专利名称：一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株hd924和方法二羟基丙酮，又称1，3-二羟基丙酮，英文名为1，3-dihydroxyacetone或 dihydroxyacetone,简写为DHA，分子式为C3H6O3,分子量为90. 08，是最简单的三碳酮糖， 外观是白色或类白色粉末状结晶，具有甜、凉的味道，易吸湿并分解。一般状态下是二聚体 (1，4-Dioxane)的结晶，经溶解或加热后变为单体。二羟基丙酮是一种天然存在、水溶性的最简单的酮糖，具有生物可降解性，可食用且对人体和环境无毒害；其分子中带有几个活泼集团，可催化多种反应。其衍生物是有机化学合成中非常重要的一类中间体。因此作为一种重要的化工原料、医药中间体和功能添加剂在国外已经得到了广泛的实际应用。因为二羟基丙酮分子中含有三种官能团，化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等化学反应，是一种重要的化学合成中间体。在工业上，DHA 可有效还原丁二烯一苯乙烯复合物；能有效催化甲醛到羟醛、羟酮的缩合反应；可合成杂环化合物、、甘油三酯、酮位取代化合物；还可用于合成无毒可降解的生物材料产品。此外， 二羟基丙酮还可作为一种良好的活性着色成份被广泛应用到化妆品中。DHA最大特点之一就是具有极强的防晒性，可与皮肤表层自由氨基结合在皮肤表面形成一细密的薄膜，反射太阳光，屏蔽紫外线，阻止皮肤水分过度蒸发，起到很好的保湿及防晒作用。目前，DHA作为药物已经应用在低血糖与糖尿病的治疗及某些病毒性皮肤病(如对白斑和白癜风就具有显著疗效)的治疗上。作为医药中间体，DHA能合成一些治疗心血管疾病的药物。同时它还可直接作为一种抗病毒试剂，如在鸡蛋胚胎培养中，使用DHA能大大抑制鸡瘟病毒的感染，杀死5广100%的鸡瘟病毒。另外以DHA作为中间体合成相应的衍生物，可具有抗艾滋病病毒的作用。在农业及食品方面，二羟基丙酮可用作饲料添加剂，在猪饲料中加入一定量的二羟基丙酮和丙酮酸盐的混合物，能减少猪肉的脂肪含量增加瘦肉率。在膳食中添加二羟基丙酮可提高有氧耐力，也可以改变机体代谢率和底物利用血脂的变化等方面。二羟基丙酮的工业化生产主要是利用含有甘油脱氢酶微生物以甘油为底物发酵生产。目前报道最多的能产甘油脱氢酶的微生物为葡萄糖酸杆菌属如Cter)和醋杆菌属(A^to如cter)，能产生二羟基丙酮的主要微生物资源如下Bacillus xylinum、 Acinetobacter sp. strain JCl DSM 3803, Acetobacter xylinum A-9, Gluconobacter melanogenus IFO 3293、Gluconobacter melanogenus IFO 3294、Hansenula polymorpha CBS 4732、Candida boidinii 2201、Klebsiella aerogenes.、Escherichia coli (strain ECFS)、 Gluconobacter oxydans ATCC 621, Pichia membranifaciens、 Bacillus licheniformis B-05571、Acetonionassp等。国内外关于高产二羟基丙酮的微生物资源报道较少。因此，自主创新地筛选出能够耐受高浓度甘油的微生物菌株，并且研究出一种能够生产高浓度二羟基丙酮的方法迫在眉睫。
本发明目的在于提供一种对高浓度甘油有一定耐受性的菌株HD924，该菌株可用于微生物发酵生产二羟基丙酮。本发明还给出了利用该菌株HD9M发酵生产二羟基丙酮的方法，该方法以廉价的甘油为原料，甘油转化率较高。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株HD924，其分类属醋酸杆菌科 (.Acetobacteraceae)葡萄糖酸杆菌属(Mluconobacter)弗托氏葡萄糖酸杆菌 (.Gluconobacter frateurii),该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC No. 5397，保藏日期2011年10月观日，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。利用所述菌株HD9M发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，具体为将菌株HD9M按 1 10%的接种量接入发酵培养基，在好氧条件下于观 30°C发酵培养48 72h ；所述发酵培养基组成为甘油50 350g/L，氮源5 20g/L，碳酸钙0. 1 15g/L，用水配制，培养 SpH 4 7。