专利名称：一种液体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法甘露聚糖酶(endo-1, 4_β -mannanase)是一种新型的酶制剂,属于一种半纤维素酶类，它除具有一般非淀粉多糖(NSP)酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外；近来很多研究表明，甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，它可促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的β_甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼柏尤其是豆柏的能量消化率。实际使用中还可看出，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。实践证明，甘露聚糖酶已超脱了传统酶制剂的作用，成为一种新型的促生长饲料添加剂。甘露聚糖酶可以分解玉米-豆柏型饲粮中的甘露聚糖为甘露寡糖。甘露寡糖作为一种生物化学益生素，可以改善肠道微生物组成，形成以双歧杆菌和乳酸菌为优势的肠道菌群。据报道，甘露寡糖可作为营养物质被双歧杆菌和乳酸杆菌选择性发酵利用，并促进其生长繁殖。但大肠杆菌、沙门氏菌等致病性菌却因无法利用而导致饥饿死亡。除此之外，甘露寡糖可与病原菌细胞壁上的受体结合，从而阻止细菌与动物肠黏膜上的糖基结合，保护肠黏膜结构和功能的完整，又由于甘露寡糖为非消化性物质，这种复合物就顺利通过胃肠道被排出体外，因而起到吸附肠道病原菌，对动物具有保健的作用。甘露寡糖不仅能连接到细菌上，而且能连接在毒素、病毒、真核生物上，结合后甘露寡糖可作为这些外源性抗原的助剂，缓解抗原的吸收，增强机体的细胞免疫和体液免疫。甘露寡糖不仅直接参与免疫调节而部分替代抗生素，在其与抗生素共用中，还能起到降低机体组织抗生素残留的作用。在饲料加工过程和动物采食后，酶制剂一般要经受高温高湿制粒的破坏，胃酸和胃蛋白酶的损害，能够到达动物体内作用位点依然存留活性的那部分酶活称为有效酶活。 这要求相应酶种具有良好耐热耐酸性能、抗胃蛋白酶、胰蛋白酶特性等等。良好的饲料酶有较宽的温度作用范围，保证既能在动物体温的温度下表现有较高的酶活，又能对饲料高温高湿制粒过程中表现出较好的耐受性；既能耐受胃酸的损害，在胃的酸性环境及小肠的中性环境下也能具有较高的酶活表现。近年来，甘露聚糖酶一般由毕赤酵母流加甲醇液体发酵后，板框过滤或碟片离心生产出一些较低品质的甘露聚糖酶。虽然也有报道甘露聚糖酶由黑曲霉固体发酵的研究， 但也未见其实际发酵生产及提取制造。本发明是由根霉固体发酵后，选用适合粗料分离的三足式离心机分离，生产出耐酸性耐高温的甘露聚糖酶。
本发明所要解决的技术问题是提供一种液体耐高温酸性甘露聚糖酶及其制作方法。本发明液体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法，其步骤包括浸泡按根霉固体发酵曲料水=I 8-16的重量比例投料，将曲料投入水中浸泡，浸泡用水pH调至4. 5，搅拌2-3小时，得混合液；离心将混合液置于离心机中在转速800-1200rpm的条件下离心10_15min ；过滤取离心后的上清液置于过滤机中，加入占上清液重量7-10%的硅藻土，过滤获得滤清液；超滤浓缩膜分子量10000，浓缩至滤清液体积的1/8-1/12 ；防腐稳定在浓缩液中加入防腐剂和稳定剂，其加入的重量比例是，浓缩液山梨醇 甘油:山梨酸钾=85 10 5 :0. 1，搅匀。以上所说的离心机采用三足式离心机；过滤机为板框过滤机。由上述方法制作液体耐高温酸性甘露聚糖酶也在本发明的保护范围之内。上述液体耐高温酸性甘露聚糖酶，其含甘露聚糖酶10000U / ml ο本发明的有益效果在于，和普通的由毕赤酵母流加甲醇液体发酵生产甘露聚糖酶等方法相比，无论是从耐酸性还是从耐热性方面来看，都明显的具有优势从耐酸性上看，本发明的甘露聚糖酶比AB MP1000耐酸性pHl. O,比和美酵素耐酸性 pH3. 5，比01毕赤酵母耐酸性pH2. 5，比BSA细菌耐酸性pHl. 5，比BSA米曲霉耐酸性pHl. 0， 比K毕赤酵母耐酸性pH2. 5 ；
从耐热性上看，本甘露聚糖酶比AB MP1000耐高温3-5°C，比和美酵素耐高温约13°C， 比01毕赤酵母耐高温约12°C，比BSA细菌耐高温30°C，比BSA米曲霉耐高温2 V，比K毕赤酵母耐高温约13°C。

浸泡按根霉固体发酵曲料与水按I :8的比例混合，浸泡水用乙酸调PH4. 5，搅拌3小
时；
