专利名称：具有蛋白酶体抑制功能的化合物及其制备方法与应用的制作方法 蛋白酶体是一种高度保守的细胞内非溶酶体性的多催化蛋白酶复合物，存在于真核细胞的核内和细胞质内，这种复合物通常水解连接有多聚泛素链的蛋白。26S蛋白酶体的核心是一个20S(720kDa)的水解单位，两端有两个19S(890kDa)的调节复合物。泛素化蛋白上的泛素在19S调节复合物上被裂解，蛋白进入20S核心内，被20Sβ亚基上的活性位点水解，这些活性位点包括位于两个β5亚基上的“糜蛋白酶样位点”(chymotrypsin-like)，倾向于在疏水性残基后裂解底物；位于两个β2亚基上的位点被称为“胰蛋白酶样位点”(trypsin-like)，倾向于在碱性残基后裂解底物；位于两个β1亚基上的位点则称作“半胱天冬蛋白酶样位点”(caspase-like)，倾向于在酸性残基后裂解底物，并且在天冬氨酸处水解活性大大高于谷氨酸。泛素-蛋白酶体系统在体内发挥三方面的重要作用1、使非活性的蛋白前体经降解加工成活性蛋白，如转录因子NF-κB的活化。2、将积蓄的蛋白降解以保持体内蛋白平衡；特别是细胞信号传导途径中多种调节蛋白的活化和降解，控制着细胞的分化、生长、凋亡等过程。3、选择性地除去突变、损伤或错误折叠的蛋白。因此依赖泛素-蛋白酶体的蛋白水解过程在控制细胞增殖和细胞死亡方面发挥关键的作用，并且在炎症反应、免疫监视、长期记忆获得、生物节律调节中也有重要作用。泛素-蛋白酶体通路与肿瘤关系密切第一，各种细胞周期蛋白和磷酸化酶CDC25s等的降解都由蛋白酶体完成。对于快速增殖中的肿瘤细胞，抑制蛋白酶体，就直接抑制肿瘤细胞增殖。第二，抑癌因子p53是短寿命蛋白，直接受到蛋白酶体的降解。抑制蛋白酶体将使p53功能加强，最终导致肿瘤细胞凋亡。第三，转录因子NF-κB家族与抑制蛋白IκB结合呈非活性状态。当蛋白酶体将IκB降解，NF-κB即被激活，并表达产生一系列蛋白使细胞增殖、分化、凋亡抑制等。并且NF-κB还是导致肿瘤细胞抗药性的主要原因之一。当蛋白酶体受到抑制时，可直接干扰肿瘤细胞增殖，加速其凋亡，增加肿瘤细胞对放、化疗的敏感性，并且抑制血管形成和肿瘤转移。上述多种作用使蛋白酶体成为潜在的抗肿瘤药物作用的新靶标。国际上第一个进入临床试验的蛋白酶体抑制剂药物Bortezomib(PS-341)，对多种肿瘤具有明显治疗作用，如乳腺癌、结肠癌、淋巴癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鳞片状细胞癌等，是安全有效的抗肿瘤药，只有30％病人出现虚弱、恶心、呕吐、食欲减退、便秘、血小板减少、贫血、外周神经功能异常等副作用，减量或停药副作用消失。2003年在II期临床试验结束后提出申请4个月，即经美国FDA加速审批程序批准上市，用于治疗难治性多发性骨髓瘤。目前另一个在临床试验中的蛋白酶体抑制剂是PS-519，具有抗炎作用，用于缓解中风的缺血状态。另外，FDA已经批准的抗艾滋病药Ritonavir，是HIV蛋白酶抑制剂，现已证实此药也具有选择性蛋白酶体抑制活性，且与其抗病毒作用相关。这些都说明蛋白酶体是新颖、特异的药物作用靶标，也预示着蛋白酶体抑制剂具有令人鼓舞的临床应用前景。除作为抗肿瘤药物或放化疗增敏剂使用，还可能具有抗炎活性，治疗自身免疫病、神经退行性病变等疾病。蛋白酶体是一种蛋白水解酶，属于苏氨酸蛋白酶家族。与其它所有的蛋白酶不一样，蛋白酶体中的蛋白水解位点利用β亚基的N-末端苏氨酸作为亲核中心。因此，现有的抑制剂分子大多数是一段短肽与一个可以与苏氨酸反应的药效团相连。由药效团与催化位点发生作用形成可逆或不可逆的加成物，而短肽负责抑制剂分子与蛋白酶体的特异性识别。虽然蛋白酶体有多个催化位点，但是不必将所有的位点全部抑制。事实上，抑制其中的糜蛋白酶样位点(Chymotrypsin-like site)就可以显著抑制蛋白降解。目前的蛋白酶体抑制剂主要分为两大类，共价结合和非共价结合的抑制剂。其中，共价结合的抑制剂包括肽醛类、α-酮酰胺类、肽硼酸酯类、肽乙烯砜类、天然环肽TMC-95A-D、以Lactacystin为代表的β-内酯类化合物、茶多酚类物质、环氧酮类化合物，非共价结核的抑制剂包括一类以2-取代氨基苄基statine为结构母核的化合物。
本发明的目的是提供一种结构新颖的具有蛋白酶体抑制功能的化合物及其制备方法。本发明所提供的具有蛋白酶体抑制功能的化合物，结构如式I， (式I)其中，X为-C(O)-NH-或-CH(OH)-；R1、R3为1到10个碳的直链、支链烷基或取代烷基，3-6元环烷基，苄基，取代苄基，杂环类取代基；Pg为氨基保护基；X为-C(O)-NH-时，R2为1到10个碳的直链、支链烷基或取代烷基，3-6元环烷基，苄基，取代苄基，杂环取代基；X为-CH(OH)-时，R2为1到10个碳的烷胺基，芳香胺基。
这里，1到10个碳的直链、支链烷基及取代烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、2-甲基丙基、丁-2-基、正戊基、羟甲基、甲氧羟甲基等；各种3元-6元环烷烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；苄基及各种取代苄基，如4-羟基苄基、4-甲氧基苄基、3，4，5-三甲氧基苄基、4-硝基苄基、萘甲基等；杂环取代基，如咪唑-2-基、四氢吡咯-2-基、吲哚-3-基等；1到10个碳的烷胺基，如甲胺基、乙胺基、丙胺基、异丙胺基、丁胺基、异丁胺基、戊胺基、环戊胺基、环己胺基等；各种芳香胺基，如苯胺、4-甲氧基苯胺、3，4，5-三甲氧基苯胺、苄胺、4-甲氧基苯胺、3，4，5-三甲氧基苯胺等；氨基保护基，如叔丁氧羰基、联苯异丙氧羰基、叔戊氧羰基、二异丙甲氧羰基、环戊氧羰基、环己氧羰基、哌啶氧羰基、乙烯氧羰基、苄氧羰基、对甲氧苄氧羰基、3，5-二甲氧苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、吡啶-4-甲氧羰基、芴甲氧羰基、甲酰基、乙酰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基等。
式I中X为-C(O)-NH-的化合物的制备方法，包括如下步骤1)式II结构的带有叔丁氧羰基保护的氨基酸在肽缩合试剂作用下，与N，O-二甲基羟胺盐酸盐反应，得到式III结构化合物；2)式III结构化合物在有机锂试剂作用下与呋喃反应，得到式IV化合物；3)式IV化合物脱除叔丁氧羰基，得到式V化合物；4)将式VI结构的氨基酸与二氯亚砜反应，得到式VII结构的氨基酸甲酯；5)将式VIII结构的带有保护基的氨基酸与式VII结构的氨基酸甲酯在肽缩合试剂作用下进行反应，得到式IX结构的二肽产物；该二肽产物碱性条件下水解，得到式X结构的化合物；6)将式X结构的化合物与式V化合物在肽缩合反应试剂作用下进行反应，得到式I中X为-C(O)-NH-的化合物；
其中，R1、R2、R3为1到10个碳的直链、支链烷基或取代烷基，3-6元环烷基，苄基，取代苄基，杂环类取代基；Pg为氨基保护基。
常见的肽缩合试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯并三唑或氯甲酸异丁酯。
式I中X为-C(O)-NH-的化合物的制备方法，包括如下步骤1)式II结构的带有叔丁氧羰基保护的氨基酸在肽缩合试剂作用下，与N，O-二甲基羟胺盐酸盐反应，得到式III结构化合物；2)式III结构化合物在有机锂试剂作用下与呋喃反应，得到式IV化合物；3)式IV化合物脱除叔丁氧羰基，得到式V化合物；4)将式VIII结构的带有保护基的氨基酸与甲基化试剂反应进行甲基化，然后，还原得到式XI结构的化合物；5)将式XI结构的化合物以能将醇氧化为醛的氧化剂进行氧化，然后，与Ph3PCHCOOEt反应，得到式XII结构的化合物；将所得化合物以环氧化试剂进行环氧化，得到式XIII化合物；6)将式XIII化合物与有机胺进行反应，得到XIV结构的化合物；XIV结构的化合物碱性条件下水解，得到式XV化合物；7)式XV化合物与式V化合物在肽缩合反应试剂作用下，反应得到式I中X为-C(O)-NH-的化合物。
