专利名称：一株生产丙酮酸的耐高温酵母菌及其应用的制作方法一株生产丙酮酸的耐高温酵母菌及其应用技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及到一株生产丙酮酸的耐高温酵母菌，光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No5434和利用该菌发酵生产丙酮酸的方法。丙酮酸是最重要的化工中间体之一，在制药、食品、化工、农用化学品等领域以及科学研究中有广泛用途。化学法制造丙酮酸不利于环境的保护，难以满足经济和社会可持续发展的需要。国内外多年研究开发获得了一系列丙酮酸产量超过50g/L，个别甚至超过100g/L的菌株,使得丙酮酸生物制造的工业化成为可能(Qiang Hua, Chen Yang, kazuyukiShimizu:J Biosci Bioeng，1999 ;Li Y，Chen J，Lun SY:AppI Microbiol Biotechnol，2001 ；Wang Q，He P，Lu D，Shen A，Jiang N:Let Appl Microbiol, 2002 ；Causey TB，Shanmugam KT，Yomano LP，Ingram LO:PNAS，2004 ;van Maris AJiGeertman JM，VermeulenA， Groothuizen MK, Winkler AA, Piper MD， van Dijken JP, Pronk JT:Appl EnvironMicrobiol, 2004 ；Wang Q，He P，Lu D，Shen A，Jiang N:Enzyme Microb Technol，2005 ;ZelicB Bolf N, Vasic-RackiD:Bioprocess Biosyst Eng, 2006 ；Liu L，Xu Q, Li Y，Shi Z，ZhuY，Du G，Chen J:Biotechnol Bioeng,2007 ；Xu P，Qiu J，Gao C，Ma C: J Biosci Bioeng,2008 ；Zhu Y，Eiteman MA, Altman R，Altman E:Appl Environ Microbiol.2008)。丙酮酸生物制造将具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。但是高效、经济性地实现丙酮酸的生物制造，仍然有一系列的关键技术，其中高性能生产菌株的选育改造是实现丙酮酸生物制造的核心，其他包括发酵工艺的优化和产物的绿色分离纯化等也需要进一步的研究和开发。发明内容本发明的目的是提供一株能够耐受高温、生产丙酮酸的酵母菌和发酵法生产丙酮酸的方法及应用。本发明所提供的耐高温丙酮酸生产酵母菌为光滑球拟酵母菌(Torulopsisglabrata)TIB-G90已于2011年11月3日藏保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMC`C No5434。目前已有的利用酵母菌进行丙酮酸发酵生产都是30V左右的温度下进行的。由于发酵生产将产生热量，在工业生产过程中需要消耗大量的冷却水来降低温度，以维持30°C左右的发酵过程。初步计算表明利用30°C的丙酮酸发酵生产，每生产I吨丙酮酸将消耗50-70吨的冷却水，如果提高发酵温度到40°C以上，则冷却水的用量可降低到25吨以下。所以提高丙酮酸的发酵生产温度可以大幅度降低冷却水用量，减少能量消耗，从而降低丙酮酸生产成本。要实现40°C左右较高温的丙酮酸发酵生产，就必须有合适的耐高温生产菌株。因此提高酵母菌对温度的耐受性，使其能在高温环境下生长良好且丙酮酸的生产水平不会降低对工业生产的意义十分重大。为了改善菌株工业适应性，我们从光滑球拟酵母3672号(CGMCC No0879)出发，利用适应进化(adaptive evolution)的方法对菌株进行高温环境的适应性驯化,得到一株能够在40°C生长良好，且不影响丙酮酸积累水平的生产丙酮酸的酵母菌TIB-G90 CGMCCNo5434。本发明的目的是提高了菌株发酵条件的温度，使其能够在高温环境下适应生长的同时不影响发酵时丙酮酸的积累量，该菌株可以在丙酮酸的工业生产中进行应用。具体实施以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。
实施例1 耐温光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata) TIB-G90 CGMCC No5434 的获得
光滑球拟酵母3672 CGMCC No0879接种于适应进化培养基，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，牛肉膏3%，KH2PO40.1%, MgSO4.7H200.05%,CaC034%。在含有IOmL培养基 的50ml摇瓶中于37°C、220r/min的培养12小时后，然后以0.2个0D600值接种于新鲜的相同培养基中，以相同的方法传代培养。以此类推，使菌株适应37°C的环境生长稳定后，用相同的培养基和培养条件逐渐提高生长温度，进行适应性驯化直到温度达到40°C，使其仍能够稳定生长，且增长量与出发菌株在30°C生长量基本相同，从而得到光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No5434。
实施例2 光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)3672 CGMCC No0879 和(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC 吣5434 的30。〇发酵对比
