专利名称：海带内生活性菌株的分离纯化方法海带(laminaria japonica)是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物。海带 作为一种重要的海洋资源，其食用与药用价值早为世人所知，我国就有食用海带并利用其 治疗和预防瘿病(甲状腺肿大)的记载。随着现代科学技术的发展，人们逐渐发现海带在医 疗保健方面有更多的功效，如从海带中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗HIV 和增强免疫功能，对治疗心脑血管疾病和中、早期慢性肾衰等均有一定的作用。海带中还 含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充分利用。
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低 廉的海带内生活性菌株的分离纯化方法。本发明的技术解决方案是海带内生活性菌株的分离纯化方法，其特征在于依次 按如下步骤进行a.采集正常生长无病害的海带，用无菌海水冲洗海带3飞次；b.用灭菌剪刀将海带剪成1.5^2. 5cm2小块，浓度75%的酒精漂洗3(T90s后用无菌水 冲洗；用浓度0. 1%的氯化汞漂洗6 18s，用无菌水冲洗；c.将海带块研磨后加入等质量的无菌水，混勻后再均勻涂布接种到平板培养基；d.37°C下培养7天，分别挑取单个形态各异的菌落，在平板培养基上划线培养，直到 出现纯菌株。所述平板培养基为淡水/海水牛肉膏蛋白胨固体培养基或淡水/海水高氏固体培 养基或淡水/海水萨氏固体培养基。本发明是以来源丰富、价格便宜的海带为原料，操作简单、成本低廉，所分离纯化 的海带内生菌株具有多种活性，可应用于药品、生物农药和食品保鲜、防腐剂及化妆品的添 加剂等，具有产业价值。
本发明实施例依次按如下步骤进行
a.从海底采集正常生长无病害的海带，用无菌海水冲洗海带3飞次；
b.用灭菌剪刀将海带剪成2cm2小块，浓度75%的酒精漂洗90s后用无菌水冲洗干净； 再用浓度0. 1%的氯化汞漂洗18s，用无菌水冲洗干净；
c.将海带块研磨后加入等质量的无菌水制成海带研磨液，混勻后均勻涂布接种于平 板培养基上；
d.37°C下培养7天，分别挑取单个形态各异的菌落，在平板培养基上划线培养，重复该步骤，直到有纯菌株出现。为了能分离到尽可能多的海带内生菌，本发明实施例的平板培养基分别选取了淡 水/海水牛肉膏蛋白胨固体培养基，淡水/海水高氏固体培养基，淡水/海水萨氏固体培养 基。结果共分离出内生菌27株，其中淡水牛肉膏12株、淡水萨氏3株、海水牛肉膏6株、海 水高氏1株、海水萨氏5株。实验及结果
1.纸片法检测发酵液的抑菌活性将大肠杆菌Escherichia coli (EC)、变形杆 菌 Proteus vulgaris (PV)、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (SA)、产气杆菌 Enterobacter aerogenes (EA)和枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis (BS)分别接种于牛肉 膏蛋白胨液体培养基，振荡培养24 h作指示菌，上述菌种均可购自上海坤肯生物化工有限 公司。分别用移液枪取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固体培养基，用无菌三角涂棒 涂抹均勻，然后将牛肉膏蛋白胨固体培养基平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片， 再分别用移液枪移取本发明实施例分离纯化的海带内生菌株发酵产物样品10 μ L滴入滤 纸片中央，置于37 ！培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为75%酒精，阴性对照 为相应菌株的空白培养基。三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。结果 本发明实施例分离纯化的27株菌种中，有抑菌活性的菌种共20株，其中淡水牛肉膏8株、 淡水萨氏2株、海水牛肉膏6株、海水萨氏4株，尤其对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大 肠杆菌的抑菌效果非常显著，因此用这些菌株发酵产物开发食品添加剂可因其抑菌活性而 延长产品的保藏时间，还可直接开发成食品保鲜防腐剂。由于该菌株发酵产物对金黄色葡 萄球菌作用明显，因此可以作为治疗皮肤表浅创伤的药物或应用于化妆品的添加剂。2.抑制植物病原菌活性的检测在无菌条件下，用移液枪移取本发明实施例分离 纯化的菌株发酵液1. 5 mL，加入到冷却至40°C左右的沙氏培养基中摇勻，使其最终体积为 15 ml，凝固后分别用孔径为0. 8 cm的打孔器取菌落边缘生长旺盛的植物病原菌菌饼接种 到含有本发明实施例活性菌株发酵液的沙氏培养基平板上。每个培养皿接种1个菌饼，每 种植物病原菌3个重复。以待检菌的相应空白培养基加入到培养基作为对照，置于27 °C的 恒温培养箱内培养。