专利名称：甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法目前，在抗肿瘤研究中，诱导癌细胞的凋亡是一个重要的途径，促进肿瘤细胞凋亡可达到肿瘤缩小，癌症消退的目的，如传统的抗肿瘤药物顺钼、美法伦等均能刺激细胞线粒体凋亡途径，引发凋亡。此种方式比采用杀伤肿瘤细胞的治疗方式有明显的优越性，因为抗肿瘤药物若能大量的诱发肿瘤细胞的凋亡，激活其自身的程序性死亡过程，将会避免因大量细胞坏死而释放细胞内物质引起的各种副作用，减轻化疗对正常细胞的损伤，延长患者的生存期。然而，至今尚未筛选出能诱发肿瘤细胞大量凋亡的抗肿瘤药。中药诱导肿瘤细胞凋亡多为体外实验研究，体内实验较少，基本上处于初级研究阶段。研究表明与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因都参与对细胞凋亡的调控，其中研究较多的有Bcl-2家族、细胞色素C、抑癌基因p53、Ice蛋白酶以及hs/APO-1等。因此，以上述细胞凋亡的调控基因为靶基因，寻找在引发细胞凋亡作用中具有区别肿瘤细胞及正常细胞(即能引发肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无反应)能力的药物是近年来各国科学家努力的方向和抗肿瘤药物研究的新亮点。在传统的非抗癌药物中，科学家发现其中有一些具有可引起细胞凋亡的作用，这可能成为研发新的抗肿瘤药物的途径。然而，已发现的具有引起细胞凋亡作用的非抗癌药物，仅仅在实验室中得到证实，且尚不能诱发大量肿瘤细胞的凋亡，在临床上尚未真正用于治疗肿瘤。甘露醇(Marmitol)是一种己六醇，传统医药用作良好的利尿剂，也是降低颅内压、眼内压及治疗肾病的药物。常用制剂甘露醇注射液作为高渗透降压药，是临床抢救特别是脑部疾患抢救常用的一种药物，具有降低颅内压药物所要求的降压快、疗效准确的特点。 国内外未见甘露醇是否具有诱导癌细胞凋亡作用的报道，也没有将甘露醇用于抗肿瘤治疗的临床应用先例。
本发明要解决的技术问题是提供一种甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是使用特定浓度的甘露醇注射液治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌等。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用。上述肿瘤是肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌。肺癌是肺鳞癌、肺腺癌。上述抗肿瘤药物为甘露醇注射液。上述甘露醇注射液的质量浓度为10% 19%。上述甘露醇注射液的质量浓度为13% 17%。发明人通过科学实验发现甘露醇具有抗肿瘤活性，尤其是特定浓度的甘露醇注射液具有明显引起细胞凋亡的作用。通过采用多项细胞凋亡检测技术及检测凋亡相关基因 bcl-2、kix，证实特定浓度甘露醇可诱导人多种癌细胞株明显癌细胞凋亡，并掌握了其与浓度、时间的效应关系，初步阐明其可能机理，而且，发明人已将研究结果用于肿瘤病人治疗并取得明显的疗效，这些为甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用及其临床推广提供了理论依据和实际病例。同时，本发明为科学廉价地寻找高效低毒的诱导肿瘤细胞凋亡的药物开辟了新的思路，极具科研意义。图1是48小时MTT浓度-抑制率曲线图。图 2 是 7 天MTT 时间-抑制率曲线图，图中120ug/ul，240ug/ul，360ug/ul，480ug/ ul，5100ug/ul，6120ug/ul。图3是7天MTT浓度-抑制率曲线图，图中1 一天，2 二天，3三天，4四天，5五天， 6六天，7七天。图4是7天化学发光时间-抑制率曲线图。图5是对照组透射电镜图。图6是对照组透射电镜图。图7是M小时组透射电镜图。图8是M小时组透射电镜图。图9是48小时组透射电镜图。图10是48小时组透射电镜图。图11是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果对照1组图。图12是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果对照2组图。图13是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果对照3组图。