一种甘露聚糖酶及其重组表达菌株的制作方法【技术领域】，具体涉及一种甘露聚糖酶及其重组表达菌株。[0002]自然界中，植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质组成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是仅次于纤维素的第二大可再生的半纤维素碳水化合物，其由β-1，4-D-甘露糖连接而形成线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。甘露聚糖具有亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的粘度，从而抵抗胃肠的蠕动，直接影响动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品(豆柏等)在动物饲料中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养作用也越来越受到重视。而在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。[0003]甘露聚糖酶能有效分解甘露聚糖，其包括外切酶、内切酶和甘露糖苷酶，三种酶协同作用才能将甘露聚糖彻底降解。其中，β-l，4-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)又称为甘露聚糖酶，属于内切酶；它能水解β_1，4-D-甘露糖苷键，生成甘露寡糖或甘露多糖，属于半纤维素酶类。12593053210086[0004]甘露聚糖酶通过分解甘露聚糖能降低消化道内容物粘度，破坏细胞壁的结构，使营养物质与消化酶充分接触，提`高动物内源酶(如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等)的活性，改善肠道微生物菌群和提高肠粘膜的完整性等功能。因此加入甘露聚糖酶来分解甘露聚糖，使之转化为甘露低聚糖，能降低甘露聚糖的抗营养作用，从而提高饲料的利用率，促进畜禽生长，并减轻对环境的污染。另外，甘露聚糖酶降解甘露聚糖生成的甘露低聚糖，能吸附病原菌、促进肠道的繁殖和定植，减少抗生素的添加量。[0005]目前已商业化的甘露聚糖酶主要来自芽孢杆菌、木霉和青霉。芽孢杆菌所产甘露聚糖酶属于中性甘露聚糖酶，最适pH为6.5，不耐胃酸和胃蛋白酶。木霉和青霉所产甘露聚糖酶虽具有耐酸性特点，但是不耐受胃蛋白酶。而甘露聚糖酶在单胃动物体内的作用位点决定了饲料中使用的甘露聚糖酶必须是酸性的(如下表)。[0006]甘露聚糖酶在单胃动物体内的作用位点[0007] pH值I嗉囊I肌胃(胃) I小肠
#_4.67 2.94_5.8—6.2
?猪 -丨3.0丨6.0-6.4
[0008]因此，为了更好的提高单胃动物对含甘露聚糖饲料的利用率，就需要获得能够在低PH条件下具有高活性的甘露聚糖酶。


[0009]本发明的目的是提供一种甘露聚糖酶及其重组表达菌株，即一种新型的甘露聚糖酶，以及能对甘露聚糖酶进行修饰，使重组表达的甘露聚糖酶在酸性环境中具有稳定的酶活，且对胃酸、胃蛋白酶或胰蛋白酶具有较强的耐受性的重组表达菌株从而弥补现有技术的不足。
[0010]本发明提供的新型甘露聚糖酶基因是从丝状真菌一斜卧青霉(Penicillumdecumberns)中克隆得到的。该基因在毕赤酵母中表达后所制备的甘露聚糖酶最适pH4.5,在pH2.0-7.0范围内非常稳定，且耐胃酸和胃蛋白酶；在里氏木霉中表达后所制备的甘露聚糖酶，最适PH4.5，在pH3.5-8.0范围内非常稳定，且耐胰蛋白酶，因此都具有作为饲用甘露聚糖酶的应用前景。
[0011]本发明的一个方面一种新型的甘露聚糖酶，包括有:
[0012](a)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶，
[0013](b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有Ca)活性的酶。
[0014]本发明的一个方面涉及编码甘露聚糖酶的核苷酸，其一种序列为SEQ ID NO: 2。
[0015]本发明还涉及用来表达本发明的甘露聚糖酶的重组载体，是在质粒中插入编码甘露聚糖酶的核苷酸；构建重组载体的质粒可以选用用毕赤酵母pPIC9K质粒或木霉pTH质粒。
[0016]本发明的另一个方面是提供用于重组表达甘露聚糖酶的工程菌，是将表达甘露聚糖酶的重组载体转入酵母或木霉中制备的。
[0017]上述的工程菌，一种为毕赤酵母pdman-2 (G418+, egV) (Pichia pastoris pdman-2(G418+, egV))工程菌，已于2012年5月21日，保藏于位于中国武汉武汉大学的“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO: M 2012175。
[0018]另一种为里氏木霉pdman-2 (hph+, man) (Trichoderma reesei pdman-2 (hph+,man))工程菌，已于2012年5月21日，保藏于中国武汉武汉大学的“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO: M 2012176。
