的重组质粒PGBKL2-1通过乙酸锂方法来将该质粒转化到酵母菌株AH109中，并接种在SD-Trp培养基中验证了，当接种在SD-Trp-His平板中时，不能自我激活为了筛选相互作用，使用转化到菌株Y187中的源自人肝脏cDNA的文库为了形成二倍体和选择相互作用，使5X IO8个包含质粒PGBKL2-1的AH109细胞与5 X IO8个包含人肝脏DNA文库的Y187细胞一起在30°C 下在YPDA固体培养基中生长4小时在YPDA培养基平板上，在其表面上添加IOml无菌水，并且用刮刀小心地使细胞重悬浮，并转移至15个SD-Trp-Leu-His-Ade基本培养基平板，并在30°C下生长7天将所得的74个菌落转移到在96-深孔平板中的SD-Trp-Leu液体培养基中在观察到在液体培养基中的生长后，进行酵母DNA的纯化将每一个这些DNA独个地转化到大肠杆菌菌株DHlOB中，纯化其DNA并保存于_20°C将这些独个克隆中的每一个转化到酵母菌株Y187中，并通过与用质粒PGBKT7和pGBKL2_l转化的菌株AH109进行交配来验证相互作用对阳性克隆的DNA进行测序通过BLAST程序(Altschul等人，1990. JMol Biol, 215403-410)的序列分析揭示出，这些克隆之一(L2-21)相应于编码COMMDl蛋白的氨基酸6-190的基因的序列，并且该克隆能够与包含肽序列L-2的质粒相互作用为了明确地鉴定出负责所述相互作用的COMMDl蛋白的区域，对于质粒PGBKL2-1构建物进行缺失，从而产生克隆 pGBKL2 (6-110)、pGBKL2 (6-70)、pGBKL2 (71-190)、pGBKL2 (110-190)如在图I中所看到的，仅在质粒PGBKL2 (110-190)中保留了相互作用，该质粒包含负责对于COMMD家族的蛋白质所描述的相互作用的COMM结构域该结果说明，肽L2与包含在氨基酸110-190之间的区域特异性地结合实施例2.使用肽L2的免疫沉淀以及COMMDl的核积累的实验所述实验分为两块(A)使通过使用固相方法合成的合成肽L2(SEQ ID No. I)生物素化，并用作结合至链霉抗生物素蛋白琼脂糖树脂的“诱饵”作为“捕获物”，使用肿瘤细胞系SW948(人结肠癌)的蛋白质提取物这些实验被称为“pulldown”使用提取缓冲液(Triton X-1000. 5%;25mMHEPES, pH 7. 5; IOOmM NaCl; ImM EDTA;10% 甘油;ImM 二硫苏糖醇(DTT)，和蛋白酶抑制剂)，从2X IO7个细胞获得蛋白质提取物将所述生物素化的肽(300 μ g)与50 μ L链霉抗生物素蛋白琼脂糖树脂(GE Healthcare) —起温育一小时，并用磷酸缓冲盐水(IX PBS)+ImMDTT进行洗涤然后，将500 μ g总蛋白质与50 μ L含有所述生物素化的肽的树脂一起在环境温度下温育5小时然后，用IX PBS和ImM DTT充分地洗涤所述树脂保持与树脂相结合的蛋白质是与所述肽相互作用的那些，并且将其悬浮在25 μ L电泳缓冲液(62. 5mM TrisHCl; pH 6. 9; O. IM DTT, 20%十二烷基硫酸钠(SDS)，10%甘油和O. 01%溴酚蓝)中为了检测目的蛋白质，进行在聚丙烯酰胺凝胶(7. 5%)中的电泳，随后通过“Western印迹”进行免疫检测为了检测COMMDl蛋白，使用抗-COMMDl单克隆抗体(Sigma，cion 2A12)使用总蛋白质提取物(100μ g)和在大肠杆菌中获得的重组蛋白C0MMD1在图2A中呈现的结果显示，当与总蛋白质提取物进行比较时，在该“pulldown”实验中肽L2浓缩了 COMMDl蛋白这是L2与COMMDl之间的相互作用的指示(B)将 SW948 细胞(3 X IO6 个细胞)与肽 L2 (50 μ M) —起在 37 °C 和 5%C02 下温育5小时然后，按照所报道的(Vancurova等人，2001，Journal of BiologicalChemistry, 27619746-19752),进行胞质蛋白质和核蛋白质的细胞分级分离使用抗-C0MMD1抗体，通过“Western印迹”来进行C0MMD1的检测图2B显示了在用肽L2处理的SW948细胞中C0MMD1的核定位为了检验所述细胞分级分离，使用β _肌动蛋白作为细胞质级分的对照，和使用人核糖核蛋白(hnRNP)作为核级分的对照实施例3.肽L552的优化以用于C0MMD1的核积累假定肽L2与C0MMD1蛋白相互作用并且这与C0MMD1的核定位相关，那么从L2(SEQID No. I)开始设计不同的肽，其目的是以所述肽变体加强C0MMD1的核积累使用固相方法来合成本发明的肽将粗制的肽用30%乙酸溶液进行提取，冻干，然 后通过反向色谱法RP-HPLC进行纯化借助于质谱法来验证经纯化的肽的分子量所得的制备物对于其在动物和人中的施用来说是非抗原性的、非致热性的和药学上可接受的如在表I中所显示的，通过在原始肽序列L2 (其序列为HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ IDNo. I 中在特定位置处引入D-构型的氨基酸，在特定位点处进行置换在一种情况下，还通过乙酰化封闭了 N-末端表I.在本发明中所使用的肽的序列