专利名称：赖氨酸、木聚糖酶的发酵及包被的制作方法木聚糖酶能够有效降解含木质素的物质(如，饲料)，因此在饲料中添加木聚糖酶能够增强饲料的吸收利用率，从而节约饲养成本。例如，中国专利96196760. 9公开了反刍动物饲料的酶添加物，其包含木聚糖酶。L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以 作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。然而，当赖氨酸作为饲料的时候，由于其属于小分子营养物质，很快就能释放到动物体内，尤其在大量摄取时，影响了动物吸收利用的效率。通常解决的方法是少量多次地喂食动物，但是这将增加动物饲养的工作量。因此，本发明提出了直接用赖氨酸发酵培养液制备包被的赖氨酸制品的方法，可以有效减缓赖氨酸在动物体内释放的速度。按照常规的思路，包被的赖氨酸制品可以和含木聚糖酶的酶添加剂在喂饲时一起混合入动物饲料中。这样使用中比较麻烦，而且容易混合不均匀，相应利用率低。本发明人设想，在制备包被的赖氨酸制品的过程中将木聚糖酶和/或纤维素酶与赖氨酸发酵培养液直接混合，可以混合地很均匀，然后进行包被，然而却发现受制于包被中要经历的高温以及干燥过程，常规的酶活性将极大地削弱，甚至完全丧失。令人意外地，本发明人发现了一株耐热且耐旱的霉菌菌株，经过艰苦深入细致的研究，其中分离的木聚糖酶经历高温干燥后仍旧能够保持高木聚糖酶活性，因此适于在其中方便地使用，减少了喂饲时使用的麻烦。
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵制备L-赖氨酸制品的方法，其包括发酵产生L-赖氨酸发酵液，该发酵液可以与可发酵获得的耐高温脱水的木聚糖酶混合，高温干燥后用脂肪包被。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品以及其中所用的物质等。具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵制备L-赖氨酸制品的方法，包括，发酵产生L-赖氨酸发酵液，该发酵液可以与耐高温脱水的木聚糖酶混合，经高温干燥后收集的颗粒用脂肪包被。因此，本发明第一方面的方法发酵制备的L-赖氨酸制品分两层，外层包裹内层，其中外层是脂肪，而内层含有L-赖氨酸和耐高温脱水的木聚糖酶。该L-赖氨酸制品能够减缓赖氨酸在动物体内释放的速度，而且能够具有木聚糖酶活性。该制品优选是饲料添加剂。更具体地，在第一方面，本发明提供了发酵制备L-赖氨酸制品的方法，其包括(I)在发酵条件下培养导入了编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸的产L-赖氨酸的菌，获得发酵液，过滤后保留滤液；(2)在发酵条件下培养导入了编码耐高温脱水的木聚糖酶的多核苷酸的分泌表达菌，过滤后保留上清液；(3)混合步骤⑴获得的滤液和步骤(2)获得的上清液，得到混合液；(4)对步骤(3)获得的混合液高温喷雾干燥，并任选进行筛分和/或破碎，收集颗粒；和(5)将步骤(4)收集的颗粒用脂肪包被。脂肪包被颗粒可以通过流化制粒包衣机将熔化的脂肪喷涂在颗粒表面上来实现，因此优选脂肪是室温状态下为固态而熔点略高于室温(如，45-80°C，优选50-65°C ) 的脂肪。优选在本发明第一方面的方法中，脂肪优选是分馏棕榈脂肪，更优选是百佳能(BergaFat)，其可以通过商业途径方便地获取。在本发明的中，包被所用的脂肪是百佳能HTL316。本发明人发现，脂肪层包被(喷涂)得越厚，制备得到的L-赖氨酸制品的抗降解能力越强。优选在本发明第一方面的方法中，在步骤(5)中，步骤(4)获得的颗粒和脂肪的重量比为2 8 8 2，优选为3 7 7 3，更优选为5 6. 5 5 3. 5。在步骤(4)中，对于其中干燥得到的粒径分布不均匀，可以进行筛分，收集一定粒径范围的颗粒；和/或对于干燥和/或筛分得到的粒径较大的颗粒，可以进行粉碎，然后继续进行筛分，收集一定粒径范围的颗粒。优选在本发明第一方面的方法中，收集的颗粒的粒径小于O. 8mm,优选小于O. 5mm。大于O. 5mm的颗粒。另外优选在本发明第一方面的方法中，高温喷雾干燥可以在流化床干燥机内进行。为了使最终颗粒的形状更为均匀，流化床干燥机内尾气温度不宜过高，通常不高于100°〇，优选不高于851，更优选保持在80±31。因此，优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)中，高温为60-100°C，优选为65-90°C，更优选为 75-85 °C。赖氨酸作为小分子化合物，高温脱水干燥对其不会产生过多不利影响；而木聚糖酶作为大分子蛋白质，经高温和/或脱水，有可能使其降解和/或变性，从而导致其酶活性的显著降低或丧失，无法起到相应作用。