离心在转速IOOOrpm的条件下在三足式离心机中离心IOmin,离心后取上清液；
板框过滤加入8%硅藻土，用板框过滤机过滤获得滤清液；
超滤浓缩膜分子量10000，浓缩至滤清液体积的1/9. 5 ；
防腐稳定按浓缩液山梨醇甘油山梨酸钾=85 10 5 :0. I的比例在浓缩液中加入稳定剂、防腐剂，搅勻。材料的来源
曲料由根霉固体发酵而成
本发明所用检测方法——酶活性检测方法具体检测方法如下
分光光度法甘露聚糖酶活力测定 A. I甘露聚糖酶活力测定
A. I. I定义在pH为5. 5，温度为37°C条件下，每分钟从浓度为3 mg/ml的甘露聚糖 (Sigma G0753)溶液中降解释放I μ mo I还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。A. I. 2试剂和溶液A. I. 2. I氢氧化钠溶液,浓度C (NaOH)为200 g/L
称取氢氧化钠20. O g,加水溶解,定容至100 ml οA. I. 2. 2 乙酸溶液，浓度 c (CH3COOH)为 O. I mol/L
吸取冰乙酸O. 60 ml，加水溶解，定容至100 ml。A. I. 2. 3 乙酸钠溶液，浓度 c (CH3COONa)为 O. I mol/L
称取三水乙酸钠I. 36 g，加水溶解，定容至100 ml。A. I. 2. 4 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c (CH3COOH — CH3COONa)为 O. I mol/L, pH 值
为 5. 5 :
称取三水乙酸钠23. 14 g，加入冰乙酸I. 70 ml。再加水溶解，定容至2000 ml。测定溶液的PH值。如果pH值偏离5. 5，再用乙酸溶液(A. 1.2. 2)或乙酸钠溶液(A. I. 2. 3)调节至 5. 5oA. I. 2. 5 甘露糖溶液，C (C6H12O6)为 10. Omg/ml
称取无水D-甘露糖I. OOOg,加水溶解，定容至IOOml。A. 1.2.6 0.6% (w/v)的甘露聚糖溶液
称取甘露聚糖(Sigma G0753)0.60g，加入80ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解(注在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。)。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4°C避光保存，有效期为3 天。A.1.2.7DNS 试剂
称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g (化学纯)，加水500 ml，搅拌5 S，水浴至45°C。然后逐步加入100 ml氢氧化钠溶液(A. 1.2. 1)，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48°C。)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91. O g、苯酚 2. 50 g和无水亚硫酸钠2. 50 g。继续45°C水浴加热，同时补加水300 ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。A. I. 3仪器、设备
A. I. 3. I实验室用样品粉碎机或碾钵。A. I. 3. 2 分样筛孔径为 O. 25 mm (60 目)。A. I. 3. 3 分析天平感量 O. 001 g。A. I. 3. 4 pH if :精确至 0. 01。A. I. 3. 5磁力搅拌器附加热功能。A. I. 3. 6电磁振荡器。A. I. 3. 7烧结玻璃过滤器孔径为O. 45 μ m。A. I. 3. 8 离心机:4000 r/min。A. I. 3. 9恒温水浴锅温度控制范围在30— 60°C之间，精度为O. 1°C。A. I. 3. 10秒表每小时误差不超过5s。A. I. 3. 11分光光度计能检测350— 800nm的吸光度范围。A. I. 4分析步骤A. I. 4. I标准曲线的制作
吸取缓冲液(A. I. 2. 4) 4. 0ml，加入DNS试剂5. 0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25. Oml，制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液(A.I. 2. 5) I. 00,2. 00,3. 00,4. 00,5. 00,6. 00 和 7. 00ml，分
