专利名称：一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法自上世纪六十年代，真菌多糖作为抗肿瘤的广谱免疫促进剂引起了人们极大的兴趣。大量药理和临床研究表明，真菌多糖类化合物具有复杂的多方面生物活性与功能，对正常的细胞没有毒副作用，真菌多糖主要通过影响网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞以及蛋白质的合成、抗体生成及干扰素的诱生作用来提高机体免疫功能，增强抗病能力。多糖作为免疫促进剂，可与细胞毒性抗癌药物如氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺(CIX)合用，减轻因化疗所致的免疫功能低下，增强细胞毒抗癌药物的抗肿瘤活性(袁建国，程显好，侯永勤.冬虫夏草多糖组份研究及药理试验[J].山东食品发酵，2004,4:52-55;林新坚，郑永标，陈济琛等.冬虫夏草粗多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的作用[J]. 微生物学杂志，2004，24 (3) 22-23 ；Zhang W, Yang J, Chen J, et al. Immunomodulatory and antitumor effects of exopolysaccharide fraction (EPSF) from a cultivated Cordyceps sinensis fungus on tumor-bearing mice. Biotechnol Appl Biochem,2004, 15(12) :256-259 ；Zhou GF,Hua X,Sheng WX. In vivo growth-inhibition of S180 tumor by mixture of 5-Fu and low molecular—carrageenan from Chondrus ocellatus. Pharmacological research. 2005,51 :153-157)。国内外很多研究表明，虫草多糖具有抗肿瘤活性，大多数抗肿瘤作用是非直接杀伤癌细胞，即通过刺激人体非特异性防御机能，在癌症病人经放疗、化疗机体免疫力受损的情况下，与放疗、化疗配合治疗可达到治愈疾病的目的(吴庆光，赵珍东，王宗伟.冬虫夏草抗肿瘤作用研究进展[J].中医药导报.2005，11 (6) :80-82) 0桑黄是寄生于桑树等阔叶树的一种药用真菌，具有独特的抗癌等功效，已引起国内外医药界与保健品行业不少专家的关注。其抑制肿瘤的研究主要集中在桑黄多糖方面，作用机制是通过细胞调节和体液免疫来提高机体的免疫力，进而达到抑制肿瘤细胞生长和转移的目的(沈业寿，郑立军，王正亮.桑黄胞内多糖抗肿瘤效应的实验研究[J].癌变畸变突变，2007，19 ) :305-308)。由于国内外市场对虫草、桑黄的需求量越来越大，致使国内各产地药农掠夺性采集，子实体孢子无法大量形成，结果造成野生虫草、桑黄资源在我国已难觅踪影，即将枯竭。 近年来大量的科研工作者对虫草、桑黄的人工栽培、液体发酵技术等方面开展了广泛的研究，但人工栽培、液体发酵产生的虫草、桑黄子实体和菌丝体多糖抗肿瘤等活性有待进一步研究。
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，通过两类多糖相互协同作用，增强其抗肿瘤活性。体外活性实验表明，本发明产品对人源性结肠癌细胞 HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞H印G2的增殖有显著的抑制作用，且显著高于单一来源多糖的抑制效果，可作为一种辅助治疗肿瘤的药品或保健品。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，依次包括以下步骤A.将人工培养虫草子实体用70°C -90°C烘干，粉碎成20-80目，蒸馏水 90°C-100°C提取4-8h，过滤后滤液用浓度70%-80(%的乙醇沉淀，8000-12000印111离心收集沉淀，复溶于水；B.将步骤A的产物用分子量10000道尔顿的超滤膜高压过滤，得到透明液体用烘干或冷冻干燥后粉碎得到虫草子实体多糖；C.在步骤A进行的同时，将液体发酵培养桑黄菌丝体用70°C -90°C烘干，粉碎成20-80目，蒸馏水90°C -100°C提取4-他，过滤后滤液用浓度70% -80%的乙醇沉淀， 8000-12000rpm离心收集沉淀，复溶于水；D.将步骤C的产物用分子量10000道尔顿的超滤膜高压过滤，得到透明液体用烘干或冷冻干燥后粉碎得到桑黄菌丝体多糖；E.将步骤B中得到的虫草子实体多糖和步骤D中得到的桑黄菌丝体多糖按 1 0.5 1 3的比例混合均勻后，通过压片机压片。优选的，步骤A中虫草子实体的烘干温度为80°C，粉碎度为40目，蒸馏水提取温度 95°C，提取时间为他，滤液用于沉淀的乙醇终浓度为75%;能够得到最佳质量的虫草子实体多糖。