[0019]本发明的另一方面涉及上述甘露聚糖酶在饲料中的应用。
[0020]本发明从斜卧青霉中克隆得到一个新型甘露聚糖酶基因，并分别构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌。所述毕赤酵母工程菌所产甘露聚糖酶的最适pH为4.5，最适温度为55°C，在pH2.0-7.0范围内酶活稳定，且耐胃酸和胃蛋白酶；所述里氏木霉工程菌所产甘露聚糖酶的最适PH4.5，最适温度为55°C，在pH3.5-8.0范围内酶活稳定，且耐胰蛋白酶。这两种甘露聚糖酶都具有作为饲用酶的应用价值。



[0021]图1:本发明的甘露聚糖酶酶学性质最适pH分析图；
[0022]图2:本发明的甘露聚糖酶酶学性质的最适温度分析图；
[0023]图3:本发明的甘露聚糖酶酶的pH耐受稳定性分析图；
[0024]图4:本发明的甘露聚糖酶酶的消化酶的耐受稳定性分析图；
[0025]其中P1-Man指毕赤酵母工程菌pdman-2经甲醇诱导培养后的上清液，Tr-Man指里氏木霉工程菌pdman-2经甲醇诱导培养后的上清液。

[0026]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
[0027]—斜卧青霉甘露聚糖酶基因的克隆
[0028]1.1总DNA的提取
[0029]将斜卧青霉(P.decumberns)过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心 5 min，弃上清；加入 400 μ I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mMNaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min 后，加入 200 μ I IOM NH4AC,冰浴 IOmin ;13000rpm 离心 lOmin，取上清；加入 2 倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ；13000 rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干,加入水溶解,于-20°C保存。
[0030]1.2总RNA的制备
[0031 ] OMEGA公司的E.Z.N.A.Fungal RNA Kit制备斜卧青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。
[0032]1.3基因克隆
[0033]以1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用引物对ATGAAGTATCATCTCACCCTTCTTG和 TTAAAGGCACTGCGAATAATAC
[0034]TG 进行 PCR扩增。PCR扩增条件为 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C 1.2min30个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
[0035]以1.2中提取的基因组总RNA为模板，同样的引物来扩增其cDNA序列。采用TaKaRa公司的PrimeScript RT-PCR Kit扩增cDNA基因序列，回收产物。
[0036]1.4测序分析
[0037]将1.3中回收的扩增产物分别连接到pMD18 T-载体，相应的克隆载体分别命名为pT-Manl (DNA中扩增产物)和pT_Man2 (RNA扩增产物)；最后把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果为:pT-Manl和pT_Man2的核苷酸序列分别为SEQ IDNO: 3,SEQ ID NO: 2。比对分析显示该基因序列含有I个内含子，SEQ ID NO: 2编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0038]二表达甘露聚糖酶基因的工程菌的构建
[0039]2.1毕赤酵母工程菌的构建
[0040]以质粒pT_Man2 为模板，利用引物(agtgaattcCCGATCAGACACACGGC
[0041]TCG 和 agtgcggccgcTTAGTTTGGAGTGTTGTAG)进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件是 95°C4min ；94°C 30S ；55°C 40S,72°C 1.2min 30 个循环；72°C 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行Eco RI和Not I双酶切。同样，对表达质粒PPIC9K也进行Eco RI和Not I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体4°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-Man。
