专利名称：一种番茄灰霉菌毒素的提取和纯化方法 灰霉病是番茄设施栽培的重要病害之一，常造成减产30-40%， 甚至绝产。番茄灰霉菌(.Botrytis cinereaPers)对寄主的破坏作用极其复杂,其中灰霉病菌产生的非寄主专化性毒素在病原菌的侵染过程中起作用，是主要致病因素之一，它可以造成叶片变色、细胞崩溃、促进病菌的侵染和扩展。毒素作为一个致病或致毒因子来源，可作为一个选择压，以杀死敏感细胞，选出抗病细胞，离体条件下筛选抗病突变体，解决番茄抗灰霉病材料缺乏的问题。对灰霉菌毒素的提取与纯化是进行毒素成分研究及利用主要致病毒素成分创制抗源材料的第一步。据文献报道，目前一般采用有机溶剂萃取的方法，并多用氯仿进行萃取，而氯仿由于毒性大、麻醉性强，不利于操作者的安全。
技术问题本发明的目的在于提供一种番茄灰霉菌毒素的提取和纯化方法，该方法不仅简单易行，容易操作，而且方便进一步的分析与纯化，并可以用于抗番茄灰霉病突变体技术的研究。技术方案为实现上述目的，本发明采取以下技术方案 (1)病原菌分离、纯化采集番茄病叶或病果，灭菌处理后，在叶片病健交接处剪取3mm的小块接入PSA平板内或用接种针接触果实霉层并在PSA平板上划线，分离培养l-2d后挑取单菌丝，接入PSA平板，纯化2-3次后，转接于PSA斜面培养基中，4°C保存， (2)病原菌活化灰霉菌株从斜面上培养基上接种于PSA平板，置于25°C左右环境中培养3天。(3)毒素提取用打孔器打取直径5mm的菌碟,接入Czapek-Dox培养液中，培养14d或21d后，过滤，减压浓缩，乙酸乙酯萃取，再进行减压浓缩，用旋转蒸发仪去除溶剂，所得棕褐色物质为粗毒素，用分析天平称毒素质量，按一定浓度加少量丙酮溶解，即获得毒素粗提液。(4)毒素纯化用毛细管将毒素粗提液点样于GF254薄层层析板上，以正己烷乙酸乙酯=(7:3)为展开剂，当展开剂前沿上升至距点样基线约13 cm处时，取出薄层板自然挥发晾干，放在紫外254nm下观察。收集相同Rf值的组分，用2_5ml的丙酮洗脱，离心，得到上清液。(5)生物测定采用离体叶片针刺法对上清液进行生物测定，5天后观察番茄叶片的变化。(6)保存对可在叶片上产生类似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作为层析纯毒素，4°C下保存备用。有益效果本发明不仅提取技术简单易行，成本低，周期短，而且提取涉及的仪器简单，从番茄灰霉病菌中提取的毒素可以用于抗番茄灰霉病突变体的诱导，进而获得抗灰霉病再生植株，为抗番爺灰霉病育种提供重要的基础材料。 (I)灰霉病菌分尚:
A =PSA培养基的配制
配方为马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,用蒸懼水定容至1000ml。B :病菌的分离
采集感染番爺灰霉菌iBotrytis cinerea )(张从宇，张巨全，胡能兵，张晓红.番爺灰霉病菌寄主范围及致病力分化研究，安徽技术师范学院学报，2003，17(3) :239 242。乔树华，蒋红云等.石榴皮萃取物对番茄灰霉病菌抑制作用及防病效果，植物保护，2010，,3(I) :148-150.)的发病初期、症状典型的番茄病叶(病斑自叶尖呈“V”字形向内扩展)或病果(果脐部呈灰白色并软腐，病部长有大量灰色霉层)装入自封袋中，每只自封袋装一片叶或一个果实，置于冰盒中。病叶用无菌水清洗2-3次，浸入I %次氯酸钠溶液中30s，取出后再浸入70%的乙醇溶液3-5min，然后再转入无菌水中漂洗3次，在病健交接处剪取大约边长为3mm的小块接入PSA平板内，每平板内接4_5块，并于25°C培养箱中培养；或用接种针接触果实霉层并在PSA平板上划线。(2)病原菌纯化、保存
在分离培养l-2d后挑取单菌丝进行纯化，将纯化2-3次后的病原菌，直接用于毒素的提取或转接于PSA斜面培养基中于4°C冰箱中保存。(3)病原菌活化
