专利名称：微生物发酵生产低温木聚糖酶的方法广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称(刘瑞田等，工业微生物，1998),包括内切3 -1,4-D-木聚糖酶(endo-3 -1,4_D_xyIanase) (EC3. 2. I. 8), P-D-木糖苷酶(3-D-xylosidases) (EC 3.2.1.37)，a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(a-L-arabinofuranosidases), a-D-葡萄糖醒酸苷酶(a-D-glucuronidases)(EC3. 2. 2. 39)。但通常所说的木聚糖酶仅限于内切0-1,4-D-木聚糖酶，是木聚糖降解酶系中最关键的酶(朱会芳等，菌物学报，2010)，其作用是降解木聚糖主链骨架。木聚糖酶作为生物酶制剂，已经广泛应用于造纸工业、食品饮料、饲料、功能性低聚糖的制备等行业中(江正强，中国食品学报，2005)。目前国内外对微生物发酵生产木聚糖酶的研究已比较深入，主要包括菌种筛选、诱导产酶、酶的分离纯化、酶学特性以及木聚糖酶基因的克隆与表达等研究(朱会芳等，应用与环境生物学报，2009)，但仅限于中、高温木聚糖酶，；而微生物发酵生产低温木聚糖酶的研究尚在起步阶段，其产业化、规模化生产及应用还未见报道。低温木聚糖酶与中、高温木聚糖酶相比具有更松散、柔顺的分子结构(陈秀兰等，中国农业科技导报，2007)，使其在自然条件下具有更高酶活及催化效率，从而提高底物利用率，降低能耗，缩短处理过程的时间；低温木聚糖酶对热反应敏感的特点，可以通过温和的热处理使其变性失活，从而控制酶水解程度，使产品品质不受影响。鉴于微生物发酵生产的低温木聚糖酶在降低生产成本及降低能耗方面的巨大优势，可从根本上摆脱中、高温酶的加热、冷却设备和工艺，这将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如饥饿、资源、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。因此，微生物发酵生产的低温木聚糖酶具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温木聚糖酶的方法，该发明主要是微生物经过低温驯化后，在10 16°C液体发酵生产低温木聚糖酶的方法，这种生产方法获得的低温木聚糖酶活性可以达到200U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。本发明所述的一种微生物发酵生产低温木聚糖酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生木聚糖酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的木聚糖酶产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温木聚糖酶结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。木聚糖酶产生菌(CGMCC编号I. 265或I. 518)先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温木聚糖酶，低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在-80°C条件下可以长期保藏。7.4 7. 6,121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og, NaCl 2. 5 8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸馏水 I. 0L, pH 自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自来水I. 0L, pH自然，121°C灭菌30min。④发酵产酶培养基麸皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. 0g，酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐温-800. 05 0. Ig,自来水 I. 0L, pH 自然，121。。高压蒸汽灭菌30min。(培养基添加3-4种成分)(2)将产生木聚糖酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的木聚糖酶产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3 5%的接种量接入10L的产酶培养基中，在10 12°C培养120 144h时，即微生物发酵生产低温木聚糖酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温木聚糖酶制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸馏水 I. 0L, pH 自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。 ③液体种子培养基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自来水I. 0L, pH自然，121°C灭菌30min。④发酵产酶培养基麸皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐温-800. 05 0. Ig,自来水 I. 0L, pH 自然，121。。高压蒸汽灭菌30min。(培养基添加3-4种成分)(2)将产生木聚糖酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的木聚糖酶产生菌在10 6°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5 7%的接种量接入50L的产酶培养基中，在12 14°C培养96 120h时，即微生物发酵生产低温木聚糖酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温木聚糖酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸馏水 I. 0L, pH 自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自来水I. 0L, pH自然，121°C灭菌30min。④发酵产酶培养基麸皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐温-800. 05 0. Ig,自来水 I. 0L, pH 自然，121。。高压蒸汽灭菌30min。(培养基添加3-4种成分)(2)将产生木聚糖酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的木聚糖酶产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7 9%的接种量接入100L的产酶培养基中，在14 16°C培养72 96h时，即微生物发酵生产低温木聚糖酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液； (7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温木聚糖酶制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产低温木聚糖酶的方法是将产生低温木聚糖酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的木聚糖酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温木聚糖酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。