一种分离纯化小胶质细胞的方法[0002]现有技术公开了目前脑胶质瘤是发病率最高的原发性颅内肿瘤，其具有生存期短、复发率及死亡率高等特点。有统计显示,脑肿瘤是实体瘤患儿死亡的首要疾病,胶质瘤占儿童肿瘤构成比的1/5左右，成人胶质瘤占原发性颅内肿瘤的50%~60%。尽管近年来的综合治疗(包括手术、放疗、化疗)取得了进步，但胶质母细胞瘤2年的生存率为27.2%，5年仅为9.8%。由于免疫治疗具有抗肿瘤的精确性和可持续性等可能的潜在优势，故近年来对胶质瘤免疫逃逸机制及免疫治疗的研究成为胶质瘤应用基础研究中发展最为迅速的领域之一。[0003]小 胶质细胞(Microglia)是胶质瘤组织中浸润的主要免疫细胞。有研究采用流式细胞术发现胶质瘤组织中约1/3的细胞表达小胶质细胞的标记(CDllb/c)，其远远超过了胶质瘤组织中其他免疫细胞的数量。所述小胶质细胞与中枢神经系统的先天性和获得性免疫反应相关，在生理条件下，小胶质细胞呈分枝状并一直监视其周围的微环境，一旦被激活，其将对中枢神经系统的损伤做出反应并分泌炎性因子和神经营养因子，吞噬受损的细胞及碎片，乃至呈递抗原。[0004]基于小胶质细胞在中枢神经系统病理生理中的重要作用，最近有若干研究关注于人小胶质细胞的分离，以便探索其在多种中枢神经系统疾病中的作用；然而，目前大多数的分离方法都花费相当多的时间用生长因子(如M-CSF、GM-CSF)刺激培养细胞；其中，Gibbons等认为，若要获得理想的纯度和质量，势必要从分子生物学的角度分析小胶质细胞的表型(Int J Biochem Cell Biol，2010，42:844 - 856) ;Dick 和 Hussain 分别于 1997 年和2006年介绍了从新鲜组织中分离小胶质细胞的方法，但是并未涉及小胶质细胞的分离纯度(AIDS，1997，11:1699 - 1708 ；Neuro Oncol, 2006a, 8:261 - 279) ;2010 年，Adam Wu 采用Percoll密度梯度离心法分离人脑胶质瘤组织中的小胶质细胞(Neuro Oncol, 2010, 12(11):1113-1125)。新近，荷兰科学家Marta等提供了从尸体脑组织中分选小胶质细胞的途径，并且也采用了 percoll密度梯度离心联合磁珠分选的办法(GLIA，2012，60:96-111),但其中采用的机械剪切组织制备细胞悬液，仍存在细胞得率低及损伤较大的缺点，虽然Cardona等建立了从鼠脑组织中提取小胶质细胞的方法，并且达到了近100%的纯度(NatProtoc，2006，1:1947 - 1951 )，但目前为止，如何高效的从人的新鲜胶质瘤标本中获得高纯度的小胶质细胞仍然存在较大困难。[0005]迄今为止，尚未见有关结合Percoll密度梯度离心法与磁珠分选法，通过免疫磁珠标记CDllb有效地从新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，并在体外培养扩增的方法。
[0006]本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种分离纯化小胶质细胞的方法，尤其是从离体的新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞的方法；该方法结合Percoll密度梯度离心法与磁珠分选法，通过免疫磁珠标记CDllb有效地从离体的新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，并在体外培养扩增，为小胶质细胞与肿瘤免疫逃逸关系的研究提供重要的基础。
[0007]本发明中，首先采用机械剪切联合酶消化的方法提高细胞得率及减小细胞损伤，具有操作简便、效果显著的特点。