图14是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果0%组图。图15是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果5%组图。图16是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果9%组图。图17是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果13%组图。图18是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果17%组图。图19是H1299细胞凋亡流式细胞仪检测结果20%组图。图20是早期+晚期凋亡细胞与剂量关系图。图21是晚期凋亡和坏死细胞与剂量关系图。
5定液，4°C下预固定30min，用细针沿管壁在标本周围轻轻划一圈，使固定液充分渗入底部， 并继续固定至少2小时，取48小时MTT结果中的半数抑制浓度(IC5tl)，分为M、48小时两组和对照组，共三组，按常规电镜包埋步骤处理。2. 6统计学处理所有数据采用SPSS10. 0软件进行统计处理，计量资料的比较采用t检验，计数资料的比较采用χ2检验。3实验结果3. 1采用MTT法测定细胞抑制率结果显示48小时内，在1-150 μ g/μ 1浓度范围时甘露醇可抑制肺癌细胞的增殖活性，其抑制作用随浓度的增高而增强，7天内，随着浓度和时间的增长，抑制率也不断增加。见图1、2、3。3. 2采用化学发光法测定细胞抑制率结果显示取48小时MTT结果中的半数抑制浓度(IC5tl)时，作用7天，甘露醇可抑制肺癌细胞的增殖活性，并且抑制作用随时间的延长而增强，见图4。3. 3流式细胞仪分析细胞周期结果显示取48小时MTT结果中的半数抑制浓度 (IC50)时，作用Μ、48、72小时组细胞周期停止在^+M期的较对照组明显增多，见表1。表1甘露醇不同处理时间对细胞周期的影响
处理时间 G,(%) S(%)G2/M(%)
对照53. 337. 19. 6
2445. 740. 913. 44854. 527. 817. 67261. 126. 112. 83. 4透射电镜检测结果显示取48小时MTT结果中的半数抑制浓度(IC5tl)时，作用 M小时组电镜下可见细胞膜、核膜完整，核仁较清楚，胞质中较多脂滴，可见凋亡小体，作用 48小时组电镜下可见细胞凋亡较明显，大量凋亡小体，而对照组细胞电镜下可见符合肿瘤细胞的特点，核大，见图5至图10。图5、6为对照组可见细胞核大，核浆比例失调，核仁较清楚，胞质中较多脂滴；图7、8为M小时组可见细胞核膜完整，可见凋亡小体图9、10为48 小时组可见大量凋亡小体。实施例2特定浓度甘露醇诱导肺腺癌细胞凋亡及机理的研究(肺腺癌)1材料和方法1. 1主要试剂及仪器DMEM(高糖)培养液(美国hyclone公司赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司分装)，胰蛋白酶、新生小牛血清(FBS购自杭州四季青生物有限公司)，20%甘露醇(购自安双鹤药业有限公司)，Giemsa染色试剂盒(由广西医科大学第一附属医院检验中心提供)，细胞凋亡hoechst 33342试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)细胞凋亡Dapi染色试剂盒、流式细胞仪试剂盒(均购自南京凯基生物科技发展有限公司)、Bcl-2检测试剂盒(购自福州迈新生物科技发展有限公司)，戊二醇、透射电子显微镜由广西医科大学电镜室提供。CK41型倒置显微镜(日本Olympus)、照相系统(日本 Nikon 72000U倒置显微镜及DS-5MC高分辨率CXD数码照相500万像数)，由广西大学国家重点实验室提供，流式细胞仪(美国BD公司FACSCalibur)由广西壮族自治人民医院实验中心提供并协助检测。1. 2细胞培养H1299细胞株为人肺腺癌细胞，由广西肿瘤防治研究所潘弘博士惠赠。该细胞呈长梭形、叶形或多角形，贴壁生长，细胞质饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片。取稀释成2X 104/ml处于对数生长期的细胞悬液，培养于37°C含5% CO2细胞培养箱内，培养液为含10%新生小牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的DMEM (高糖)培养液，0. 