因此本发明可以采用了耐高温脱水的木聚糖酶，其中高温为60-100°C，优选为65-90°C，更优选为75-85°C。优选在作为饲料添加剂使用时，由于木聚糖酶的需要量少于赖氨酸的，因此本发明第一方面的方法发酵制备的L-赖氨酸制品中优选赖氨酸含量高，而同时木聚糖酶含量低，可以低至满足饲料所需木聚糖酶的活性。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(I)获得的滤液和步骤(2)获得的上清液的体积比为10 O. 01-10，优选为10 O. 05-5，更优选为 10 O. I I。多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入菌中，使该菌表达所述多核苷酸编码的酶，如吡啶核苷酸转氢酶和/或木聚糖酶。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明第一方面的方法中，编码酶的多核苷酸可以利用穿梭质粒导入菌中，如编码吡啶核苷酸转氢酶的多核苷酸可以利用大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒导入产L-赖氨酸的菌(如棒状杆菌)中，又如编码木聚糖酶的多核苷酸可以利用大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒导入分泌表达菌(如毕氏酵母)中。L-赖氨酸的发酵有许多现有技术可供本领域技术人员选择，例如可以利用野生型吡啶核苷酸转氢酶或其变体。野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，其包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov)蛋白和基因登录号NP416120. I和AAC74674. I所示。优选的变体可以是中国专利201110065683. 5所公开的吡啶核苷酸转氢酶变体，在实际生产中增加了赖氨酸的产量(也可参见中国专利201110151495. 4)，其包括α亚基变体和β亚基变体，其中α亚基变体相对于野生型α亚基在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换是M102L、L127R和Q322K ； β亚基变体相对于野生型β亚基在Α398或D400的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换是A398S和D400H。在本发明的中，采用吡啶核苷酸转氢酶变体，其是由如SEQ ID No :5所示的核苷酸序列编码的。本发明第一方面的方法中，耐高温脱水的木聚糖酶优选是本发明人令人意外地发 现的菌株产生的木聚糖酶，该木聚糖酶与现有已知的木聚糖酶同源性很低，而且具有耐高温脱水的优势，经证实即使被高温蒸发干燥后，仍旧能保留80%以上的酶活性，从而使得本发明第一方面的方法能够得以顺利实施。优选本发明第一方面的方法中，耐高温脱水的木聚糖酶的氨基酸序列(I)如 SEQ ID No 2 所示；或(2)是对SEQ ID No : 2缺失、添加和/或取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No :2活性的序列。本领域技术人员通过重组DNA技术，能够制备出经缺失、添加和/或取代氨基酸残基而获得的变体蛋白。在本发明的中，木聚糖酶是由如SEQ ID No :1所示的核苷酸序列编码的。在步骤(2)中，过滤除去菌体而保留上清液，其中优选使用O. 22μπι滤膜进行过滤。上清液可以提纯和/或浓缩，也可以直接用于本发明第一方面的方法中，优选是后者。优选本发明第一方面的方法中，在步骤(2)中，上清液的木糖酶酶活性不小于1000IU/L，优选不小于5000IU/L，更优选不小于10000IU/L，例如不小于15000IU/L。本发明的耐高温脱水的木聚糖酶经高温脱水干燥，仍旧能基本保留原酶活性。优选的步骤(2)中的在发酵条件下培养的方法包括(i)将分泌表达耐高温脱水的木聚糖酶的菌(如，酵母菌)接入液体培养基中，于28-33 °C 培养至 0D600 达到 3. 0-8. O ；(ii)将步骤⑴获得的培养液以3-7% (体积)的接种量接种于液体培养基中，于28-33 °C培养20-28小时；(iii)将甲醇以O. 3-0. 7% (体积)的接入量加入步骤(ii)获得的培养液中，诱导培养6-12天，期间每24小时补加O. 3-0. 7% (体积)接入量的甲醇，通气控制溶氧大于20%，并控制 pH 为 5. 8-6.4。在本文中，接种量或接入量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液(接入的菌液)或接入的其他液体体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。