[0008]本发明中，结合Percoll密度梯度离心法与磁珠分选法，从离体的新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，其中的Percoll为包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒；其渗透压低? 20mosm/kg H20),粘度小,可形成高达1.3g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离效果；由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度较稳定；此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，可用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，以及将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离；
[0009]本发明中，采用免疫磁珠分选系统(Magnetic Cell Sorting, MACS)用于细胞分离，该技术的核心是在磁珠表面包被抗体，直接与靶细胞的相应抗原分子或间接与事先结合在靶细胞表面的抗体进行抗原抗体反应，在外加磁场中，结合了磁珠的细胞会与其他未被结合的细胞分离，当超强顺磁性的磁珠脱离磁场后会立即消失磁性，此时可提取或去除所标记的细胞，从而达到阳性或阴性分选的目的；所述MACS具有孵育时间短、操作过程快、不影响细胞在流式检测中 的散射特性与细胞的功能和活性等优点，而且，磁珠会在细胞培养的过程中生物降解，而无需再进行专门的去除。
[0010]本发明的分离纯化小胶质细胞的方法，包括如下步骤:
[0011]第一步，结合物理分离和酶的消化作用，将胶质瘤标本制成单细胞悬液，比单一方式能更多的获得保持细胞活性的细胞；
[0012]第二步，通过不同浓度Percoll溶液分离，富集小胶质细胞，并将其与髓磷脂及红细胞碎片等分开；
[0013]第三步，利用免疫磁珠分选CDllb阳性的细胞，提高小胶质细胞的分离纯度；
[0014]本发明方法中，采用流式细胞术检验每一步骤所得细胞的纯度，以活细胞中CDllb+细胞的比例表示小胶质细胞的纯度:其中第一步所得细胞中有30%的CDllb+的小胶质细胞，第二步所得细胞中有80%左右的CDllb+的小胶质细胞，第三步则收获纯度高达95%以上的⑶IIb+的小胶质细胞；
[0015]本发明方法中，还采用免疫荧光方法，定性直观地观察最后获得的细胞中小胶质细胞的另一经典标记Iba-1染色的情况，结果与流式细胞术的一致。
[0016]更具体的，本发明的一种分离纯化小胶质细胞的方法，其特征在于，其包括步骤:
[0017](I)将离体的新鲜脑胶质瘤组织用机械剪切结合酶消化的方法制成单细胞悬液，取少量细胞悬液用CDllb流式抗体检测小胶质细胞的纯度；
[0018](2)按优化后的方法配置不同密度Percoll分离液(70%和30%)；[0019](3)将制成的单细胞悬液离心后去上清，细胞用70%perCO114ml重悬成单细胞悬液，加入15ml的离心管,然后依序加入30%percoll液及HBSS层；500g, 30min, 4°C，低加减速度进行离心；取少量细胞悬液用CDllb流式抗体检测小胶质细胞的纯度；
[0020](4)吸取离心后的percoll70%和30%交界处细胞，加入PBSlOml, 1200rpm,室温，离心5分钟，去上清；
[0021](5)除了取少量细胞进行CDllb流式抗体检测小胶质细胞的纯度外，其余细胞继续后续的磁珠分选纯化操作；
[0022](6)用80iUMACS缓冲液重悬上述步骤所得细胞，加入包被抗人⑶Ilb抗体的免疫磁珠20iU，4°C放置15分钟，加入Iml MACS缓冲液重悬细胞，离心去除未结合的磁珠抗体，弃上清，重新用500 u IMACS缓冲液重悬细胞，500 U I/次缓冲液预洗MS磁性分选柱2次后，将500ii I细胞悬液过柱，500 ii I缓冲液洗柱两次，去除非标记阴性细胞，移柱出磁场，用ImlMACS缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞；再次用CDllb流式抗体检测小胶质细胞的纯度；
[0023](7)将上述步骤获得的小胶质细胞用含血清及GM-CSF的1640培养基培养，2-3天更换培养基I次。