[0042]表达质粒pPIC-Man用Sal I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3yg/μ L浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GSl 15电转化感受态细胞，最后重悬于I mL预冷的电泳缓冲液中(含ImM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM蔗糖，pH 7.8)。在80 μ L感受态细胞中加入5 μ L线性化重组质粒；电转化(条件为1500V、200 Ω、25 μ F);最后涂布于丽平板(丽培养基组分:1.34%YNB, 4X 10-5%生物素，0.5%甲醇)，挑选重组菌株。所获得工程菌株命名为 Pichia pastoris pdman-2 (保藏号:CCTCC NO: M 2012175)。
[0043]2.2里氏木霉工程菌的构建
[0044](I)表达载体构建
[0045]以质粒pT_Man2 为模板，利用引物(agtaatgccATGAAGTATCATCTCACC
[0046]CTTC TTG 和 agtggtaccTTAGTTTGGAGTGTTGTAG)进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件是950C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S,72°C 1.2min 30 个循环；72°C 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行Nco I和Kpn I双酶切。同样，对木霉表达质粒pKDN-EG也进行Nco I和Kpn I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体4°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pKDN-Man。
[0047](2)原生质体制备
[0048]接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约60mlYEG (0.5%酵母粉、1%葡萄糖)的液体培养基中，30°C，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20 ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小时；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min ;弃上清，加 10-2 0 ml STC 液(20%蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mM CaCl2)悬浮，然后 3000rpm,离心10 min ;加适量STC悬浮分装(150 μ?/管，IO8个/ml )。
[0049](3)转化与验证
[0050]取2Pg pKDN-Man DNA加入到150μ1原生质体中，接着加入500μ1 25%PEG轻轻混匀，室温静置25 min ;然后分2_3次再加Iml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50ml左右熔化后冷却至45-55°C的上层半固体培养基(0.l%MgS04, 1%KH2P04,
0.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%琼脂糖)，轻轻混匀后倒入含IOOPg/ml潮霉素下层基础培养基平板(2%葡萄糖，0.5% (NH4) 2S04, 1.5%KH2P04, 0.06%MgS04,
0.06%CaCl2，1.5%琼脂)，28°C黑暗培养数天至转化子长出。
[0051]按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例1中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95°C 4min ；94°C30S ；55°C 40S，72°C Imin 30个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，即经过上述两个PCR反应选育和验证阳性转化子。所获得工程菌命名为Trichoderma reesei pdman-2 (保藏号:CCTCC NO: M 2012176)。
[0052]三发酵和酶学性质测定
[0053]3.1毕赤酵母工程菌pdman-2摇瓶发酵
[0054]将毕赤酵母工程菌pdman-2接种于5ml BMGY ( I %酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50mlBMMY诱导培养基(1%酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB, 4X 10-5%生物素，0.5%甲醇)，每12小时补加50 μ L甲醇，诱导培养5天，取上清液(命名为P1-Man)进行酶学性质和耐受性分析。
[0055]3.2里氏木霉工程菌pdman-2摇瓶发酵