优选的，步骤C中桑黄菌丝体的烘干温度为80°C，粉碎度为40目，蒸馏水提取温度 95°C，提取时间为他，滤液用于沉淀的乙醇终浓度为75%;能够得到最佳质量的桑黄菌丝体多糖。优选的，步骤E中虫草子实体多糖与桑黄菌丝体多糖按1 1的比例混合均勻；最佳的混个比例，对人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞H印G2 生长具有显著抑制作用。与现有技术相比，本发明的优点是现有的研究发现人工培养的虫草、桑黄子实体和菌丝体多糖具有一定的抗肿瘤活性，但其抗肿瘤效果尚不理想，本发明通过多种肿瘤细胞抑制实验，筛选出对人源性结肠癌细胞HT-29、人源性肺癌细胞A549、人源性肝癌细胞 HepG2生长具有显著抑制作用的多糖，通过复配后，利用两类多糖相互协同作用，可增强其抗肿瘤活性。本发明工艺简单、所建立的提取方法专业性强、重复性好，且使用医用酒精提取，不仅环保，同时产品安全可靠，适宜于工业化生产。图1为不同多糖对人源性结肠癌细胞HT-四增殖的抑制作用对比图；图2为不同多糖组合对人源性结肠癌细胞HT-四增殖的抑制作用对比图；图3为不同多糖对人源性肝癌细胞！tepG2增殖的抑制作用对比图；图4为不同多糖组合对人源性肝癌细胞!fepG2增殖的抑制作用对比图；图5为不同多糖对人源性肺癌细胞A549增殖的抑制作用对比图6为不同多糖组分对人源性肺癌细胞A549增殖的抑制作用对比图。 续培养池。酸性DMSO振荡溶解甲臜结晶，以酶1-测定OD值，按下列公
式计算抑制率(％)。细胞抑制率(％)=( ι- ^I^qpI ) Χ 100%。4.实验结果由图1可见，人工培养虫草子实体多糖在0. 1 0. 8mg/ml剂量时对人源性结肠癌细胞HT-29的增殖具有显著的抑制作用，其抑制率为3. 83% 49. 58%，虫草菌丝体多糖、 桑黄子实体多糖和桑黄菌丝体多糖在0. 1 0. 8mg/ml剂量时对人源性结肠癌细胞HT-29 的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分别为7. 46% 观.42%, -4. 06% 22. 40%和 2. 01% 18. 13%。当不同多糖进行组合时，由图2可知，虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖(1 1)组合时可显著提高抑制结肠癌细胞HT-29的增殖，且这种抑制作用显著高于单一多糖，在0. 2-1. 6mg/ml剂量时，抑制率达17. 47% 72. 17%.由图3可见，虫草子实体多糖、虫草菌丝体多糖、桑黄子实体多糖和桑黄菌丝体多糖在0. 1 0. 8mg/ml剂量时对人源性肝癌细胞H印G2的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分别为-3· 42% 21. 07%, 5. 15% 6. 39%, 7. 03% 9. 77%和 8. 27% 14. 87%。由图4可知，当不同多糖进行组合时，可显著提高其抗肝癌细胞!fepG2的增殖作用，其中虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖(1 1)组合时抑制作用最显著，且显著高于任一单多糖，在 0. 2-1. 6mg/ml 剂量时，抑制率为 35. 01% 43. 99%。
由图5可见，虫草子实体多糖和桑黄子实体多糖在0. 1 0. 8mg/ml剂量时对人源性肺癌细胞A549的增殖具有显著的抑制作用，其抑制率分别为23. 47% 41. 14%和 11. 45% 30. 21% ；虫草菌丝体多糖和桑黄菌丝体多糖在0. 1 0. 8mg/ml剂量时对肺癌细胞A549的增殖具有一定的抑制作用，其抑制率分别为8. 06% 18. 11%和3. 91% 14. 50%。由图6可知，当不同多糖进行组合时，可显著提高其抗肺癌细胞A549的增殖作用， 虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖(1 1)组合时这种协同抑制作用增强，在0.2-1. 6mg/ ml剂量时，抑制率为32. 73% 54. 40%。以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。


本发明公开了一种具有抗肿瘤活性多糖组合物的制备方法，将人工培养虫草子实体和液体发酵培养桑黄菌丝体烘干、粉碎，加蒸馏水提取、乙醇沉淀离心后，再溶于水，用超滤膜高压过滤得到虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖，将虫草子实体多糖和桑黄菌丝体多糖配比混合均匀后，通过压片机压片。本发明的优点是通过复配后，利用两类多糖相互协同作用，可增强其抗肿瘤活性。本发明工艺简单、所建立的提取方法专业性强、重复性好，且使用医用酒精提取，不仅环保，同时产品安全可靠，适宜于工业化生产。