专利名称：一种优化改良的中性纤维素酶meg1及其基因和应用的制作方法纤维素酶系由三类功能不同但又互补的酶组成。这三类酶分别是内切葡聚糖酶 (EG, Cx酶)，可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解β -1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素。内切型纤维素酶可为外切酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的纤维素寡糖。外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH，Cl酶)。这类酶作用于纤维素分子的末端，依次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区。葡萄糖苷酶(纤维二糖酶，BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖，也可以从短链葡聚糖的非还原端切下葡萄糖。好氧的丝状真菌，如常见的木霉、曲霉、青霉等能大量合成纤维素酶并分泌到胞外，各种纤维素酶组分独立存在，为非复合酶系。纤维素酶最早应用于动物饲料生产，随后是食品行业，紧接着这些酶制剂应用到纺织、洗涤剂和制浆造纸工业；之后，酶制剂的应用急剧增加，尤其是在纺织、食品、酿造和制浆造纸工业。丝状真菌所产纤维素酶大多适应酸性环境，在中性或中性偏碱性条件下酶活力丧失。随着纺织、造纸、洗涤工业的进一步发展，酸性纤维素酶的酶学性质已满足不了实际生产的需求。例如，在纺织品整理方面，中性纤维素酶与酸性纤维素酶相比，其处理效果独特，具有如下优点1、高反差外观中性纤维素酶能让织物具有反差大和背着色低的外观，蓝、白色的对比非常强，简化了或省略了清洁工序。2、中性纤维素酶不会使处理后的服装产生严重的背面沾污，具有抗返染，次品率低，产品质量均勻、手感好等特点。3、操作简单，操作人员只需对PH值进行少量控制便可获得稳定的磨蚀效果。此外，在洗涤及造纸工业中，中性或者中性偏碱的环境不利于酸性纤维素酶发挥其水解作用，从而造成资源的浪费和环境的污染。中性纤维素酶则能很好解决这些问题。然而，来源于细菌的中性纤维素酶的产酶量和比活性都较低，这限制了其在生产中的实际应用。丝状真菌来源的纤维素酶具有活性高，稳定性好的特点，因此可以尝试通过基因工程的对来源于丝状真菌的酸性纤维素酶进行改造，以提高其在中性或者中性偏碱性环境下的活性。里氏木霉(Trichoderma reesei)是在研究和生产中应用最广泛的菌株，它所产的纤维素酶系至少包含2个外切酶(CBH I,CBH II)，5个内切酶(EG I，EG II，EG III,EGIV, EG V)和2个β-葡萄糖苷酶(BGL I，BGL II)。在里氏木霉内切葡聚糖酶中，EG I的含量最大，可占纤维素酶组分总量的5-10%，在内切酶的作用过程中起重要作用。编码EG I的基因序列已经被克隆，其cDNA全长为1380bp，编码459个氨基酸残基的蛋白。EG I发挥作用的最适PH值为5. 5，在中性环境下酶活急剧下降。因此，通过基因改造既可以使其最适 PH值向中性或者弱碱性偏移，同时也能保持其较高的比活力，在纺织、洗涤、造纸、饲料等领域有较好的应用前景。
本发明的目的是提供一种优化改良的中性纤维素酶MEGl。本发明的另-一目的是提供编码上述优化改良的中性纤维素酶的基因MEG1。本发明的另-一目的是提供包含上述优化改良的中性纤维素酶基因的重组载体。本发明的另-一目的是提供包含上述优化改良的中性纤维素酶基因的重组菌株。本发明的另-一目的是提供制备上述优化改良的中性纤维素酶的方法。本发明的另-一目的是提供上述优化改良的中性纤维素酶的应用。
里氏木霉天然EGl的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示
MAPSVTLPLTTAILAIARLVAAQQPGTSTPEVHPKLTTYKCTKSGGCVAQ
DTSVVLDffNY60
RWMHDANYNSCTVNGGVNTTLCPDEATCGKNCFIEGVDYAASGVTTSGSS
LTMNQYMPSS120
SGGYSSVSPRLYLLDSDGEYVMLKLNGQELSFDVDLSALPCGENGSLYLS
QMDENGGANQ180
YNTAGANYGSGYCDAQCPVQTffRNGTLNTSHQGFCCNEMD
ILEGNSRANALTPHSCTATA240