[0056]将里氏木霉工程菌pdman-2接种于MM发酵培养基(1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44% (NH4) 2S04,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2,0.018% 吐温-80，0.018% 微量元素，0.018%聚丙二醇-2000 )，28 °C培养48小时，然后25 °C诱导培养48小时，取上清液(命名为Tr-Man)进行酶学性质和耐受性分析。
[0057]3.3酶学性质分析
[0058]本发明还提供了一种甘露聚糖酶的测定方法，该方法包括:
[0059]以0.6%槐豆胶甘露聚糖(Sigma公司，Batch#125K0091)为底物，以0.1M醋酸-醋酸钠(PH5.5)为缓冲液，将甘露聚糖底物37°C平衡20min，将待测酶液37°C平衡IOmin0取4支试管，分别加入酶液2ml，其中3支作为测定管，分别加入2ml底物溶液，另一支作为空白管，加入5ml DNS溶液，在37°C ±0.5°C水浴30分钟。然后三支测定管分别加A5ml DNS溶液，空白管加入2ml底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml。以空白管调零，在分光光度计540nn处测吸光度。
[0060]甘露聚糖酶酶活定义:在37°C、pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生I μ mo I甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。
[0061](I)最适pH分析
[0062]用pH 值分别为 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的缓
冲液进行稀释测定，在温度55°C条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示=P1-Man和Tr-Man的pH曲线基本一致，两者的最适pH均为
4.5。(图1)
[0063](2)最适温度分析
[0064]分别在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C，ρΗ5.5 的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示:P1-Man和Tr-Man的温度曲线基本一致，两者的最适温度均为55°C (图2)。
[0065](3) pH耐受性分析
[0066]用ρΗ2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的缓冲液分别稀释样品 P1-Man 和Tr-Man至大约40U，在37°C条件下处理2h，然后在37°C，pH5.5条件下测定酶活，以未处理的酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示P1-Man酶在pH2.0-7.0范围能保持90%以上的活性；而Tr-Man在pH4.0-8.0条件下保持80%以上的酶活。相比而言P1-Man耐酸；而Tr-Man耐偏碱(图3)
[0067](4)消化酶的耐受性分析
[0068]用胃酸、胃蛋白酶、pH6.8缓冲液、胰蛋白酶稀释样品p1-Man和Tr-Man至大约40U，37°C，胃酸、胃蛋白酶处理2h，pH6.8、胰蛋白酶处理6h ;然后37°C，pH5.5测定酶活，以未处理的样品酶活为100%，计算相对酶活。结果显示，P1-Man酶经胃酸和胃蛋白酶处理2小时后，酶活几乎不损失，但不耐受胰蛋白酶；而Tr-Man虽不耐受胃酸和胃蛋白酶，但是经胰蛋白酶处理6h后仍保留20%以上的酶活(图4)。
[0069]酶活实验结果表明:本发明提供的甘露聚糖酶的最适pH为4.5，最适温度55°C。在不同工程菌宿主表达的甘露聚糖酶的耐受性也不一样。毕赤酵母工程菌表达的甘露聚糖酶的酶学特点:在PH2.0-7.0范围内非常稳定、能保持80%以上的酶活，在pH8.0条件下，酶活仅剩11%;在胃酸、胃蛋白酶处理2小时条件下，还保持95%以上的酶活，基本不损失。毕赤酵母工程菌表达的甘露聚糖酶虽然耐胃酸、耐胃蛋白酶的效果好，但不耐受胰蛋白酶，经胰蛋白酶处理6h后酶活仅剩不到5%。[0070]而里氏木霉工程菌表达的甘露聚糖酶的酶学特点:在pH3.5-8.0范围内非常稳定，能保持80%以上的酶活，在pH2.0-2.5条件下则没有酶活；经胃酸处理2小时后，酶活仅剩15%左右，而经胃蛋白酶处理2小时后，酶活仅剩5%左右。里氏木霉工程菌虽不耐受胃酸和胃蛋白酶，但是经胰蛋白酶处理6h后仍保留20%以上的酶活，对胰蛋白酶的耐受性比较强。
[0071]四低能日粮中添加本发明甘露聚糖酶对肉鸡生产性能影响
[0072]本实验在肉鸡商品日粮基础上降低lOOkcal/kg的代谢能，然后在日粮中添加本发明的甘露聚糖酶。通过对肉鸡生产性能的评价，探讨甘露聚糖酶对低能日粮能量利用率的改善幅度。
[0073]试验选用432只I日龄罗斯308肉用公雏，分为6个处理组，每个处理设4个重复，每个重复18只肉公鸡，米用3层笼养,饲养在人工控温的肉鸡舍。
[0074]实验分为3组，饲喂21天。正对照组:正常商品日粮处理组；负对照组:在正对照日粮基础上降低lOOkcal/kg代谢能；试验组:在负对照日粮基础上添加60-100克/吨本发明的甘露聚糖酶(500000U/g)。正负对照组日粮组成如下表所示。
[0075]基础日粮组成及营养水平
[0076]