其中，R1、R3为1到10个碳的直链、支链烷基或取代烷基，3-6元环烷基，苄基，取代苄基，杂环类取代基；R2为1到10个碳的烷胺基，芳香胺基；
Pg为氨基保护基。
常见的肽缩合试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，1-羟基苯并三唑(HOBt)或氯甲酸异丁酯。
本发明的另一个目的是提供本发明化合物的用途。
本发明发明人通过实验证实，本发明化合物具有良好的抑制蛋白酶体的活性和抗肿瘤活性，特别是N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-3-甲基丁基]-L-苯丙氨酰胺，其抑制蛋白酶体的活性和抗肿瘤活性高，可以用于制备抗肿瘤药物，广泛用于肿瘤的治疗。
本发明设计并合成了一类新结构类型的拟肽类具有蛋白酶体抑制功能的化合物，即一段短肽或拟肽的酰基呋喃化合物，表现出较好的蛋白酶体抑制活性和抗肿瘤作用，有广阔的应用价值。

第一部分化合物的合成本发明的化合物的制备可按照如下过程进行一、制备中间体式V化合物 将带有叔丁氧羰基保护的氨基酸(式II)溶于一定量二氯甲烷中，-13℃下加入有机胺(如N-甲基吗啉)和肽缩合试剂(如氯甲酸异丁酯)，反应5分钟，然后加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐，将反应体系的温度升高到室温，继续搅拌，TLC监测直到反应完成。有机相用酸洗(10％的柠檬酸水溶液)、碱洗(饱和碳酸氢钠水溶液)，然后用饱和食盐水洗，干燥剂干燥(无水硫酸钠或硫酸镁)。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，剩余油状液体用柱层析方法分离得式III化合物。
-78℃下，将有机锂试剂(如n-BuLi)加入呋喃的有机溶液(如THF)中，升至0℃反应半小时，然后加入式III化合物，-78℃继续反应2.5小时。反应结束后，将反应液倒入饱和NH4Cl溶液中淬灭，用有机溶剂(如Et2O)萃取3次，有机相用水洗，饱和NaCl洗，干燥剂(如无水硫酸钠)干燥。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，得到的黄色油状液体用柱层析方法分离得式IV化合物。
将式IV化合物溶于一定量的二氯甲烷中，加入等体积的三氟乙酸，室温搅拌(2小时)，反应结束蒸干溶剂，加入少量甲苯，减压蒸干溶剂。加入二氯甲烷溶解残余物，用0.1N的NaOH洗，有机相用干燥剂(无水硫酸钠)干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，得到中间体式V化合物，不经分离直接用于下一步反应。
二、式I中X为-C(O)-NH-的化合物(式I/A)的合成 将不带任何保护基的氨基酸(式VI)溶于无水甲醇中，-10℃下向其中加入二氯亚砜，室温反应5小时。蒸干溶剂，剩余固体重结晶(甲醇/乙醚)得氨基酸甲酯(式VII)。
将带有保护基的氨基酸(式VIII)和氨基酸甲酯(式VII)溶于DMF，加入合适的肽缩合反应试剂(N-甲基吗啉+HoBt+EDC·HCl)。室温反应过夜。加入有机溶剂(乙酸乙酯)稀释反应液，有机相用酸洗(10％柠檬酸)，碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)，饱和食盐水洗，干燥剂(无水硫酸钠和硫酸镁)干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，剩余固体重结晶(乙酸乙酯/石油醚)得二肽产物(式IX)。
将式IX结构的二肽产物溶于有机溶剂(THF)中，加入无机碱的水溶液(1NNaOH)，室温反应直到TLC检测反应完全。然后用无机酸(1N盐酸)将反应液的pH值调节到2-3之间，用有机溶剂(乙酸乙酯)萃取，有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠或硫酸镁)。滤除干燥剂，将溶剂减压蒸干，得到产物(式X)，不经分离直接用于下步反应。
将化合物X和中间体式V化合物溶于DMF中，加入合适的肽缩合反应试剂(N-甲基吗啉+HoBt+EDC·HCl)。室温反应过夜。加入有机溶剂(乙酸乙酯)稀释反应液，有机相用酸洗(10％柠檬酸)，碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)，饱和食盐水洗，干燥剂(无水硫酸钠和硫酸镁)干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，所得粗品用柱层析粗分，所得固体重结晶得产物(式I/A)。
三、式I中X为-C(O)-NH-的化合物(式I/B)的合成 将带有保护基的氨基酸(式VIII)溶于DMF中，加入无机碱(碳酸氢钠)和甲基化试剂(碘甲烷)，室温反应，直到TLC检测反应完成。向反应体系中加入水，用有机试剂(乙酸乙酯)萃取，合并有机相，用10％的亚硫酸钠溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，干燥剂(无水硫酸钠或硫酸镁)洗。滤除干燥剂，将溶剂减压蒸干。将残留的粗品溶于有机溶剂中(THF/EtOH＝2/3)，在0℃下加入还原剂(NaBH4和CaCl2)，反应5小时。将溶液小心的倒入0℃的酸溶液(1M柠檬酸)中，用有机溶剂(乙酸乙酯)萃取，合并有机相，用碱液(饱和碳酸氢钠溶液)洗，饱和食盐水洗，干燥剂(无水硫酸钠或硫酸镁)干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，将所得粗品用柱层析方法或重结晶法纯化的产物(式XI)。
将式XI化合物溶于二氯甲烷中，加入可以将醇氧化为醛的氧化剂(Py·SO3)，TLC监测反应结束后，将反应液倒入冰的饱和食盐水中，用有机溶剂(乙醚)萃取，合并有机相，用稀酸(10％柠檬酸溶液)洗，水洗，饱和食盐水洗，干燥剂(无水硫酸钠或硫酸镁)干燥。滤除干燥剂，在30℃以下减压蒸干溶剂，所得粗品不经分离，溶于适量有机溶剂中(甲苯)，加热回流(80℃)一定时间(1小时)。反应完成后浓缩反应液，柱层析分离或重结晶得到产物(式XII)。
将产物(式XII)溶于二氯甲烷中，加入环氧化试剂(m-PCBA)，常温下搅拌，直到TLC监测反应完成。用乙醚稀释反应液，有机相用10％亚硫酸钠洗，碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)，饱和食盐水洗，干燥剂(无水硫酸钠或硫酸镁)干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，粗品用柱层析分离纯化，得到产物(式XIII)。
将产物(式XIII)溶于有机溶剂中(无水乙醇)，加入伯胺(苯胺和苄胺)，加热反应一定时间(60℃，3天)，直到TLC监测反应完成，减压蒸干溶剂，用柱层析分离所得粗品，得产品(式XIV)。
将式XIV化合物溶于有机溶剂(THF)中，加入无机碱的水溶液(1N NaOH)，室温反应直到TLC监测反应完全。然后用无机酸(1N盐酸)将反应液的pH值调节到2-3之间，用有机溶剂(乙酸乙酯)萃取，有机相用干燥剂干燥(无水硫酸钠或硫酸镁)。滤除干燥剂，将溶剂减压蒸干，得到产物XV，不经分离直接用于下步反应。
将化合物XV和式V化合物溶于DMF中，加入合适的肽缩合反应试剂(N-甲基吗啉+HoBt+EDC·HCl)。室温反应过夜。加入有机溶剂(乙酸乙酯)稀释反应液，有机相用酸洗(10％柠檬酸)，碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)，饱和食盐水洗，干燥剂(无水硫酸钠和硫酸镁)干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，所得粗品用柱层析粗分，所得固体重结晶得产物式I/B。