光滑球拟酵母3672 CGMCC No0879和TIB-G90 CGMCC No5434分别接种于种子培养基中，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，大豆蛋白胨3%，KH2PO40.1 %，MgSO4.7Η200.05 %，CaC0s3 %，在装有 IOmL 的 50ml 摇瓶中于 30 °C、220r/min的培养24小时后，取5mL种子液接种到装有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%, (NH4)2S043%, KH2PO40.1%,MgSO4.7Η200.05%,维生素 Β10.00001 %,维生素 B60.0002 %,烟酸 0.0004 %,生物素0.00002%, CaC034%。在30°C、220r/min的培养36小时，分别用常规方法测定菌体的生长量及发酵液中丙酮酸和乙醇的含量。光滑球拟酵母TIB-G90 CGMCC No5434的0D600为36.7，丙酮酸为32.12g/l，乙醇为3.84g/l ;光滑球拟酵母3672 CGMCC No0879的0D600为34.8，丙酮酸为 29.23g/l，乙醇为 5.49g/l。
实施例3 光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata) 3672 CGMCC No0879 和 TIB-G90CGMCC No5434的40°C发酵对比
光滑球拟酵母3672 CGMCC No0879和TIB-G90 CGMCC No5434分别接种于种子培养基中，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，大豆蛋白胨3%，KH2PO40.1 %, MgSO4.7Η200.05 %, CaC0s3 %,在装有 IOmL 的 50ml 摇瓶中于 40 °C、220r/min的培养12小时后，取5mL种子液接种到装有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，该培养基的pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%, (NH4)2S043%, KH2PO40.1%,MgSO4.7Η200.05%,维生素 Β10.00001 %,维生素 B60.0002 %,烟酸 0.0004 %,生物素0.00002%, CaC034%。在40°C、220r/min的培养24小时，分别用常规方法测定菌体的生长量及发酵液中丙酮酸和乙醇的含量。光滑球拟酵母TIB-G90 CGMCC No5434的0D600为40.8，丙酮酸为28.08g/l,乙醇为1.86g/l ;光滑球拟酵母3672 CGMCC No0879的为0D600为21.3，丙酮酸为9.86g/l，乙醇为6.27g/l。
实施例4 光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata) TIB-G90 CGMCC No5434 的 42°C摇瓶发酵生产丙酮酸
光滑球拟酵母TIB-G90 CGMCC No5434接种装有25mL发酵培养基的500mL摇瓶中，该培养基的PH为5.4，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖10%，鱼蛋白胨3%，KH2PO40.1 %, MgSO4.7Η200.05 %,维生素 Β10.00001 %,维生素 Β20.0002 %,维生素Β60.0002 %,维生素 Β120.0001 %，叶酸 0.0001 %，烟酸 0.0004 %,生物素 0.00002 %,CaC034%。在42°C、220r/min的摇床发酵30小时后，离心分离菌体，按常规方法测定上清液中含有丙酮酸为49g/l。
实施例5 光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata) TIB-G90 CGMCC No5434 的 5L 发酵罐发酵生产丙酮酸
光滑球拟酵母TIB-G90 CGMCC No5434接种装有500mL种子培养基的3000mL摇瓶中，该培养基的PH为6，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖5 %，酵母粉I %，CaC0s3 %。，在40 V、220r/min的摇床培养12小时后，把500mL培养液接种有5000mL发酵培养基7.5L发酵罐(NBSBioFlo 115)中，该培养基含有下述质量百分比的组分:葡萄糖15%,NH4Cl 2%，大豆蛋白胨 I %, KH2PO40.1 %, MgSO4.7Η20 0.05%，维生素 Β10.00001 %，维生素 Β60.0002%,烟酸0.0004%，生物素0.00002%，通过5Μ的NaOH实时控制pH为5.5左右。在40°C，通气量为1:1的条件下发酵48小时后，离心分离菌体， 按常规方法测定上清液中含有丙酮酸为 76g/l。


丙酮酸是一种代谢途径中重要的有机酸，该产品具有广泛的用途。本发明利用高温适应进化的方法，筛选到一株耐受高温的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No.5434。光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)TIB-G90 CGMCC No.5434能够在40-45℃生长良好，同时不会影响发酵液中丙酮酸的积累量。耐高温菌株能够减少生产过程中用于降低温度所带来的生产成本的增加，因此该菌株具有广泛的工业应用前景。