别用缓冲液(A. I. 2. 4)定容至100ml，配制成浓度为O. 10—0. 70mg/ml D-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2. OOml (做二个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。A. I. 4. 2试样溶液的处理
固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛(孔径为O. 25 mm)，按照附录B中建议的称样量称取试样两份，精确至O. 001 g。加入50 ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液(A. 1.2.4)。磁力搅拌30 min，再用缓冲溶液(A. I. 2. 4)定容至100 ml，在4°C条件下避光保存24h。上离心机离心3 min。取O. 5ml上清液，再用缓冲溶液(A. I. 2. 4)做适当稀释。(稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在O. 04—0. 08 u/ml之间)。液体样品可以直接用缓冲溶液(A. I. 2. 4)进行稀释、定容。稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在O. 04—0. 08 u/ml之间)。A. I. 4. 3 测定步骤
吸取10. Oml甘露聚糖溶液(A. I. 2. 6)，37°C平衡lOmin。吸取10. Oml经过适当稀释的酶液,37°C平衡lOmin。吸取2. OOml经过适当稀释的酶液(已经过37°C平衡)，加入到刻度试管中，再加入 5mlDNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2. Oml甘露聚糖溶液(A. I. 2. 6)，37°C保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。吸取2. Oml经过适当稀释的酶液(已经过37°C平衡)，加入到刻度试管中，再加入 2. Oml甘露聚糖溶液(A. I. 2. 6)(已经过37°C平衡)，电磁振荡3s，37°C精确保温30min。加入5. OmlDNS试剂，电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。A. I. 5 计算
XD = [ (AE - AB) XK + CO] X 1000 /M/t (I)
X = XD · Df(2)
式中
XD —试样稀释液的甘露聚糖酶活力，U/ml ；
AE —酶反应液的吸光度；
AB —酶空白样的吸光度；
K 一标准曲线的斜率；
CO 一标准曲线的截距；M 一甘露糖的分子量(180. 2)；； t —酶解反应时间，min ；
1000 —转化因子，Immol = 1000 μ mol。XD值应在O. 04 — O. 08 U/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X 一试样中甘露聚糖酶的活力，U/g或U/ml ；
Df —试样的总稀释倍数。A. I. 6结果允许偏差
同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8. 0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)。本发明所使用的设备均为本行业常用设备，包括浸泡罐、三足式离心机、混液罐、 板框、清液罐、超滤器。pH 性质
配制A溶液0. 05mol/l的柠檬酸溶液，B溶液0. lmol/1的磷酸氢二钠溶液，将A. B两种溶液按一定比例混合，并以A或B调整pH至2. 5,3. 0,3. 5,4. O……8. 5的缓冲液。用蒸馏水配制底物溶液。准确称取酶样品I. Og于50ml容量瓶中，加入40ml蒸馏水，磁力搅拌30min，静置一段时间，用蒸馏水定容。再以不同PH的缓冲液作适当稀释，按照测定方法进行测定酶活。


本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种液体耐高温酸性甘露聚糖酶的制作方法。该方法包括下述的步骤浸泡根霉固体发酵曲料，再将混合液离心去渣后过滤，再将滤液超滤浓缩，得浓缩液，在浓缩液中加入防腐剂和稳定剂，制得液体甘露聚糖酶。本发明的有益效果在于，和普通的由毕赤酵母流加甲醇液体发酵生产甘露聚糖酶等方法相比，无论是从耐酸性还是从耐热性方面来看，本发明的方法生产的甘露聚糖酶其耐酸性强，耐热性高。