以下以具体化合物的合成来描述一、氨基酰呋喃片段的合成 1、(S)-2-氨基-1-(呋喃-2-基)-3-甲基丁-1-酮(化合物3a)的合成(S)-1-(N-甲氧基-N-甲基氨甲酰)-2-甲基丙基氨基甲酸叔丁酯(化合物1a)的合成将Boc-Val-OH(叔丁氧羰基保护的缬氨酸)(2.17g，10mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入N-甲基吗啉(NMM，2.2mL，22mmol)，在-13℃加入氯甲酸异丁酯(1.3mL，11mmol)，反应5分钟，然后加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(1.02g，11mmol)，室温反应5小时。反应结束后，有机相用10％的柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，剩余油状液体用乙酸乙酯/石油醚＝1/8-1/5柱分。得化合物1a 2.08g(产率80％)，无色透明油状液体。
(S)-1-(呋喃-2-基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(化合物2a)的合成-78℃下，将n-BuLi(1.6M的正己烷溶液22mL，35mmol)加入呋喃(2.6mL，36mmol)的50mL THF溶液中，升至0℃反应半小时，然后在-78℃加入化合物1a(2.60g，10mmol)的THF溶液，继续反应2.5小时。反应结束后，将反应液倒入饱和NH4Cl溶液中淬灭，用Et2O萃取3次，有机相用水洗，饱和NaCl洗，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，得到的黄色油状液体用乙酸乙酯/石油醚＝1/10-1/8柱分。得化合物2a 2.42g(产率92％)，褐色油状液体。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.84(d，J＝6.9，3H，CH3)，1.03(d，J＝6.9，3H，CH3)，1.44(s，9H，Boc)，2.19(m，1H，CH)，4.96(m，1H，CH)，5.30(m，1H，NH)，6.56(dd，J＝1.8Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，7.30(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.63(d，J＝1.8Hz，1H，5’-H)。
(S)-2-氨基-1-(呋喃-2-基)-3-甲基丁-1-酮(化合物3a)的合成将化合物2a(267mg，1mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌2小时，反应结束蒸干溶剂，加入少量甲苯再次减压蒸干溶剂，加入二氯甲烷溶解残渣，用0.1N NaOH洗，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，得化合物3a，黑色油状液体，不经分离直接用于下一步反应。
2、(S)-2-氨基-1-(呋喃-2-基)-4-甲基戊-1-酮(化合物3b)的合成(S)-(N-甲氧基-N-甲基氨甲酰)-3-甲基丁基氨基甲酸叔丁酯(化合物1b)的合成将Boc-Leu-OH(叔丁氧羰基保护的亮氨酸)(2.31g，10mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入N-甲基吗啉(2.2mL，22mmol)，在-13℃加入氯甲酸异丁酯(1.3mL，11mmol)，反应5分钟，然后加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(1.02g，11mmol)，室温反应5小时。反应结束后，有机相用10％的柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，剩余油状液体用乙酸乙酯/石油醚＝1/8-1/5柱分，得化合物1b 1.97g(产率72％)，无色透明油状液体。
(S)-1-(呋喃-2-基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(化合物2b)的合成-78℃下，将n-BuLi(1.6M的正己烷溶液22mL，35mmol)加入呋喃(2.6mL，36mmol)的50mL THF溶液中，升至0℃反应半小时，然后在-78℃加入化合物1b(2.74g，10mmol)的THF溶液，继续反应2.5小时。反应结束后，将反应液倒入饱和NH4Cl溶液中淬灭，用Et2O萃取3次，有机相用水洗，饱和NaCl洗，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，得到的黄色油状液体用乙酸乙酯/石油醚＝1/10-1/8柱分。得化合物2b 2.24g(产率80％)，褐色油状液体。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.93(d，J＝6.6，3H，CH3)，1.04(d，J＝6.6，3H，CH3)，1.44(s，9H，Boc)，1.57(m，2H，CH2)，1.80(m，1H，CH)，5.07(m，1H，CH)，5.22(d，J＝8.4Hz，1H，NH)，6.57(dd，J＝1.8Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，7.31(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.63(d，J＝1.8Hz，1H，5’-H)，MS(ESI)，m/e，282.17(M+1)，304.16(M+Na)。
(S)-2-氨基-1-(呋喃-2-基)-4-甲基戊-1-酮(化合物3b)的合成将化合物2b(281mg，1mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌2小时，反应结束蒸干溶剂，加入少量甲苯再次减压蒸干溶剂，加入二氯甲烷溶解残渣，用0.1N NaOH洗，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，得化合物3b，黑色油状液体，不经分离直接用于下一步反应。
3、(2S，3R-)2-氨基-1-(呋喃-2-基)-3-甲基戊-1-酮(化合物3c)的合成(1S，2R)-1-(N-甲氧基-N-甲基氨甲酰)-2-甲基丁基氨基甲酸叔丁酯(化合物1c)的合成将Boc-Ile-OH(叔丁氧羰基保护的异亮氨酸)(2.31g，10mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入N-甲基吗啉(2.2mL，22mmol)，在-13℃加入氯甲酸异丁酯(1.3mL，11mmol)，反应5分钟，然后加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(1.02g，11mmol)，室温反应5小时。反应结束后，有机相用10％的柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，剩余油状液体用乙酸乙酯/石油醚＝1/8-1/5柱分。得化合物1c 1.9g(产率70％)，无色透明油状液体。
