专利名称：纤维素酶的制备方法纤维素酶是专用于分解纤维素的酶，其为ー类可以将纤维素分解成多糖或单糖的蛋白质或RNA。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。它不是单ー酶，而是一种多组分的复合酶系，现已确定纤维素酶含有三种主要组分(1)内切型-P-葡聚糖酶它能以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割，对末端键的敏感性比间键小；主要产物是纤维糊精、纤维ニ糖和纤维三糖。(2)外切型-P-葡聚糖酶它能从纤维素链的非还原性末端切割，生成可溶的纤维糊精和纤维ニ糖。纤维ニ糖酶它能水解纤维ニ糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维ニ糖和纤维三 糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。这种酶的专ー性比较差。纤维素酶的体系较为复杂，其每一个组分通常又由若干亚组分组成，近年来发现纤维素酶复合体系中还存在着破坏纤维素晶体结构的“氢键酶”，在将天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠多种组分的协同作用才能完成。纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶(amylase)、蛋白酶(Protease)等。纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料エ业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。但是，产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。
本发明的目的在于提供ー种纤维素酶的制备方法，该方法操作简单，适用于エ业化生产。上述技术目的是通过如下技术方案实现的纤维素酶的制备方法，具体包括以下步骤在温度为20_35°C、pH为4. 0-5. O的条件下，用里氏木霉作为宿主细胞分泌纤维素酶，其中，以烟草废弃物作为碳源，豆饼粉为氮源，培养时间为6-10小时，通气量O. 2-0. 6vvm，搅拌速度为200-500转/分钟。其中，所述烟草废弃物以纤维素的含量计其浓度为20_30g/L，所述豆饼粉的质量相当于烟草废弃物的O. 2-0.6。优选为，所述温度为32 °C。所述进一歩优选为pH为4. 5。其中，所述烟草废弃物以纤维素的含量计其浓度为25g/L，所述豆饼粉的质量相当于烟草废弃物的O. 4。所述通气量优选为O. 4vvm。本发明的有益效果在干I)本发明均采用废弃物作为培养基原料，绿色环保，其中，以烟草废弃物中富含的纤维素为碳源，以压制完菜油的都粉饼为氮源，显著降低了生产成本。2)本发明制备的纤维素酶，其酶活力高，エ艺简単。 I菌种及保藏纤维素酶生产采用里氏木霉的优良变异株，为实验室保藏菌种，最初来自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultULreCollection) ATCC56764菌株。将菌种由真空冷冻干燥管中取出，移至斜面培养基上，在30°C下恒温培养7天，待孢子成熟后，置于4°C冰箱中保存备用。2原材料以烟草废弃物为碳源取IOOg粒径为20目的烟草废渣，加入相当于烟草的质量10倍的水，在100°C条件下进行溶解反应30分钟，得反应液，将所述反应液进行固液分离，取液体，所述液体为纤维素溶液；在所得纤维素溶液中加入体积相当于纤维素溶液I倍的去离子水，搅拌30分钟后进行过滤，所得滤渣为碳源。氮源豆饼粉，即黄豆搾油エ艺中的剰余物。3发酵过程250mL三角瓶中装液50mL，取2mL里氏木霉抱子悬浮液(其含有105个分生孢子/mL)移入种子培养基中，在30°C、pH4. 8、180r/min条件下振荡培养2d，使菌丝量(干重)达8g/L,制成液体菌种。种子培养的配制具体为葡萄糖IOg,蛋白陈lg,Mandels营养盐浓缩液100mL，Mandels微量元素浓缩液lmL，頂柠檬酸缓冲液50mL，H2OlOOOmL,混匀后于121°C灭菌20min。500mL三角瓶中装液IOOmL,将液体菌种按10% (v/v)的接种量转移到液体产酶培养基中，所述培养基中含有所述碳源和氮源详见表1，在适当的温度和pH值及搅拌速度下(详见表I)振荡培养，培养时间为6-10小时(详见表I)，通气量为O. 2-0. 6vvm(详见表I)。培养过程中定时取样，測定发酵液中的纤维素酶活力。4滤纸酶活力的检测滤纸酶活力(FPA)按照国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法測定，以国际单位IU表不。在试管中放入1x6cm(约50mg)的WhatlnanNo. I滤纸一条,加入O. 5mL适当稀释的纤维素酶溶液和ImL柠檬酸缓冲液(O. 05M、pH4. 8)，将滤纸条充分浸没，于50°C下保温30分钟。空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变。反应结束后用DNS法測定所得的还原糖含量。ー个滤纸酶活力国际单位(FPIU)等于酶促反应中姆分钟生成LOymol葡萄糖(以还原糖表示)的酶量。则有

本发明涉及一种生物发酵方法，特别涉及纤维素酶的发酵方法，纤维素酶的制备方法，具体包括以下步骤在温度为20-35℃、pH为4.0-5.0的条件下，用里氏木霉作为宿主细胞分泌纤维素酶，其中，以烟草废弃物作为碳源，豆饼粉为氮源，培养时间为6-10小时，通气量0.2-0.6vvm，搅拌速度为200-500转/分钟；本发明均采用废弃物作为培养基原料，绿色环保，其中，以烟草废弃物中富含的纤维素为碳源，以压制完菜油的都粉饼为氮源，显著降低了生产成本；本发明制备的纤维素酶，其酶活力高，工艺简单。