将于4°C冰箱中保存的灰霉菌株从斜面培养基上接种于PSA平板，置于25°C左右环境中培养3天。(4)毒素提取
A Czapek-Dox培养液的配制
其配方为葡萄糖 50. 0g，酵母浸出液 I. 0g, NaNO3 2. 0g, FeSO4 0. Olg, K2HPO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，用蒸馏水定容至 1000ml。B :毒素产生
在灰霉菌丝将要长满PSA平板时，使用打孔器沿菌落边缘依次打取直径5_的菌碟，将打好的菌碟接入Czapek-Dox培养液中，16菌片/500ml培养液，25°C条件下黑暗培养21d，每天振荡培养lh, 120r/min。C:减压浓缩
用双层纱布滤去菌丝，在50-60°C下进行减压浓缩。D :毒素提取
将浓缩后的滤液加等体积的有机溶剂乙酸乙酯于分液漏斗中，充分振荡10-15 min，静置15min，移去下层溶液，上层溶液重复萃取2-3次，收集下层溶液，进行减压浓缩，用旋转蒸发仪去除溶剂，得到棕褐色物质，用分析天平称质量，按lOOg/L的浓度加丙酮溶解，即获得毒素粗提液。(5)提取液薄层层析 A :薄层层析板的制作
按硅胶GF254 :羧甲基纤维素钠(CMC) :H2O=O. 4:0. 007:1的比例混合，先将CMC与H2O混合溶解均匀，再加入硅胶研磨，使之完全混匀。将配制好的浆料铺在干燥洁净的玻璃板(20cmX20cm)上,轻轻地左右摇晃,使其表面均勻平滑,厚度约1mm。涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干。晾干后，放在烘箱内加热活化。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持1050C -110°C活化 30min。
B:点样
在距薄层板一端I. 5cm处用铅笔轻轻划一起始线，用0. 5mm毛细管将毒素粗提液点的起始线上，待丙酮挥发后在起始线上重复点样2-3次，使点样原点直径为3mm。C:展开
待丙酮挥发后，将点好样品的薄层板放入内衬滤纸的展开槽中，展开槽内预先已放置由正己烷和乙酸乙酯组成的展开剂(正己烷乙酸乙酯=7:3)，展开剂浸没薄层板的一端约0. 5cm。薄层板与水平成45-60°角，盖好槽盖，让薄层板在密闭的展开槽中进行展开。当展开剂前沿上升至距点样基线约13 cm处时，取出层析板，立即用铅笔在展开剂上端前沿处划记号，置空气中晾干。D :显色
待板自然风干后，放在紫外254nm下观察。(6)提取物洗脱
各个样品间隔一定距离点在起始线上，每个样品在起始线上的点样点为原点。层析后计算各组分Rf值原点到组分斑点中心的距离(样品中含有多种组分，各组分的物理性质不同，使得在薄层板上迁移的距离不同，因此各组分就分离开来，量取的便是原点到各个组分的距离。)与原点到展开剂前沿的距离(13 cm)的比值。对具有相同Rf值的各组分连同吸附剂一起刮下，然后用2_5ml的丙酮将被分离的物质从吸附剂上洗脱下来，各洗脱液12 OOOrpm下离心lOmin，得到上清液；
(7)提取物生物测定
培养皿中先铺一张浸有无菌水的滤纸，取3-4叶期番茄植株叶片，75%酒精消毒后平铺到滤纸上，每皿放3片，用接种针轻轻刺破叶片，滴入20iU上清液，置于25°C光照培养箱中，3次重复，设同样浓度的丙酮溶液作为对照，5天后观察叶片的变化。(8)提取物保存
对可在叶片上产生类似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作为层析纯毒素，4°C下保存备用。


本发明涉及农业生物技术领域，具体讲是一种番茄灰霉菌毒素的提取和纯化方法。该方法经病原菌的分离纯化、毒素粗提液的制备、薄层层析技术、毒素的生物测定等步骤提取和纯化灰霉菌毒素。本发明的提取纯化技术简单易行，安全性高，成本低，可以用于抗番茄灰霉病突变体技术的研究。