专利名称：一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及其基因和应用的制作方法 甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以1，4_β -D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。β -甘露聚糖酶(β -l，4-D-mannan mannohydrolase,EC3. 2. 1. 78)是一种能降解甘露聚糖主链的水解酶，属于半纤维素酶类。甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、饲料、医药、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。许多微生物，植物和一些低等动物中都存在β -甘露聚糖酶(Millwarch&idler， et al FEMS Microbiol. Lett. 1996. 141 183-188)。微生物是 β -甘露聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。但天然菌株所产的甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。随着分子生物学的发展，部分甘露聚糖酶的编码基因已被克隆并进行了异源表达(Dhawan and Kaur, Crit. Rev. Biotechnol. 2007. 27 197-216 ；Moreira and Filho，Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. 79 165-178.)。根据催化域氨基酸序列及结构的相似性，β -甘露聚糖酶多被划分为糖苷水解酶家族5，11或 113(Henrissat and Bairoch, Biochem. J. 1993. 293 :781-788)。不同来源的甘露聚糖酶因性质上的差别，其应用范围和价值也不尽相同。国内外研究和报道较多的细菌产甘露聚糖酶多为中性或碱性酶，包括芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌、 放线菌等。而真菌来源的β-甘露聚糖酶多为酸性，它们作用的最适PH值在2.4 5.0，其中有些甘露聚糖酶能够PH 8.0下有活性，但高于ρΗ 8.0后不再有活性(Dhawan and Kaur, Crit. Rev. Biotechnol. 2007. 27 :197-216)。本发明得到了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶在碱性PH条件下有高活性并具有强耐碱性，同时，该甘露聚糖酶在酸性和中性条件下有高的酶活性，较好的耐热性和极好的抗蛋白酶能力，可应用于动物及鱼类的饲料，应用于食品、医药等工业，同时还可以应用于造纸及纺织印染行业。
本发明再一目的是提供来源于真菌的耐碱β -甘露聚糖酶。本发明的再一目的是提供上述甘露聚糖酶的基因。本发明的再一目的是提供包含上述β -甘露聚糖酶的重组载体。本发明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备耐碱β -甘露聚糖酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述耐碱β-甘露聚糖酶的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、食品、酿酒、造纸以及能源工业中应用新的β -甘露聚糖酶。[OO12] 从上述真菌中获得了一种耐碱13一甘露聚糖酶Man5A，其氨基酸序列如SEQIDNO．1[OO13]1MHI STARLLT TSLLASVVAA APHVPKTSKF LTVEGGKFK1GGKDFHFAGS[OO 14]5 1NAYYFPFNGN QQD I EKGLTA AKNAGLSVFRTWGFNDKNSTY I PGGLPNYG[OO15] 10 1GEGAGPSEVV FQwwHPNGTT TIDVSGFDKV VRAAEKVGIK LIVALTNNwA[OO16] 151DYGGMDVYTV NLGGQYHDDF YTMPKIRNAF KRYIKEFVTR YKDSPVIAAW[OO17] 20 1ELANEPRCGA DGVRNLPRSP NCTPAVLSAW IAEMSAYIKS LDRNHLVTWG[OO 18] 2 5 1GEGGFNRQSD DWAYNGSDGG DFDHELSLDT I DFGVFHSYP DWWGKTVEWT[OO19] 30 1HQWIRDHAAA GRRARKPVVH EEYGWLTPDK RLEYTGRVDN RTRVEVLGGW3 5 1QRLTVEEKLA GSMYWQYGYS SYSYGRNHND GFT I YLDDEE AKVLVYQHAR
40 1EMNALNRHAH
3 5 1SYSYGRNHND GFT I YLDDEE AKVLVYQHAR EMNALNRHAH本发明还提供了编码上述耐碱13一甘露聚糖酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ工D N。．3所示 1ATGCACATCT CGACTGCAAG GTTGCTGACC ACCAGCCTCCTGGCTAGTGTCGTTGCTGCG 6 1GCGCCGCATGTTCCCAAGAC GTCGAAGTTC CTCACTGTGG AAGGGGGGAA GTTCAAGCTT 1 2 1GGGGGGAAAG ACTTCCACTTTGCGGGAAGC AACGCTTACTATTTCCCGTTCAATGGGGTA
42 1TGGCATCCTA ACGGAACAAC CACGATCGATGTTAGCGGCTTCGACAAGGTTGTTCGGGCC 48 1GCGGAAAAGGTGGGAATCAA GCTCATTGTTGCCTTGACGA ACAATTGGGC CGACTATGGC 54 1GGAATGGACGTATACACAGT GAACCTCGGC GGCCAATACC ACGACGATGTAGGTCGATCT
(3) BMGY 培养基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4. 0。
说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 β -甘露聚糖酶编码基因man5A的克隆 真菌Yl分离自河北树林土壤。提取真菌Humicola insolens Yl基因组DNA 将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65°C水浴锅裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20°C备用。
根据已发表的甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物Pl，P2。以 Humicolainsolens Yl总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为95°C变性5min后冷却至4°C ；然后94°C变性30seC，53°C退火30seC，72°C延伸30sec，32个循环后72°C保温 8min。得到一约230bp片段，将该片段回收后送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物uspl，usp2，usp3 ；dspl, dsp2， dsp3(见表1)。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。
表1.甘露聚糖酶基因克隆的简并引物及TAIL-PCR特异性引物
引物名称


本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及其基因和应用，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列，编码上述β-甘露聚糖酶的基因man5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列，以及包含该基因的重组载体和应用。本发明的β-甘露聚糖酶的具有以下性质最适pH5.5，具有强耐碱性，在pH8.0和9.0的条件下，酶活分别是最高酶活的45％和36％。最适温度70℃。良好的pH稳定性和热稳定性。比活为1,122U·mg-1；极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物及鱼类饲料、食品、医药、酿酒、造纸、及洗涤剂工业等。