培养7 d后，拍照、测量直径，方法是按照十字交叉测量2次，以其平 均值代表菌落直径的大小。根据抑制率的计算公式如下纯生长量=菌落平均直径_菌 饼直径，抑制率=(对照纯生长量-处理纯生长量)/对照纯生长量进行计算。结果表明 对番茄灰霉，谷镰刀菌，毛霉菌，辣椒青枯，番茄早疫，VD-8，苹果红粉，棉花枯萎，西瓜枯萎， 玉米早疫，雪霉叶枯，瓜类枯萎都有抑制效果，上述菌种均可购自上海坤肯生物化工有限公 司。实验说明本发明实施例分离纯化的菌株具有很强的抑制植物病原菌活性，可作为粉剂 或液体制剂用于生物农药的制备。3.抑菌活性物质的性质确定从本发明实施例分离纯化的具抑菌活性的菌株中， 选取从淡水牛肉膏培养基上纯化出的2株和海水萨氏培养基上纯化出的1株菌分别接种液 体培养基。接种好的液体培养基在摇床上140r/min、37°C下振荡培养4天。再对菌株的 抑菌活性进行优化培养，即淡水牛肉膏2株的培养条件为培养温度25度，pH为9，培养时 间6天，液体培养基中蔗糖50g/L、蛋白胨10g/L。海水萨氏1株的培养条件为培养温度25 度，PH为5，培养时间6天，体培养基中蔗糖50g/L、蛋白胨6g/L。
所得发酵液3500r/min离心30min去菌体，收集上清液，用85%的硫酸铵沉淀一 夜。再用10000r/min、4°C下离心30min，过滤收集沉淀。沉淀用PBS缓冲液溶解后分装到 截留分子量为3500Da的透析袋内，透析3天，冷冻干燥后得到粗蛋白样品。将样品按5mg/ mL浓度溶解于双蒸水后，再次进行滤纸片法抑菌试验，结果抑菌活性良好。实验结果表明 这三种菌株的抑菌活性成分为蛋白质，因此用这些蛋白开发功能性食品或食品添加剂可因 其抑菌活性而延长产品的保藏时间，因它们对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，也可应用于 化妆品添加剂。4.海虾毒性实验分别取上述方法制备的三种粗蛋白样品(8 mg/mL)0. 05mL加到 3个带刻度的试管中，再在每试管中加入约4 mL海水和10只健康的海虾无节幼体，最后用 海水加至5 mL ；另取3只试管，也加入10只健康的海虾无节幼体，再用海水加至5 mL，作为 空白对照。24°C置日光灯下，24 h后计数存活海虾。每个实验重复三次。实验结果表明 三种蛋白处理的海虾存活率达为22. 5%, 25. 4%和27. 67%，该粗蛋白具有一定的海虾毒性活 性。海虾幼虫曾被许多活性测试系统应用，有研究发现海虾毒性法和9KB (人鼻咽癌)细 胞毒性实验呈现很好的相关性(P = 01036 , kappa = 0156)。细胞毒的ED50 —般是海 虾毒LD50的1/ 10，可用海虾毒性法代替昂贵而繁杂的体内体外抗肿瘤实验，指导对具细 胞毒和3PS ( P388，体内老鼠白血病)活性提取物的分离。海虾毒性法具快速(24h)，便宜 和简单(如不需无菌操作)等优点，本实验结果表明以本发明实施例所分离纯化的菌种发酵 液制备的蛋白质具有抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的制备。5.超氧阴离子自由基(02_)清除作用的测定取邻苯三酚0. 1 mL于试管中，加入 PH 8. 2的Tris-HCl缓冲溶液5 mL，加入本发明实施例分离纯化的菌株发酵产物0. 25 mL, 迅速混勻。在25°C反应15 min。使用1 cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320 nm处时 测吸光度A ”并测定样液本底的吸光度值^。菌株发酵产物对超氧阴离子自由基清除率的 计算公式如下清除率S (%) =Ao - (Ai — Aj)/AoX 100%。式中，Ao为试剂空白的吸光度 值Ai为样液的吸光度值*为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(O2—)不能直 接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有 高活性的· 0H，因此常用样品对超氧阴离子自由基(02_)的清除能力来反映其抗氧化活性。 经清除率公式S(%)= Ao- (Ai-Aj)AoXlOO计算超氧阴离子自由基清除率。结果在分离 纯化得到的27株菌种中，超氧阴离子自由基(02_)清除作用比较好的菌株有淡水牛肉膏2 株，分别为59. 3%和52. 3% ；海水萨氏2株，分别为57. 8%，46. 6%。因此这些菌株的发酵产 物可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。


本发明公开一种操作简单、成本低廉的海带内生活性菌株的分离纯化方法，依次按如下步骤进行采集正常生长无病害的海带，用无菌海水冲洗海带3~5次；用灭菌剪刀将海带剪成1.5~2.5cm2小块，浓度75%的酒精漂洗30~90s后用无菌水冲洗；用浓度0.1%的氯化汞漂洗6~18s，用无菌水冲洗；将海带块研磨后加入等质量无菌水，混匀后均匀涂布接种到平板培养基；37℃下培养7天，分别挑取单个形态各异的菌落，在平板培养基上划线培养，直到出现纯菌株。