专利名称：来源于嗜热盐丝菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶及其表达与纯化的制作方法草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为了在农业生产中使用草甘膦，必 须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine, glyphosate)毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(简称EPSP合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成过程中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码。目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62%。然而现在主要研究的抗草甘膦基因主要是I型的，因而发掘新型的II类的EPSP合成酶基因将是必要的。
本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于嗜热盐丝菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其表达与纯化。本发明通过对该酶基因的动力学参数以及在原核生物中表达进行研究，发现该酶基因可用于生产耐受草甘膦的转基因作物。本发明所述的来源于嗜热盐丝菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No I所示，是通过化学合成方法得到的。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成(PTDS) (Nucleic Acids Research，2004，32:e98)，该方法是目前基因合成的主流方法，通过重叠延伸获得合成基因的片段，再通过最外侧的引物将全长的基因扩增得到。该方法一个明显的优势就是不需要对引物进行磷酸化处理，而且通过高通量的DNA合成仪器，可以较为便利地获得大量的引物。所述的来源于嗜热盐丝菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的具体合成方法包括以下步骤:I)引物设计设计长度大概为60bp左右的覆盖整个5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列34个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。2) PCR 扩增利用PCR进行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶扩增。其中，在IOOiU反应体系中，P2—P33共32个引物的添加量为2ng，两个外侧引物Pl和P34的添加量为30ng，扩增条件为:94°C预热 lmin，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶为 KOD FXtaq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。3)转化PCR结束后，用I %琼脂糖胶回收片段，取IOiU直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，在DH5a感受态中高效转化，即获得长度为1293bp的SEQ IDNo I序列的阳性克隆。将上述获得的序列为SEQ ID No I阳性克隆直接与原核表达载体pYM4087 (上海市农科院分子生物实验室保存)相连，4°C连接2小时。然后将该载体转化感受态大肠杆菌TOP 10 (Invitrogen)。将菌液涂布于含有50 y g/mL氨苄青霉素的固体LB培养基(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH 7.5)37°C过夜培养。次日，挑取3-5个菌落，接种于50ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液PH 7.5)中，37°C摇床直到菌液的浓度达到0D_为1.0时停止培养。培养液在5，OOOg重力加速度下离心5min，无菌水清洗I次。所得的细胞沉淀用ImL磷酸裂解缓冲液重悬，然后将其转移到微量离心管中。使用超声波仪裂解菌液30min，以12，OOOg离心30min。使用微孔滤膜过滤离心好的上清,上到N1-Agarose柱上,纯化出目的蛋白。将目的蛋白透析后使用蛋白保存液保存起来。然后对其进行酶动力学特性分析。有益效果本发明制得的来 源于嗜热盐丝菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶是一类应用性非常强的酶，试验表明，该基因可用于生产耐受草甘膦的转基因作物中。图1为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因化学合成的策略图。图2为本发明的以pYM 4087质粒构建DNA表达单元示意图。1.EMPI1-1:Tm = 54.60merGGA, TCC, ATG, GAA, CTG, AAG, ATC, AAG, AAG, TCC, AAT, CCA, CTG, AAG, GGT, GAG,ATC，AAC，ATT, CCA2.EMPI1-2:Tm = 54,60merAGG，TGA，AGA，TGA，CGG，ATC，TGT，GGG，AGA，TGG，ACT, TGT，CAC，CTG，GAA，TGT，TGA，TCT，CAC，CCT3.EMPI1-3:Tm = 54,60merCAG，ATC，CGT，CAT, CTT，CAC，CTC，TCT，TGC，TGA，AGG，CAG，ATC，CTT，GAT，CAG，AGG，CTT，CCT，GGA4.EMPI1-4:Tm = 54,60merCAT, CTG，GAA, GGC, TCT，CAG，AGT，GTT，CAG，ACA, GTC, CTC, AGA, CTC, CAG，GAA,GCC，TCT，GAT，CAA5.EMPI1-5:Tm = 54,60merCTC，TGA，GAG, CCT，TCC，AGA，TGA，TGG，GTG，TCA，ACA，TCG，AGA，AGA，TCA，AGC，CAG，GTG，AGT，ACA6.EMP11-6:Tm = 54,60merCCT，GGC，TCT，TTC，AGA，CCA, TAC，AGA，CCA, ACA，CCA, TTG，ACG，ATG，TAC，TCA，CCT，GGC，TTG，ATC7.EMPI1-7:Tm = 54,60merTAT，GGT，CTG，AAA，GAG, CCA，GGT，GAC，GTC，ATT, GAC，TGT，GGC，AAC，TCT，GGC，ACT, GGT，ATG，AGA8.EMP11-8:Tm = 54,60merCAG，AGT，AGA，ATG，GTT，GTG，GAG, CAA，GAA，GAC，CAC，ACA，ACA，GTC，TCA，TAC，CAG，TGC，CAG，AGT9.EMP11-9:Tm = 54,60merTCC, ACA, ACC, ATT, CTA, CTC, TGT，CTT，GAC, TGG，TGA, CAA, CTC, TCT，GAG, AAA，CAG，ACC，AAT，GGG10.EMPI1-10:Tm = 54,60merGAT，GGA，GGC，TCC，CAT, TTG，TCT，CAG，AGG，ATT, GAC，AAC，TCT，GCC，CAT, TGG，TCT，GTT，TCT，CAG11.EMPI1-11:Tm = 54,60merGAC，AAA，TGG，GAG, CCT，CCA，TCT，GGT，GCA，GAG, ATG，GTG，GTT，ATG，CTC，CAC，TGT，CCA，TCA，AAG12.EMPI1-12:Tm = 54, 60merGCA，ACT, GGC，AAG，GTG，TAG, GAG, ATG，CCT，TCC，AGC，TTC，TCA，CCT，TTG，ATG，GAC，AGT，GGA，GCA13.EMPI1-13:Tm = 54,60merTCC，TAC，ACC，TTG，CCA，GTT，GCC，TCT，GCT，CAG，GTC，AAG，TCC，TCT，CTG，CTG，CTG，GCT，GGC，TTG


本发明涉及一种来源于嗜热盐丝菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶及其表达与纯化。所述合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，全长1293bp。将其与原核表达载体pYM4087连接并转化至大肠杆菌，动力学实验表明该合成酶基因可用于生产耐受草甘膦的转基因作物。