[0024]本发明的方法中，所述离体的新鲜的脑胶质瘤组织须放置于冰上并于20小时之内处理；用量为每管取2-3g脑胶质瘤组织；所述的脑胶质瘤组织采用机械剪切联合木瓜酶消化进行处理；
[0025]本发明方法中，通过下述步骤制备不同浓度的Percoll溶液:
[0026]先用9份Percoll与1份HBSS混合达到生理性渗透压，然后用HBSS稀释到所需浓度；其中，涉及以下不同·浓度 70% (密度 1.090g/ml)、40% (1.056g/ml),30% (1.043g/ml)的Percoll溶液，优选采用70%与30%两个浓度不连续密度梯度Percoll层法进行富集小胶质细胞，本发明的实施例中，联合70%、40%、30%三个浓度分离，然后用流式细胞术分析相应分离界面的细胞比例，结果显示，30%与40%界面以及40%与70%界面⑶I Ib+小胶质细胞比例可达70%左右，红细胞多位于试管底部，细胞碎片和髓磷脂多位于30%与HBSS界面；用70%与30%两个浓度不连续密度梯度Percoll层法进行富集小胶质细胞，结果显示，30%与70%界面⑶Ilb+小胶质细胞比例可达80%左右；结果表明，本方法采用70%与30%两个浓度不连续密度梯度Percoll层法进行富集小胶质细胞，简化了配置多种Percoll溶液的繁琐操作，比目现有技术的percoll密度梯度法能更好的富集所需细胞。
[0027]本发明方法的步骤(2)中，配置2个不同密度Percoll分离液底部一层为70%Percoll 液 4ml，中间一层为 30%Percoll 液 8ml,最上一层为 2ml 的 HBSS ；
[0028]本发明所述方法的步骤(1)、(3)、(6)中，每管细胞数105个/lOOul，CDlIb-APC (eBioscience)及同型对照分别5ul/管，4°C孵育15分钟，PBS洗2遍后用流式细胞仪检测细胞中CDllb+小胶质细胞的比例；
[0029]本发明所述方法的步骤(7 )，在1640+10%FBS含血清培养基中添加50U/ml的GM-CSF细胞因子，制备成小胶质细胞培养基。
[0030]本发明进一步检测了获得的小胶质细胞的免疫表型及吞噬功能；
[0031]所述小胶质细胞用含10%胎牛血清的1640培养液培养3天后，细胞形态均一，与已知的小胶质细胞形态契合；利用流式细胞术检测了小胶质细胞表面的免疫分子HLA-DR、⑶40、⑶80、⑶86、B7-H1、B7-H4等的表达情况；通过对E.coli颗粒的吞噬功能实验，结果表明，小胶质细胞具有良好的吞噬功能。
[0032]本发明的胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞的方法，具有以下优点:
[0033](I)本发明结合了 Percoll密度梯度离心法和免疫磁珠分选法，可直接、快速地从新鲜胶质瘤标本中分离纯化小胶质细胞，无需昂贵的实验设备，且纯度较高，并保持原代小胶质细胞的生物学特性，为研究和应用脑胶质瘤中相关小胶质细胞的原代培养提供了一个有效方法；
[0034](2)本发明试验探讨了不同浓度Percoll溶液的分离效果，通过流式细胞术分析小胶质细胞的纯度，优化了筛选小胶质细胞的最佳不连续浓度梯度，简化了实验操作的同时，使小胶质细胞与红细胞、髓磷脂较为彻底地分开；
[0035](3)本发明以⑶Ilb为标记通过阳性免疫分选可获得表型均一的小胶质细胞，CDllb作为膜表面抗原在人小胶质细胞体外培养传代扩增过程中稳定表达,为研究该表面分子在小胶质细胞生物行为中的意义并进一步完善小胶质细胞特性的认识提供了平台。
[0036]本方法优化了现有分离方法，通过percoll梯度离心富集脑胶质瘤组织中的小胶质细胞，再通过磁珠进一步分选，从而保证了获得的小胶质细胞的高纯度；经优化的percoll密度梯度离心法富集小胶质细胞的纯度可达80%,比现有技术未优化的percoll密度梯度离心法提高了约10%左右，进一步用磁珠分选后纯度可达到95%以上，且免疫荧光和吞噬实验等证实其有良好的功能；本发明的方法具有操作简便易行、成本较低、质量稳定等优点，为进一步研究脑胶质瘤中小胶质细胞的免疫功能及在肿瘤的免疫逃逸中的作用研究奠定了基础。