CDSAGCGFS￡YGSGYKSYYGPGDTVDTSKTFTIITQFNTDNGSPSGNLVS
ITRKYQQNGV300
DVPSAQPGGDTISSCPSASAYGGLATMGKALSSGMVLVFSIffNDNSQYMN
WLDSGNAGPC360
SSTEGNPSNILANNPNTHVVFSNIRffGDIGSTTNSTAPPPPPASSTTFST
TRRSSTTSSS420
PSCTQTHWGQCGGIGYSGCKTCTSGTTCQYSNDYYSQCL459
本发明优选采用易错PCR随机突变及突变重组的方法对SEQ ID NO. 1所示的里氏
木霉来源的EGl进行改造，并经过高通量突变筛选的方法筛选得到中性纤维素酶MEG 1，本发明的MEGl和原有里氏木霉来源的EGl相比，有13个氨基酸的差异，其氨基酸序列中8位的P突变成A，55位的V突变成I，95位的E突变成Q，119位的S突变成R，152位的F突变成I，179位的N突变成H，214位的F突变成I，250位的P突变成A，285位的S突变成T， 308位的G突变成R，345位的N突变成H，427位的H突变成N，454位的Y突变成D，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示MAPSVTLALT TAILAIARLVAAQQPGTSTPEVHPKLTTYKCTKSGGCVAQ
DTSVILDffNY60
RWMHDANYNS CTVNGGVNTTLCPDEATCGKNCFIQGVDYAASGVTTSGSS
LTMNQYMPRS120
SGGYSSVSPR LYLLDSDGEYVMLKLNGQELSIDVDLSALPCGENGSLYLS
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ITRKYQQNGV300DVPSAQPRGD TISSCPSASAYGGLATMGKA LSSGMVLVFS IffNDHSQYMNWLDSGNAGPC360SSTEGNPSNI LTNNPNTHVV FSNIRffGDIG STTNSTAPPP PPASSTTFSTTRRSSTTSSS420PSCTQTNWGQ CGGIGYSGCK TCTSGTTCQY SNDDYSQCL459该纤维素酶MEGl在作用pH值方面更加优良，在pH值为7. 0时酶活最高。未改良的EGl在pH值为7. 0的环境下酶活较低，说明本发明的经过改良的MEGl达到了工业化生产的中性PH要求。本发明还提供了上述优化改良中性纤维素酶基因序列MEG1，其碱基序列如SEQID NO. 4所示atggcgccctcagttacactggcgttgaccacggccatcctggccattgcccggctcgtc60
gccgcccagcaaccgggtaccagcacccccgaggtccatcccaagttgacaacctacaag120
tgtacaaagtccggggggtgcgtggcccaggacacctcggtgatccttgactggaactac180
cgctggatgcacgacgcaaactacaactcgtgcaccgtcaacggcggcgtcaacaccacg240
ctctgccctgacgaggcgacctgtggcaagaactgcttcatccagggcgtcgactacgcc300
gcctcgggcgtcacgacctcgggcagcagcctcaccatgaaccagtacatgccccgcagc360
tctggcggctacagcagcgtctctcctcggctgtatctcctggactctgacggtgagtac420
gtgatgctgaagctcaacggccaggagctgagcatcgacgtcgacctctctgctctgccg480
tgtggagagaacggctcgctctacctgtctcagatggacgagaacgggggcgcccaccag540
tataacacggccggtgccaactacgggagcggctactgcgatgctcagtgccccgtccag600
acatggaggaacggcaccctcaacactagccaccagggcatctgctgcaacgagatggat660
atcctggagggcaactcgagggcgaatgccttgacccctcactcttgcacggccacggcc720
tgcgactctgCCggttgCggcttcagcgcctatggcagcggctacaaaagctactacggc780