25%胰蛋白酶消化传代，CK41型倒置显微镜下观察细胞的生长状态。1. 3 方法(I)Giemsa染色观察细胞凋亡形态将生长良好状态细胞放入预先放取处于生长良好的H1299细胞悬浮液，加入预先放置有盖玻片的六孔板，放到37°C培养箱培养，让细胞爬片生长，待其长到85 % 90 %，分别加入不同浓度的甘露醇(O %，5 %，9 %，13 %，17 %， 20% )，培养48小时，取出盖玻片，PBS洗2次，甲醇固定5min，Giemsa染色15min，晾干后中性树脂封片，显微镜(日本Nikon 72000U倒置显微镜及DS-5MC高分辨率C⑶数码照相 500万像数400倍)下观察拍照细胞凋亡的特性变化。(2)细胞凋亡Dapi染色观察细胞核凋亡小体取处于生长良好的H1299细胞别加入含不同浓度0%、5%、9%、13%、17%、20%甘露醇-:01^11(高糖)培养液(含10% FBS) IOml0继续培养48小时，PBS洗涤2次，0. 25%胰蛋白酶消化3min，立即加入DMEM(高糖)培养液(10% FBQlOml终止消化，离心，弃上清，PBS洗涤2次，再离心，弃上清，后用 PBS稀释制成细胞悬液(10万个细胞/lml)，将细胞悬液500ul放入打靶固定离心管离心 (8000r/min,5min,)到载玻片上，干燥，无水乙醇固定，再干燥。然后在避光条件下按细胞凋亡Dapi染色盒说明书染色，PBS在玻璃缸内浸泡洗涤3次，每次15min，再干燥，晾干后中性数胶封片，荧光显微镜以340/380紫外光激发及DS-5MC高分辨率CCD数码照相400倍) 下观察、拍照细胞核凋亡小体情况。细胞凋亡Dapi染色玻片4°C避光保存。结果判断细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期1期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；IIa期细胞核的染色质高度凝集、边缘化；nb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。(3)细胞凋亡hoechst 33342试剂染色观察细胞核凋亡小体步骤与( 相同，然后在避光条件下按细胞凋亡hoechst 33342试剂盒说明书染色，PBS在玻璃缸内浸泡洗涤3 次，每次15min，再干燥，晾干后中性数胶封片，荧光显微镜以340/380紫外光激发及DS-5MC 高分辨率CCD数码照相400倍)下观察、拍照细胞核凋亡小体情况。细胞凋亡hoechst 33342试剂染色玻片4°C避光保存。(4)透射电子显微镜观察步骤与(2)相同，离心，弃上清，PBS洗涤2次，移入 1. 5EP管再离心，弃上清，用戊二醇固定后透射电子显微镜下观察凋亡细胞形态。结果判断凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡I期(pro-apoptosis nuclei) 的细胞核的染色质高度盘绕，出现许多称为气穴(cavitations)的空泡结构；IIa期细胞核的染色质高度凝集、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。(5)流式细胞仪检测细胞的凋亡步骤与( 相同，收集所有的悬浮细胞分别倒入标有0%，5%， 9%,13%,17%, 20%的离心管(IOml)，离心2000r/2min,弃去上清液，用PBS洗2次，再离心2000r/2min，弃清液，重悬，离心2000r/2min，再重悬，细胞计数(lX106)/ml，按表1加入相应试剂，避光、放入冰浴在Ih内上FACSCalibur进行流式细胞术定量检测，结果见表2。
表2流式细胞仪检测细胞的凋亡结果


本发明公开了甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是使用特定浓度(10％～19％)的甘露醇注射液治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌等。传统上甘露醇仅作为利尿剂、高渗透降压药等，发明人通过科学实验发现甘露醇具有抗肿瘤活性，通过采用多项细胞凋亡检测技术及检测凋亡相关基因bcl-2、bax，证实特定浓度甘露醇可诱导人多种癌细胞株明显癌细胞凋亡，并掌握了与浓度、时间的效应关系，初步阐明其可能机理，而且，发明人已将研究结果用于肿瘤病人治疗并取得明显的疗效，这些为甘露醇在制备抗肿瘤药物中的应用及其临床推广提供了理论依据和实际病例。