其中，液体培养基是能使分泌表达耐高温脱水的木聚糖酶的菌(如，酵母菌)生长的液体培养剂。步骤(i)和步骤(ii)中的液体培养基可以是相同的，也可以使不同，优选是相同的，如可以是BMGY液体培养基，其配方为IOOmM磷酸钾缓冲液(pH6. O)中，含1% (重量)酵母提取物、2% (重量)蛋白胨，酵母含氮碱基I. 34% (重量)，生物素4*10_5% (重量)，葡萄糖2% (重量)，甘油1% (体积)。在步骤(I)中，过滤除去菌体而保留滤液，其中优选使用超滤膜进行过滤。滤液可以提纯和/或浓缩，也可以直接用于本发明第一方面的方法中，优选是后者。优选本发明第一方面的方法中，在步骤(I)中，滤液中L-赖氨酸的含量高于50g/L，优选高于70g/L，更优选高于90g/L。这可以利用许多现有技术来实现，包括菌种的改良和/或发酵流程的改良。示例性的步骤(I)中的在发酵条件下培养的方法包括(a)将产L-赖氨酸的菌接入第一发酵罐于31_38°C培养10-20小时；(b)将步骤(a)获得的培养液以3-7% (体积)的接种量接种于第二发酵罐，于36-40°C培养3-8小时；(C)向第二发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量m O. 2-0. 35% (重量)，进行 10-18 小时;(d)向第二发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的O. 3-0.5% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的O. 1-0. 25% (重量)，进行30-65小时，优选50-55小时。 在本文中，“第一”和“第二”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，SP第一发酵罐和第二发酵罐是不同的。其中，优选第一发酵罐中的培养基配方为每18立方米培养基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-600公斤，KH2PO430-80 公斤，MgSO4 · 7H20 3-15 公斤，FeSO4 · 7Η200· 1-1 公斤，MnSO4 · 7Η20 O. 1-1 公斤，生物素5-30克，和叶酸3-10克，和/或，优选第二发酵罐的培养基配方为每315立方米培养基中含，葡萄糖10000-15000公斤，甘蔗糖蜜50-3000公斤，玉米浆10000-15000公斤，KH2PO4700-1200 公斤，MgSO4 · 7Η20 5-220 公斤，FeSO4 · 7Η20 5-25 公斤，MnSO4 · 7Η20 5-220 公斤，生物素150-300克，和叶酸50-120克。步骤(c)和(d)的部分培养条件(如，温度，pH等)与步骤(b)的可以相同，也可以不同。步骤(b)中，不进行流加操作；而在步骤(c)和(d)中，pH维持在6.5至7.8之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质(如，培养液)的重量的百分比量。优选步骤(C)和(d)中的糖是葡萄糖。在步骤(C)中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的O. 2-0. 35% (重量)，优选为O. 27-0. 33% (重量)。在步骤(d)中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的O. 3-0. 5% (重量)，优选为O. 42-0. 48% (重量)O优选步骤(d)中的氮源是无机氮源，优选是硫酸氨或氯化铵，如硫酸氨。在步骤(d)中，硫酸氨的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的O. 1-0. 25% (重量)，优选为O. 17-0. 23% (重量)。
在第二方面，本发明提供了 L-赖氨酸制品(如，饲料添加剂)，其包括用脂肪包裹的颗粒，其中颗粒包含L-赖氨酸和耐高温脱水的木聚糖酶，优选耐高温脱水的木聚糖酶是本发明人令人意外地发现的菌株产生的木聚糖酶。优选在本发明第二方面的制品是由本发明第一方面的方法发酵制备的。在第三方面，本发明提供了耐高温脱水的木聚糖酶或其编码基因、其载体、菌种。具体而言，本发明在第I方面提供了耐高温脱水的木聚糖酶，其氨基酸序列(I)如 SEQ ID No 2 所示；或(2)是对SEQ ID No : 2缺失、添加和/或取代一个或几个(优选不超过7个，更优选不超过5个，如不超过3个)氨基酸残基而获得的保留SEQ ID No :2活性的序列。 在第II方面提供了编码第I方面的木聚糖酶的基因，优选其核苷酸序列如SEQ IDNo 1所示。在第III方面提供了包含第II方面的基因的载体。在第IV方面提供了菌种，尤其是分泌表达菌(如，酵母)，其包含第II方面的基因，或用第III方面的载体转化或者转染。在第V方面提供了发酵生产木聚糖酶的方法，其包括在发酵条件下培养第IV方面的菌种，从培养物中分离出第I方面的木聚糖酶。在第VI方面提供了第I方面的木聚糖酶在制备饲料或饲料添加剂中的用途。本发明具有以下有益效果本发明的制品安全可靠，可有效降低动物体内赖氨酸的释放速度，具有木聚糖酶活性，可以进一步提高饲料的利用率；本发明的木聚糖酶具有耐高温脱水的优势。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复而明确记载过一样。