(2S，3R)-1-(呋喃-2-基)-3-甲基-1-氧代戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(化合物2c)的合成-78℃下，将n-BuLi(1.6M的正己烷溶液22mL，35mmol)加入呋喃(2.6mL，36mmol)的50mL THF溶液中，升至0℃反应半小时，然后在-78℃加入化合物1c(2.74g，10mmol)的THF溶液，继续反应2.5小时。反应结束后，将反应液倒入饱和NH4Cl溶液中淬灭，用Et2O萃取3次，有机相用水洗，饱和NaCl洗，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，有机相减压蒸干，得到的黄色油状液体用乙酸乙酯/石油醚＝1/10-1/8柱分。得化合物2c 2.47g(产率88％)，褐色油状液体。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.86(t，3H，CH3)，0.98(d，3H，CH3)，1.14(m，2H，CH2)，1.43(s，9H，Boc)，1.90(m，1H，CH)，4.96(dd，1H，CH)，5.28(d，1H，NH)，6.57(dd，J＝1.8Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，7.31(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.63(d，J＝1.8Hz，1H，5’-H)。
(2S，3R-)2-氨基-1-(呋喃-2-基)-3-甲基戊-1-酮(化合物3c)的合成将化合物2c(281mg，1mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌2小时，反应结束蒸干溶剂，加入少量甲苯再次减压蒸干溶剂，加入二氯甲烷溶解残渣，用0.1N NaOH洗，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，得化合物3c，黑色油状液体，不经分离直接用于下一步反应。
二、式I中X为-C(O)-NH-的化合物(化合物7-15)的合成 1、2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰胺]-3-苯基-丙酸(化合物6a)的合成(S)-2-氨基-3-苯基丙酸甲酯(化合物4a)的合成-10℃下，将SOCl2(5mL)滴入H-Phe-OH(1.65g，10mmol)的30mL无水MeOH溶液中，然后在室温反应5小时。反应完毕后将溶液减压蒸干，剩余固体用MeOH/Et2O重结晶，得化合物4a 1.68g(产率94％)，白色针状晶体，mp 161-163℃。
2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰胺]-3-苯基-丙酸甲酯(化合物5a)的合成将Boc-Phe-OH(2.65g，10mmol)和化合物4a(1.79g，10mmol)溶于DMF中，向其中加入NMM(1.6mL，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)和EDC·HCl(2.88g，15mmol)，混合物室温反应12小时。停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后剩余固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶，得化合物5a 3.07g(产率72％)，白色针状晶体。mp 118-119℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.40(s，9H，Boc)，3.02-3.06(m，4H，PhCH2)，3.67(s，3H，CH3)，4.32(m，1H，CH)，4.79(m，1H，CH)，4.95(m，1H，NH)，6.25(m，1H，NH)，6.96-7.29(m，10H，Ph)。
2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰胺]-3-苯基-丙酸(化合物6a)的合成将化合物5a(426mg，1mmol)溶于5mL THF中，加入1.1mL 1N的NaOH，在室温反应10小时。然后用1N的HCl将pH值调节到2-3，用乙酸乙酯萃取4-5次，有机相用无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，得到化合物6a，浅黄色固体。产物不经分离直接用于下步反应。
2、2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰氨]-4-甲基-戊酸(化合物6b)的合成(S)-2-氨基-4-甲基戊酸甲酯(化合物4b)的合成-10℃下，将SOCl2(5mL)滴入H-Leu-OH(1.31g，10mmol)的30mL无水MeOH溶液中，然后在室温反应5小时。反应完毕后将溶液减压蒸干，剩余固体用MeOH/Et2O重结晶，得化合物4b 1.27g(产率88％)，白色针状晶体，mp 151-152℃。
2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰氨]-4-甲基-戊酸甲酯(化合物5b)的合成将Boc-Phe-OH(2.65g，10mmol)和化合物4b(1.45g，10mmol)溶于DMF中，向其中加入NMM(1.6mL，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)和EDC·HCl(2.88g，15mmol)，混合物室温反应12小时。停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后剩余固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶，得化合物5b 2.80g(产率70％)，白色针状晶体。mp 106-108℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.89(t，6H，CH3)，1.41(s，9H，Boc)，1.43-1.60(m，3H，CHand CH2)，3.05-3.08(m，2H，PhCH2)，3.69(s，3H，CH3)，4.35(m，1H，CH)，4.57(m，1H，CH)，4.98(m，1H，NH)，6.24(m，1H，NH)，7.19-7.29(m，5H，Ph)，MS(ESI)，m/e.393.34(M+1)，415.22(M+Na)。
2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰氨]-4-甲基-戊酸(化合物6b)的合成将化合物5b(392mg，1mmol)溶于5mL THF中，加入1.1mL 1N的NaOH，在室温反应10小时。然后用1N的HCl将pH值调节到2-3，用乙酸乙酯萃取4-5次，有机相用无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，得到化合物6b，白色固体。产物不经分离直接用于下步反应。
3、2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰氨]-3-甲基-丁酸(化合物6c)的合成
(S)-2-氨基-3-甲基丁酸甲酯(化合物4c)的合成-10℃下，将SOCl2(5mL)滴入H-Val-OH(1.17g，10mmol)的30mL无水MeOH溶液中，然后在室温反应5小时。反应完毕后将溶液减压蒸干，剩余固体用MeOH/Et2O重结晶，得化合物4c 1.17g(产率90％)，白色块状晶体，mp 152-154℃。