[0037]图1为优化的Percoll密度梯度离心法结合⑶IIb磁珠分选出高纯度Microglia示意图。`
[0038]图2中，A为现有技术的密度梯度离心法收获小胶质细胞(HBSS/30%/40%/70%percolI) ；B为优化后的percoll密度梯度离心法(HBSS/30%/70%percoll)收获小胶质细胞。
[0039]图3为本发明优化后的Percoll密度梯度离心法与现有技术的Percoll密度梯度离心法获取细胞用流式检测小胶质细胞的纯度,其中，
[0040]A为APC同型对照；B为脑胶质瘤组织制成的单细胞悬液；C为目前文献报道常用的Percoll密度梯度离心法获得的细胞悬液；D为按优化后percoll密度梯度离心法收获的细胞悬液；E为CDllb磁珠分选收获的阳性分选细胞悬液。
[0041]图4中，A为小胶质细胞原代培养细胞(X 100倍)，B为细胞免疫荧光鉴定显示小胶质细胞呈Iabl (+)。
[0042]图5为I例低级别脑胶质瘤标本中用本发明优化方法提取的小胶质细胞免疫表型鉴定(流式检测)。
[0043]图6为小胶质细胞吞噬荧光微珠照片(X 400倍)。

[0045](I)处理胶质瘤标本:取新鲜的胶质瘤标本(手术切除20小时内)约2_3g，置于盛有5ml的1640培养液培养皿中，用剪刀将其剪碎，置入15ml离心管，1500rpm，离心5分钟，弃上清；加入木瓜蛋白酶(lmg/ml) 4-5ml,37°C消化30分钟,加血清终止消化，1500rpm,离心5分钟，弃上清，用IOml的1640培养基重悬，过40 iim滤网过滤于15ml离心管，得单细胞悬液，1500rpm离心5分钟,弃上清；
[0046](2) Percoll密度梯度离心法富集分离细胞:向上述15ml离心管中依次加入70%Percoll溶液4ml，30%Percoll溶液8ml，最后加入HBSS 2ml，500g，加减速度设为低速(slow),离心30分钟，用巴氏管从70%与30%Percoll溶液的界面吸取细胞，PBS重悬后1500r/分钟离心5分钟，弃上清；
[0047](3)免疫磁珠分选:用80 ill的MACS缓冲液重悬上步骤所得细胞，加入包被抗人⑶IIb抗体的免疫磁珠20 u 1，4°C放置15分钟，加入Iml的MACS缓冲液洗涤两次，离心去除未与细胞结合的磁珠抗体，弃上清，重新用500 u I的MACS缓冲液重悬细胞，500 U I的MACS缓冲液预洗MS磁性分选柱2次后，将500 u I细胞悬液过柱，500 U I的MACS缓冲液，去除非标记阴性细胞，移柱出磁场，用Iml的MACS缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞。
[0048]实施例2优化Percoll密度梯度离心法富集小胶质细胞
[0049]处理胶质瘤标本:取新鲜的胶质瘤标本(手术切除20小时内)，至于盛有5ml的1640培养液的培养皿中，用剪刀将其剪碎，加入木瓜蛋白酶，37°C消化30分钟，加血清终止消化，混匀后1500rpm，离心5分钟，弃上清，用20ml_30mll640培养液重悬，过40 y m滤网得
单细胞悬液，离心，弃上 清。
[0050]采用现有技术的Percoll密度梯度离心法富集小胶质细胞:用70%PerColl液4ml重悬细胞，加入15ml离心管中，然后依序加入40%、30%PercOll溶液各4ml，最后加入2mlHBSS, 500g离心30分钟；离心后，显示HBSS/30%Percoll界面为髓磷脂及细胞碎片层，细胞主要集中于30%/40%perCOll界面和40%/70%界面，红细胞碎片主要集中于试管底部；用巴氏管分别从30%/40%percoll界面和40%/70%界面吸取细胞，PBS重悬后1500rpm，离心5分钟，弃上清。流式细胞术分析:100iilPBS重悬上步所得细胞，加5iUAPC结合的抗人⑶Ilb抗体，4°C孵育30分钟，PBS洗两遍，300 u I多聚甲醛重悬细胞，上机检测，显示Percoll液30%与40%界面以及40%与70%界面⑶Ilb+小胶质细胞比例可达70%左右，红细胞多位于试管底部，细胞碎片和髓磷脂多位于30%与HBSS界面。