1- 损失率损失率
~2. 38*104IU/LCA5.21*103IU/g
~2.20*104IU/L 6.8%CB5.05*103IU/g 3. 1%
~C1.96*104IU/L 17.6%CC0.87*103IU/g 83. 3%实施例3L_赖氨酸的发酵生产如中国专利201110065683. 5所述，将吡啶核苷酸转氢酶变体基因(其核苷酸序列如序列表的SEQ ID No:5所示)按常规方法克隆到大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pMS2(可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 67189)EcoR I和Xba I内切酶位点之间，电转化入L-赖氨酸发酵的棒状杆菌工程菌(可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 31269)中，得到棒状杆菌工程菌。将该棒状杆菌工程菌以O. 5%的接种量接入20立方米发酵罐(其中的培养基配方为葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，KH2PO4 45公斤，MgSO4 · 7H20 7公斤，FeSO4 · 7H20 O. 5公斤，MnSO4 · 7H20 O. 5公斤，生物素12克，和叶酸5克，用水定容至18立方米)，于35°C饱和通气培养15小时，提高菌体密度。然后，将20立方米发酵罐的培养液直接注入350立方米发酵罐(其中的培养基配方为葡萄糖12000公斤，甘蔗糖蜜1000公斤，玉米浆12000公斤，KH2PO4IOOO公斤，MgSO4 · 7H20 100 公斤，FeSO4 · 7H20 12 公斤，MnSO4 · 7H20 120 公斤，生物素 200 克，和叶酸85克，用水定容至315立方米)，于38°C饱和通气培养5小时。然后，每小时流加1000公斤葡萄糖，持续15小时，期间排出蒸汽以保持体积；之后，每小时流加1500公斤葡萄糖和650公斤硫酸铵，持续发酵50小时，期间排出蒸汽以保持体积。流加期间，加入NaOH和浓盐酸使PH维持在6. 5至7. 8之间，即低于低限时加碱，高于高限时加酸。发酵完毕，薄层层析检测其中产L-赖氨酸97g/L，达到工业应用的标准。实施例4L-赖氨酸饲料的包被将实施例3制备的发酵液通过Suntar-III型超滤膜(可购自三达膜科技有限公司)进行膜分离，滤除固体不溶物。然后，将滤液与实施例2发酵得到的木聚糖酶上清液以10 O. 5的体积比混合，直接以雾状喷入流化床干燥机内并保持尾气温度在80±3°C不变，收集出料的颗粒。对出料的颗粒进行筛分，对于粒径大于等于O. 5mm的颗粒送入破碎机破碎，然后将破碎后的颗粒与筛分得到的粒径小于O. 5mm的颗粒混合并再次喷入流化床干燥机内并保持尾气温度在80±3°C不变，收集出料的颗粒并筛分出粒径小于O. 5mm的颗粒，即为具有木聚糖酶活性的L-赖氨酸饲料颗粒剂。粒径大于O. 5mm的颗粒再次破碎后，与下一批次的滤液干燥得到的出料的颗粒混合。取370克百佳能(BergaFat)HTL316(可购自广西南宁市汇新高畜牧有限公司)于60°C烘箱中熔化，然后用流化制粒包衣机将其全部均匀喷涂到630克上述制备的L-赖氨酸饲料颗粒的表面上形成包被层，即得包被的具有木聚糖酶活性的L-赖氨酸饲料添加剂。实施例5包被的具有木聚糖酶活性的L-赖氨酸饲料添加剂的降解测试根据赵鹤等(不同比例羊草与青贮饲料在奶牛瘤胃内干物质降解率的研究.中国牛业科学，34(2) 13-16)描述的体内尼龙袋法，在成年奶牛中对实施例4制备的包被的饲料添加剂(以未包被的具有木聚糖酶活性的L-赖氨酸饲料颗粒剂为对照)进行降解测试，以其中L-赖氨酸作为测定指标。对照在2小时后降解率达95%以上(即L-赖氨酸保持率不足5% )，而包被的饲料添加剂的保持率如下表所示


本发明提供了发酵制备L-赖氨酸制品的方法，其包括发酵产生L-赖氨酸发酵液，可以与可发酵获得的耐高温脱水的木聚糖酶混合，高温干燥后用脂肪包被。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品以及耐高温脱水的木聚糖酶等。