2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰氨]-3-甲基-丁酸甲酯(化合物5c)的合成将Boc-Phe-OH(2.65g，10mmol)和化合物4c(1.31g，10mmol)溶于DMF中，向其中加入NMM(1.6mL，15mmol)、HOBt(2.03g，15mmol)和EDC·HCl(2.88g，15mmol)，混合物室温反应12小时。停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后剩余固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶，得化合物5c 3.09g(产率82％)，mp122-123 ℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.82-0.94(m，6H，CH3)，1.40(s，9H，Boc)，2.10(m，1H，CH)，3.05-3.07(m，2H，PhCH2)，3.69(s，3H，CH3)，4.43(m，1H，CH)，4.75(m，1H，CH)，5.04(m，1H，NH)，6.40(m，1H，NH)，7.15-7.32(m，5H，Ph)。
2-[2-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-苯基-丙酰氨]-3-甲基-丁酸(化合物6c)的合成将化合物5c(378mg，1mmol)溶于5mL THF中，加入1.1mL 1N的NaOH，在室温反应10小时。然后用1N的HCl将pH值调节到2-3，用乙酸乙酯萃取4-5次，有机相用无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，得到化合物6c，白色固体。产物不经分离直接用于下步反应。
4、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丙基]-L-缬氨酰胺(化合物7)的合成 将化合物6c(364mg，1mmol)和化合物3a(167mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得200mg化合物7(产率39％)。白色固体，mp，196-197℃.
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.78-0.98(m，12H，CH3)，1.40(s，9H，Boc)，1.96-2.11(m，2H，CH)，3.04-3.15(m，2H，CH2Ph)，4.27-4.34(m，2H，CH)，5.25-5.28(m，1H，CH)，6.50(d，1H，NH)，6.56(dd，J＝1.8Hz，3.6 Hz，4’-H)，6.62(m，1H，NH)，6.75(m，1H)，7.18-7.30(m，5H，Ph)，7.34(d，J＝3.6Hz，3’-H)，7.64(d，J＝1.8Hz，5’-H).MS(ESI)，m/e，514.25(M+1)，536.23(M+Na)。
5、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丙基]-L-亮氨酰胺(化合物8)的合成 将化合物6b(378mg，1mmol)和化合物3a(167mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得226mg化合物8(产率43％)。白色固体，mp，165-166℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.85(d，9H，CH3)，0.98(d，3H，CH3)，1.38(s，9H，Boc)，1.45-1.56(m，2H，CH2)，2.24(m，1H，CH)，2.87-3.08(m，2H，CH2Ph)，4.41(m，1H，CH)，4.52(m，1H，CH)，5.16(m，1H，CH)，5.26(m，1H，NH)，6.56(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，6.65(m，1H，NH)，6.92(m，1H，NH)，7.18-7.27(m，5H，Ph)，7.38(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.64(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H).MS(ESI)，m/e，528.26(M+1)，550.24(M+Na)。
6、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丙基]-L-苯丙氨酰胺(化合物9)的合成 将化合物6a(412mg，1mmol)和化合物3a(167mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得168mg化合物9(产率30％)。白色固体，mp，170-172℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.79(d，3H，CH3)，0.92(d，3H，CH3)，1.37(s，9H，Boc)，2.13-2.19(m，1H，CH)，2.87-3.05(m，4H，PhCH2)，4.75(m，1H，CH)，4.42(m，1H，CH)，5.15(m，1H，CH)，5.18(m，1H，NH)，6.57(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，6.75(m，1H，NH)，6.85(m，1H，NH)，7.01-7.26(m，10H，Ph)，7.37(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.64(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H).MS(ESI)，m/e，562.26(M+1)，584.24(M+Na)。
7、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-3-甲基丁基]-L-缬氨酰胺(化合物10)的合成 将化合物6c(364mg，1mmol)和化合物3b(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得300mg化合物10(产率57％)。白色固体，mp，149-151℃.
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.83-0.87(m，9H，CH3)，0.90-0.97(m，3H，CH3)，1.01-1.12(m，2H，CH2)，1.39(s，9H，Boc)，1.97-2.08(m，2H，CH)，3.04-3.14(m，2H，CH2Ph)，4.32(m，1H，CH)，4.39(m 1H，CH)，5.15(m，1H，CH)，5.28(m，1H，NH)，6.57(dd，J＝1.8Hz，3.6Hz，4’-H)，6.64(m，1H，NH)，6.77(m，1H，NH)-7.22-7.33(m，5H，Ph)，7.35(d，J＝3.6Hz，3’-H)，7.63(d，J＝1.8Hz，5’-H).MS(ESI)，m/e，528.19(M+1)，550.17(M+Na)。
8、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-3-甲基丁基]-L-亮氨酰胺(化合物11)的合成 将化合物6b(378mg，1mmol)和化合物3b(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得211mg化合物11(产率39％)。白色固体，mp，151-153℃.