[0051]采用优化Percoll密度梯度离心法:采用70%与30%两个浓度不连续密度梯度Percoll层法进行富集小胶质细胞，在30%与70%界面⑶IIb+小胶质细胞比例可达80%左右，可简化操作，能较好的富集所需的细胞。
[0052]实施例2优化的Percoll密度梯度离心法联合磁珠分选分离新鲜胶质瘤标本中小胶质细胞
[0053]处理胶质瘤标本:取新鲜的胶质瘤标本(手术切除20小时内)，至于盛有5ml的1640培养基的培养皿中，用剪刀将其剪碎，加入木瓜蛋白酶(lmg/ml)，37°C消化30分钟，加血清终止消化，混匀后1500rpm离心5分钟，弃上清，用20_30ml的1640培养基重悬，过40 um滤网得单细胞悬液，离心，弃上清。
[0054]采用优化的Percoll密度梯度离心法富集小胶质细胞:向上述离心管中依次加入70%Percoll溶液4ml, 30%Percoll溶液8ml,最后加入2ml的HBSS, 500g离心30分钟，用巴氏管从70%与30%Percoll溶液的界面吸取细胞，PBS重悬后1500rpm/分钟离心5分钟，弃上清，取部分细胞用于流式检测CDllb+小胶质细胞纯度外，其余按常规后续步骤进行。
[0055]免疫磁珠分选:用80 ill的MACS缓冲液重悬上述步骤所得细胞，加入包被抗人CDllb抗体的免疫磁珠(购自Miltenyi biotec)20 u I，4°C放置15分钟，加入Iml的MACS缓冲液洗涤两次，1500rpm, 5分钟离心去除未结合的磁珠抗体，弃上清，重新用500 U I的MACS缓冲液重悬细胞，500 u I的MACS缓冲液预洗MS磁性分选柱2次后，将500 U I细胞悬液过柱，500iU的MACS缓冲液洗柱两次，去除非标记阴性细胞，移柱出磁场，用Iml的MACS缓冲液洗柱，收集洗液即为阳性细胞。
[0056]流式细胞术分析:100iil的PBS重悬上步骤所得细胞，加5 ill APC结合的抗人CDllb抗体(购自eBioscience)，4°C孵育15分钟，PBS洗两遍，300^1多聚甲醛重悬细胞，上机检测。结果显示，所获活细胞中⑶Ilb+小胶质细胞可达90%以上(其中，图3E所示为I例III级星形细胞瘤标本按上述方法获得后的流式检测结果)。
[0057]实施例3收获的小胶质细胞原代培养及免疫荧光鉴定
[0058](I)原代培养:将按本发明所述方法所获得的小胶质细胞接种于培养皿，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(含GM-CSF)、置于37°C、体积分数为5%C02培养箱培养，之后每隔3天换液I次；
[0059](2)细胞免疫荧光:12孔板中将CDllb+小胶质细胞爬片后，PBS洗3次，每次5分钟；用4%多聚甲醛固定30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；用l%Triton处理30分钟；PBS洗3次，每次5分钟;羊血清于37°C封闭20分钟JflAnti Ibal 一抗(0.5 u g/mL) (Wako CatalogN0.019-19741)，4°C过夜，PBS 洗 3 次，每次 5 分钟；加二抗 Alexa Fluor ? 594donkey antiRabbit IgG 37°C I小时，PBS洗3次，每次5分钟；晾干封片，Nikon荧光显微镜拍照。
[0060]实施例4分选获得的小胶质细胞免疫功能分析
[0061]免疫表型测定:取本发明获得的小胶质细胞细胞，以⑶lib、⑶40、HLA-DR、⑶80、⑶86、、B7-H1、B7-H4单克隆抗体为探针，用流式细胞术分析表面分子表达。
[0062]吞噬功能检测:取本发明获得的I X IO6小胶质细胞置于六孔板中培养，与荧光素标记的E.coli微珠充分混合，37°C孵育12h后，于镜下拍照，弃上清，PBS洗3_4遍，4%多聚甲醛固定10分钟，加入10 u g/ml的DAPI染色10分钟，PBS洗5分钟X 3次后，荧光显微镜拍照。