专利名称：天山冻土中产低温中性蛋白酶菌株筛选及培养方法天山冻土属于我国高海抜高山常年冻土，冻土环境中微生物产生一系列适应低温、寡营养、强辐射、冻融等极端因子的分子机制，为低温微生物生理多祥性提供了可能。低温酶由于在低温环境下具有较高的酶活性，有助于在保证催化效率的前提下降低反应温度和缩短反应时间，从而大幅度节约能源，因而在食品加工、日化产品、皮革加工等需要低温催化的行业如中具有较高的开发利用价值。目前发现产低温蛋白酶的菌有假单胞 菌属(Psedomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单抱菌属(Aeromonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、弧菌属(Vibrio)。这些低温菌在永久性低温环境下经过长期的进化适应，已有着适应低温环境的特殊结构与生理生化机制。它们所产生的低温蛋白酶也有着独特的生理生化特征与结构特征。有关低温微生物的资源勘探与代谢活性产物研究，已成为国际微生物学研究的热点之一，我国的ー些研究机构也积极开展低温蛋白酶生产菌株的筛选エ作。
本发明的目的从新疆天山冻土中筛选得到的产低温中性蛋白酶菌株，经鉴定为假单胞菌N-8 (Pseudomonas sp. N-8)，2012年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO M 2012251。通过单因素试验和正交实验对其发酵条件进行优化。I、菌株筛选方法，包括以下步骤(I)初筛吸取富集后的培养液用倍比稀释法制不同的稀释度移入初筛平板中，涂匀，15°C培养。待菌落长好后，挑选透明圈较大菌株，斜面保存。(2)复筛以40°C为上限生长温度，即在该温度不生长的菌株为耐冷菌。将初筛得到的产蛋白酶菌株在初筛平板上点样，在40°C不生长的菌株，为试验菌株。以酪蛋白为底物，采用福林(Folin)试剂显色法測定酶活，进ー步筛选出产酶能力强的菌株。2、菌株生长特性、形态观察及生理生化试验(I)生长特征该菌株生长范围为0_40°C，最适生长温度为20°C，最适生长pH为7. O ；(2)菌体特征革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，细胞单个，大小为(O. 5-0. 8) X (2. 0-3. 2) μ m，有荚膜，有鞭毛；(3)菌落特征在酪蛋白平板上，菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面光滑，边缘整齐，易挑取，产生明显的透明圈；(4)生理生化特征该菌株接触酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐(还原)反应为阳性，能水解明胶，硫化氢试验、伏一普ニ氏试验(VP)、甲基红试验(MR)为阴性，不能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、纤维ニ糖、鼠李糖、棉子糖。3、发酵条件优化(I)通过单因素试验和正交实验对其发酵培养基进行优化。表I培养基组成的正交试验设计与结果本发明是从新疆天山冻土中筛选得到的产低温中性蛋白酶菌株Pseudomonas sp.(假单胞菌属)N-8。该菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，细胞单个，大小为(0.5-0.8)×(2.0-3.2)μm，有荚膜，有鞭毛；在酪蛋白平板上，菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面光滑，边缘整齐，易挑取，产生明显的透明圈。该菌株最适生长温度为20℃；最适生长pH为7.0。通过单因素试验和正交实验对其发酵条件进行优化，确定最佳发酵培养基配方为(g/L)葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K+0.4，pH7.0；最佳培养条件为种龄24h，起始pH7，接种量4％，装液量50mL/250mL。