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.79-0.99(m，12H，CH3)，1.30(s，9H，Boc)，1.37-1.55(m，4H，CH2)，2.01(m，1H，CH)，3.05(m，2H，PhCH2)，4.51(m，2H，CH)，5.21(m，1H，CH)，5.29(m，1H，NH)，6.53(dd，J＝1.8Hz，3.6Hz，4’-H)，6.80(m，1H，NH)，6.99(m，1H)，7.17-7.27(m，5H，Ph)，7.38(d，J＝3.6Hz，3’-H)，7.63(d，J＝1.8Hz，5’-H)；MS(ESI)，m/e，542.27(M+1)，564.26(M+Na)。
9、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-3-甲基丁基]-L-苯丙氨酰胺(化合物12)的合成 将化合物6a(412mg，1mmol)和化合物3b(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得201mg化合物12(产率35％)。白色固体，mp，145-147℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.85(t，3H，CH3)，0.96(t，3H，CH3)，1.55(m，2H，CH2)，2.03(m，1H，CH)，2.91-3.06(m，4H，CH2Ph)，4.31(m，1H，CH)，4.63(m，1H，CH)，4.89(m，1H，CH)，5.25(m，1H，NH)，6.42(m 1H，NH)，6.56(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，7.05(m，2H，NH)，7.15-7.28(m，10H，Ph)，7.31(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.63(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H).MS(ESI)，m/e，576.32(M+1)，598.30(M+Na)。
10、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丁基]-L-缬氨酰胺(化合物13)的合成
将化合物6c(364mg，1mmol)和化合物3c(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得258mg化合物13(产率49％)。白色固体，mp，181-182℃.
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.79-0.87(m，9H，CH3)，1.00(d，3H，CH3)，1.38(s，9H，Boc)，2.08-2.11(m，1H，CH)，2.21-2.28(m，1H，CH)，3.04-3.14(m，2H，CH2Ph)，4.32-4.35(m，2H，CH)，5.02(m，1H，CH)，5.25(t，1H，NH)，6.48(d，1H，NH)，6.57(dd，J＝1.8Hz，3.6Hz，4’-H)，6.75(m，1H，NH)，7.18-7.26(m，5H，Ph)，7.33(d，J＝3.6Hz，3’-H)，7.63(d，J＝1.8Hz，5’-H).MS(ESI)，m/e，528.26(M+1)，550.25(M+Na)。
11、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丁基]-L-亮氨酰胺(化合物14)的合成 将化合物6b(378mg，1mmol)和化合物3c(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC.HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得200mg化合物14(产率37％)。白色固体，mp，164-165℃.
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.81-0.85(m，12H，CH3)，1.12-1.23(m，1H，CH)，1.29(s，9H，Boc)，1.33-1.44(m，2H，CH2)，1.45-1.58(m，2H，CH2)，1.87-1.92(m，1H，CH)，2.68-2.74(m，1H，CH2Ph)，2.92-2.95(m，1H，CH2Ph)，4.15(m，1H，CH)，4.43(m，1H，CH)，4.88(t，1H，CH)，6.72(dd，J＝1.5Hz，3.5Hz，4’-H)，6.91(d，1H，NH)，7.16-7.30(m，5H，Ph)，7.55(d，J＝3.5Hz，3’-H)，7.91(d，1H，NH)，8.02(d，J＝1.5Hz，5’-H)，8.24(d，1H，NH).MS(ESI)，m/e，542.27(M+1)，564.26(M+Na)。
12、N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-苯丙氨酰-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丁基]-L-苯丙氨酰胺(化合物15)的合成 将化合物6a(412mg，1mmol)和化合物3c(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂后用乙酸乙酯/石油醚＝1/2柱分，对柱分后获得的产品进行重结晶，得258mg化合物15(产率45％)。白色固体，mp，190-192℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.81(t，3H，CH3)，0.88(d，3H，CH3)，0.95(m，2H，CH2)，1.88(m，1H，CH)，2.85-3.06(m，4H，CH2Ph)，4.38(m，1H，CH)，4.65(m，1H，CH)，4.97(m，1H，CH)，5.14(m，1H，NH)，6.51(m，1H，NH)，6.57(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，6.58(m，1H，NH)，7.03-7.28(m，10H，Ph)，7.33(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.65(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H).MS(ESI)，m/e，576.25(M+1)，598.24(M+Na)。
三、式I中X为-C(O)-NH-的化合物(化合物23-28)的合成 1、(2R，3S，4S)-2-(苄氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基戊酸(化合物21)的合成
(S)-1-羟基-3-苯基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯(化合物16)的合成将Boc-Phe-OH(2.65g，10mmol)溶于20mL DMF中，加入NaHCO3(1.68g，20mmol)和CH3I(1mL，16mmol)，室温搅拌15小时。向溶液中加入水，用乙酸乙酯萃取3次，有机相用10％NaSO3洗，水洗，饱和NaCl洗，MgSO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，所得粗产物不经分离，直接用于下步反应。将Boc-Phe-OCH3(2.79g，10mmol)溶于THF/EtOH(16mL/25mL)的混合溶液中，0℃下加入CaCl2(2.22g，20mmol)和NaBH4(1.52g，40mmol)。缓慢升至室温，反应5小时。将溶液小心倒入0℃的1M柠檬酸中，用乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，将有机相蒸干，剩余固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶，得2.31g化合物16(产率92％)。白色针状晶体，mp92-94℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.41(s，9H，Boc)，2.52(br s，1H，OH)，3.51-3.67(m，2H，CH2)，3.82(s，1H，CH)，4.83(s，1H，NH)，7.20-7.32(m，5H，Ph)。
(S，E)-4-(乙氧羰基)-1-苯基丁-3-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯(化合物17)的合成将化合物16(2.50g，10mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入Et3N(4.2mL，30mmol)，-10℃下加入Py·SO3(4.77g，30mmol)的30mL DMSO溶液，室温反应30分钟。将反应液倒入0℃的饱和NaCl溶液中，用0℃的Et2O萃取3次，有机相用10％的柠檬酸洗一次，水洗一次，饱和NaCl溶液洗一次，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂，得到油状液体，不经分离直接用于下一步反应。将上一步获得的油状液体溶于甲苯，加入Ph3PCHCOOEt(3.48g，10mmol)，80℃反应1小时。反应结束后直接拌样上柱。乙酸乙酯/石油醚＝1/10到1/8分离，得2.87g化合物17(产率90％)。白色针状晶体，mp67-69℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.25(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，1.39(s，9H，Boc)，2.89(m，2H，PhCH2)，4.18(q，J＝7.2，2H，CH2)，4.51(br s，1H，CH)，4.61(br.s，1H，NH)，5.86(d，J＝15.6Hz，1H，CH)，6.90(dd，J＝15.6Hz，5.1Hz，1H，CH)，7.16-7.34(m，5H，Ph).MS(ESI)，m/e，320.18(M+1)，342.16(M+Na)。
(S)-1-((2R，3S)-3-(乙氧羰基)环氧乙-2-基)-2-苯乙基氨基甲酸叔丁酯(化合物18)的合成将化合物17(319mg，1mmol)溶于10mL CH2Cl2中，室温下加入m-CPBA(920mg，4mmol)，反应5天。反应完毕后有机相用Et2O稀释，用冰的10％Na2SO3洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl溶液洗，无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，蒸干溶剂，柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/8到1/6)，得190mg化合物18(产率57％)。白色固体，mp52-53℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.28(t，J＝7.5Hz，3H，CH3)，1.39(s，9H，Boc)，2.82-3.00(m，2H，PhCH2)，3.26(d，1H，CH)，3.30(dd，1H，CH)，4.21(t，J＝7.5Hz，CH2)，4.25(m，1H，CH)，4.50(d，1H，NH)，7.20-7.33(m，5H，Ph).MS(ESI)，m/e，336.18(M+1)，358.16(M+Na)，374.14(M+K)。
(2S，3R，4R)-4-(乙氧羰基)-4-(苄氨基)-3-羟基-1-苯基丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(化合物19)的合成将化合物18(335mg，1mmol)溶于5mL无水EtOH中，加入苄胺(0.22mL，2mmol)，60℃反应2天。反应完毕后加入硅胶拌样，柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/5)，得386mg化合物19(产率87.5％)。无色油状液体。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.23(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，1.37(s，9H，Boc)，2.58(br s，1H，OH)，2.82-2.93(m，2H，PhCH2)，3.31(d，J＝8.4Hz，1H，CH)，3.59 and 3.78(AB，2H，PhCH2NH)3.70(d，J＝7.8Hz，1H，PhCH2NH)，4.04(q，J＝7.8Hz，1H，CH)，4.18(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，4.80(d，J＝9.6Hz，1H，NH)，7.17-7.33(m，10H，Ph).MS(ESI)，m/e，443.24(M+1)，465.25(M+Na).