cccggagataccgttgacacctccaagaccttcaccatcatcacccagttcaacacggac840
aacggctcgcccacgggcaaccttgtgagcatcacccgcaagtaccagcaaaacggcgtc900
gacgtccccagcgcccagccccgcggcgacaccatctcgtcctgcccgtccgcctcagcc960
tacggcggcctcgccaccatgggcaaggccctgagcagcggcatggtgctcgtgttcagc1020
atttggaacgaccacagccagtacatgaactggctcgacagcggcaacgcCggCCCCtgC1080
agcagcaccgagggcaacccatccaacatcctgaccaacaaccccaacacgcacgtcgtc1140
ttctccaacatccgctggggagacattgggtctactacgaactcgactgcgcccccgccc1200
CCgCCtgCgtccagcacgacgttttcgactacacggaggagctcgacgacttcgagcagc1260
ccgagctgcacgcagactaactgggggcagtgcggtggcattgggtacagcgggtgcaag1320
acgtgcacgtcgggcactacgtgccagtatagcaacgacgactactcgcaatgcctttag1380
本发明还提供了包含上述优化改良的中性纤维素酶基因MEGl的重组载体，优选
为pPICz α A-MEG1。将本发明的优化改良的中性纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的糖化酶基因插入到质粒PPICz α A上的EcoR I和Not I 限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 pPICz α A-MEGl。本发明还提供了包含上述优化改良的中性纤维素酶基因MEGl的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株Χ33。本发明还提供了一种制备上述优化改良的中性纤维素酶MEGl的方法，包括以下步骤1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组中性纤维素酶MEGl的表达；以及3)回收并纯化所表达的中性纤维素酶MEGl。具体地，将重组酵母表达质粒pPICz α A-MEGl，转化到酵母宿主菌株Χ33中，用高浓度的抗生素平板筛选高拷贝的转化子，将筛选到的转化子，在7L的发酵罐中进行发酵， 发酵过程中，每隔24h取发酵液测定0D_以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到13000U/mL，实现中性纤维素酶MEGl的高效表达。本发明还提供了上述中性MEGl的应用，优选该酶在水解淀粉及在纺织、洗涤、造纸和饲料中的应用。本发明为了解决现有技术的不足，利用基因工程手段对里氏木霉纤维素酶EGl进行改良，以解决其在酸性环境下酶活较低，不能适用于工业生产的要求。经过优化改良的 MEGl在中性条件下酶活有很大的提高，并且，通过高拷贝外源基因菌株的筛选，得到能够在反应器中高效表达的生产菌株，进一步满足工业化生产的要求，因此，本发明的优化改良的 MEGl可在纺织、洗涤、造纸、饲料中显示出巨大的应用潜力。


图1为pPICz α A-MEGl酵母菌株在7L发酵罐中的发酵情况。图2为纤维素酶EGl和MEGl在不同ρΗ值环境下的相对酶活曲线图。图3为纤维素酶EGl和MEGl在不同温度环境下的相对酶活曲线图。图4为纤维素酶EGl和MEGl的热稳定性曲线图。



本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的中性纤维素酶MEG1及其基因和应用。本发明提供了一种优化改良的中性纤维素酶MEG1，其具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述优化改良的中性纤维素酶MEG1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的优化改良的中性纤维素酶MEG1在中性条件下酶活有很大的提高，并且，通过高拷贝外源基因菌株的筛选，得到能够在反应器中高效表达的生产菌株，进一步满足工业化生产的要求，因此，本发明的优化改良的MEG1可在纺织、洗涤、造纸、饲料中显示出巨大的应用潜力。