(2R，3S，4S)-2-(苄氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基戊酸(化合物21)的合成将化合物19(442mg，1mmol)溶于5mL THF中，加入1.1mL 1N的NaOH，在室温反应10小时。然后用1N的HCl将pH值调节到2-3，用乙酸乙酯萃取4-5次，有机相用无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，所得粗产物化合物21不经分离直接用于下步反应。
2、(2R，3S，4S)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-2-(苯氨)-5-苯基戊酸(化合物22)的合成(2S，3R，4R)-4-(乙氧羰基)-3-羟基-1-苯基-4-(苯氨基)丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(化合物20)的合成将化合物18(335mg，1mmol)溶于5mL无水EtOH中，加入苯胺(0.18mL，2mmol)，60℃反应2天。反应完毕后加入硅胶拌样，柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/4)，得257mg化合物20(产率60％)。黄色块状晶体，mp78-80℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ，1.18(t，3H，CH3)，1.40(s，9H，Boc)，2.95(m，2H，CH2Ph)，3.78(m，1H，CH)，3.90(m，1H，CH)，4.05(m，1H，CH)，4.15(m，1H，NH)，4.18(q，2H，CH2)，4.95(m，1H，NH)，6.62(d，2H，Ph)，6.74(t，1H，Ph)，7.12(t，2H，Ph)，7.10-7.26(m，5H，Ph).MS ESI)，m/e，429(M+1)，451(M+Na)。
(2R，3S，4S)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-2-(苯氨)-5-苯基戊酸(化合物22)的合成将化合物20(428mg，1mmol)溶于5mL THF中，加入1.1mL 1N的NaOH，在室温反应10小时。然后用1N的HCl将pH值调节到2-3，用乙酸乙酯萃取4-5次，有机相用无水NaSO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，所得粗产物化合物22不经分离直接用于下步反应。
3、(2R，3S，4S)-2-(苄氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丙基]-戊酰胺(化合物23)的合成 将化合物21(414mg，1mmol)和化合物3a(167mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，粗产品用柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/5-1/3)，对柱分后获得的产品进行重结晶，得141mg化合物23(产率25％)。白色晶体，mp147℃-148℃.
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.79(d，J＝6.9Hz，3H，CH3)0.96(d，J＝6.9Hz，3H，CH3)，1.42(s，9H，Boc)，1.7(br s，1H，OH)，2.23(m，1H，CH)，2.88-2.97(m，2H，PhCH2)，3.22(d，J＝9.6Hz，1H，CH)，3.52 and 3.72(AB，2H，PhCH2)，3.66(d，1H，PhCH2NH)，4.04(m，1H，CH)，5.17(d，J＝19.8Hz，1H，CH)，5.22(dd，J＝5.4Hz，9.3Hz，1H，CH)，5.27(s，1H，NH)，6.56(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，7.16-7.38(m，10H，Ph)，7.36(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.61(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H)，8.43(d，1H，NH)，MS(ESI)，m/e564.25(M+1)，586.24(M+Na)。
4、(2R，3S，4S)-2-(苄氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-3-甲基丁基]-戊酰胺(化合物24)的合成 将化合物21(414mg，1mmol)和化合物3b(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，粗产品用柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/5-1/3)，对柱分后获得的产品进行重结晶，得340mg化合物24(产率60％)。白色晶体，mp77-78℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.88(d，3H，CH3)，1.00(d，3H，CH3)，1.11-1.25(m，2H，CH2)，1.39(s，9H，Boc)，1.58(m，1H，CH)，1.71(br s，1H，OH)，2.88-2.97(m，2H，CH2Ph)，3.24(d，1H，CH)，3.52 and 3.72(AB，2H，PhCH2)，3.68(d，1H，PhCH2NH)，4.05(m，1H，CH)，5.15(d，1H，CH)，5.27(m，1H，CH)，5.31(m，1H，NH)，6.56(dd，J＝1.8Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，7.18-7.38(m，10H，Ph)，7.36(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.62(d，J＝1.8Hz，1H，5’-H)，8.40(d，1H，NH)，MS(ESI)，m/e，578.33(M+1)，600.32(M+Na)。
5、(2R，3S，4S)-2-(苄氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丁基]-戊酰胺(化合物25)的合成 将化合物21(414mg，1mmol)和化合物3c(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，粗产品用柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/5-1/3)，对柱分后获得的产品进行重结晶，得174mg化合物25(产率30％)。白色晶体，mp67-69℃，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ，0.82(t，3H，CH3)，0.92(d，3H，CH3)，1.25-1.37(m，2H，CH2)，1.94(m，1H，CH)，2.89-2.99(m，2H，CH2Ph)，3.21(d，1H，CH)，3.51 and 3.72(AB，2H，PhCH2)，3.67(d，1H，PhNH)，4.04(q，1H，CH)，5.18(m，1H，CH)，5.21(m，1H，CH)，5.23(m，1H，NH)，6.56(dd，J＝1.5Hz，3.0Hz，1H，4’-H)，7.17-7.36(m，10H，Ph)，7.36(d，J＝3.0Hz，1H，3’-H)，7.62(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H)，8.38(d，1H，NH).MS(ESI)，m/e578.33(M+1)，600.32(M+Na)。
6、(2R，3S，4S)-2-(苯氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丙基]-戊酰胺(化合物26)的合成 将化合物22(400mg，1mmol)和化合物3a(167mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，粗产品用柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/3-1/2)，对柱分后获得的产品进行重结晶，得137mg化合物26(产率25％)。白色晶体，mp，181-182℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.73(d，3H，CH3)，0.95(d，3H，CH3)，1.31(s，9H，Boc)，2.20(m，1H，CH)，2.84-2.88(m，2H，PhCH2)，3.76(m，1H，CH)，3.92(m，1H，CH)，4.01(m，1H，CH)，5.04(m，1H，CH)，5.23(m，1H，NH)，6.55(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，6.57(d，2H，PhNH)，6.62(t，1H，PhNH)，7.06-7.26(m，7H，Ph)，7.26(m，1H，NH)，7.29(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.60(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H)，7.80(d，1H，NH).MS(ESI)，m/e，550.27(M+1)，572.25(M+Na)。
7、(2R，3S，4S)-2-(苯氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-3-甲基丁基]-戊酰胺(化合物27)的合成 将化合物22(400mg，1mmol)和化合物3b(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，粗产品用柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/3-1/2)，对柱分后获得的产品进行重结晶，得146mg化合物27(产率26％)。白色晶体，mp，206-208℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.86(d，3H，CH3)，0.99(d，3H，CH3)，1.32(s，9H，Boc)，1.50-1.53(m，2H，CH2)，1.55-1.61(m，1H，CH)，2.82-2.87(m，2H，PhCH2)，3.72(m，1H，CH)，3.97(m，1H，CH)，4.00(m，1H，CH)，5.02(m，1H，CH)，5.35(m，1H，NH)，6.56(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，6.62(d，2H，PhNH)，6.78(t，1H，PhNH)，7.05(m，1H，NH)，7.10-7.31(m，7H，Ph)，7.61(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.72(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H)，7.75(d，1H，NH).MS(ESI)，m/e，564.29(M+1)，586.49(M+Na)。
8、(2R，3S，4S)-2-(苯氨)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)-羰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-N-[1-[(呋喃-2-基)-羰基]-2-甲基丁基]-戊酰胺(化合物28)和合成 将化合物22(400mg，1mmol)和化合物3c(181mg，1mmol)溶于5mL DMF中，加入NMM(0.16mL，1.5mmol)、HOBt(203mg，1.5mmol)和EDC·HCl(288mg，1.5mmol)，，室温反应12-24小时(TLC监测)，停止反应，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用10％柠檬酸洗，饱和NaHCO3洗，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥。滤除干燥剂，减压蒸干溶剂，粗产品用柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/3-1/2)，对柱分后获得的产品进行重结晶，得135mg化合物28(产率24％)。白色晶体，mp，189-190℃，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.78(t，3H，CH3)，0.90(d，3H，CH3)，1.25(m，2H，CH2)，1.32(s，9H，Boc)，1.93(m，1H，CH)，2.84-2.88(m，2H，PhCH2)，3.75(m，1H，CH)，3.95(m，1H，CH)，3.99(m，1H，CH)，5.02(m，1H，CH)，5.22(m，1H，NH)，6.57(dd，J＝1.5Hz，3.6Hz，1H，4’-H)，6.63(d，2H，PhNH)，6.79(t，1H，PhNH)，7.06(m，1H，NH)，7.10-7.31(m，7H，Ph)，7.60(d，J＝3.6Hz，1H，3’-H)，7.73(d，J＝1.5Hz，1H，5’-H)，7.76(d，1H，NH).MS(ESI)，m/e，564.29(M+1)，586.26(M+Na)。
第二部分化合物生物活性测定1、蛋白酶体抑制活性用荧光多肽测定蛋白酶体糜蛋白样活性(ChT-L)，多肽结构为Suc-Leu-leu-Val-Tyr-AMC(Suc代表琥珀酰基，AMC代表7-酰胺-4-甲基香豆素，购自SIGMA试剂公司)。在100μl20mM的Tris-HCl(pH为7.8)中，将1μg从人红细胞纯化的20S蛋白酶体与各种浓度的待测化合物和100μM荧光多肽共同孵育1小时，温度为37℃。在激发/发射波长380/440nm下，用荧光分光光度计(Fluostar OPTIMA，BMG德国)测定7-酰胺-4-甲基香豆素释放的荧光。使用已知对蛋白酶体ChT-L活性有抑制作用的MG-132为阳性对照，0.1％DMSO为溶剂对照。0.5μM MG132的抑制率为78％。参照溶剂对照值，计算待测化合物的抑制率。实验重复三次。部分化合物结果如表1

表1本发明化合物对蛋白酶体抑制活性


2、抗肿瘤细胞增殖作用用标准的基于MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑)或SRB(磺酰罗丹明B)的比色法测定待测化合物抑制肿瘤细胞增殖的作用。分别使用MTT和SRB对悬浮和粘附细胞进行着色。不同细胞系种植在96孔微量培养板上，在每个孔中加入104个附着细胞HepG2(人肝癌细胞系)，105个悬浮细胞HL-60(人急性骨髓白血病细胞系)，分别制备5块板。18到24小时后，呈指数形式生长的细胞与浓度依次升高的待测化合物(1-100μM)接触48小时，以0.1％DMSO作为溶剂对照。然后加入5mg/ml MTT的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)溶液或0.4％的SRB(溶于1％醋酸)20μl。孵育4小时后，丢弃培养基，在空气中干燥，然后加入200μl酸性异丙醇或1％醋酸，以溶解晶体，用FLUOstar OPTIMA微量培养板多重探测读数仪(BMG德国)在570nm和540nm下分别测定MTT或SRB染色的吸收度。最后用计算机收集数据并处理数据。实验重复3次。
结果化合物12的抗人肝癌细胞活性为IC50＝34.2μM，抗人急性骨髓白血病细胞活性为IC50＝37.07μM。


本发明公开了具有蛋白酶体抑制功能的化合物及其制备方法与应用。本发明化合物，结构如式I，其中，X为－C(O)－NH－或－CH(OH)－；R