较好的，也可以将菌株HD9M先按1 10%的接种量接种到一级种子培养基中，于 28 30°C好氧培养4 M h ；然后将培养好的一级种子按1 10%的接种量接入二级种子培养基中，8 10 h后将培养好的二级种子按1 10%的接种量再接入发酵培养基；其中， 所述一级种子培养基的组成为甘油30 50g/L，酵母粉5 15g/L，KH2PO4 0. 1 0. 5g/L， 用水配制，PH自然；所述二级种子培养基的组成为甘油30 50g/L，酵母粉5 15g/L， CaCO3 0. 1 0. 5g/L，用水配制，pH 4. 0 7. 0。具体的，所述甘油优选为食品级甘油、工业级甘油或皂化粗甘油等。所述氮源选自酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素或无机铵盐等。可通过本领域的常规方法来调节培养基的PH值，如添加盐酸、氢氧化钠、碳酸钠等无机酸碱盐。其中，所述发酵培养基、一级种子培养基及二级种子培养基的灭菌条件为 115 121°C，15 25min。在本发明中，建立了一个筛选高产二羟基丙酮的模型。由于具有甘油脱氢酶的微生物能利用甘油做为碳源生长，并产生二羟基丙酮，因此设计出以甘油为唯一碳源的选择性平板，筛选出能够利用甘油的菌株。在平板上挑出较大的菌落至摇瓶发酵筛选。本发明的特点是从腐烂的水果中分离得到能有效产生二羟基丙酮的弗托氏葡萄糖酸杆菌 iGluconobacter /ratearii) HD924，其在好氧条件下能显著地积累二羟基丙酮(40 — 170 g/L)，最高达到170 g/L，可实现工业化生产。本发明方法的突出优点是利用廉价的甘油为原料来发酵生产二羟基丙酮，该方法可持续生产，且对环境友好。图1为弗托氏葡萄糖酸杆菌HD924的平板菌落照片(XlO)； 图2为弗托氏葡萄糖酸杆菌HD924的扫描电镜照片(X 10000)； 图3为弗托氏葡萄糖酸杆菌HD924的16S rDNA全序列测序结果； 图4为基于BLAST结果构建的进化树。
从腐烂的水果中取样，粉碎后，取IOg加入90mL无菌生理盐水，振荡1 h，取上清液，稀释成一系列浓度梯度。取10_5、10_6、1(Τ三个梯度0. 2 mL涂布于平板培养基(平板培养基组成为甘油30g/L，酵母粉15g/L，琼脂粉15g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然培养；Γ4 d，获得单菌落。选取菌落均勻的平板，从其上挑取10 - 20个较大菌落分别接种至发酵培养基 (每株菌株做一个摇瓶，发酵培养基组成为甘油100 g/L，酵母粉10g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然发酵培养48h。然后取1. 5mL发酵液12000转/分离心5 min,取0. 5 mL上清液，加入4. 5mL 二苯胺溶液(二苯胺溶液按下述方法配制将0.6g 二苯胺与M mL无水乙酸混勻，再缓缓加入 6mL浓硫酸，混勻即得)，沸水浴15min后测定0D_，并依此计算出二羟基丙酮含量(具体的测定方法可参见刘宇鹏，李华等，发酵液中1，3— 二羟基丙酮的分光光度法测定，中国医药工业杂志，2011，42 (11)，834 — 837)。选取产二羟基丙酮较高的百余株菌株，于4°C条件下保存其相应斜面(斜面培养基组成为甘油30g/L，酵母粉15g/L，琼脂粉15g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然，甘油为食品级)。2、复筛
将初筛保留的菌株转接于装有30mL发酵培养基的三角瓶中(每株菌株做三个摇瓶平行样，发酵培养基组成与初筛中的发酵培养基相同)，200转/分，28°C好氧培养48h。取1. 5mL发酵液12000转/分离心5min，取上清液，稀释后用HPLC法测定二羟基丙酮含量。HPLC条件如下色谱柱Aminex HPX-87H柱(7. 8 mmX300 mm, 9 μπι);流动相 8 mmol/L硫酸；检测器RI检测器，UV检测器(检测波长215 nm)；柱温50°C ；流速0. 5 ml/ min ；进样量20 μ 1。多数菌株二羟基丙酮含量较低，仅有3-8-4号菌株(实验室该菌株编号为HD924) 产二羟基丙酮显著，为45. 7 g/L。表1中给出了产二羟基丙酮效果较好的数十余株菌株。
表1部分试验菌袜的产二羟基丙酮情况


本发明涉及一种微生物发酵生产二羟基丙酮的菌株HD924，其分类属醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)弗托氏葡萄糖酸杆菌(Gluconobacterfrateurii)，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5397。本发明还给出了利用该菌株发酵甘油生产二羟基丙酮的方法，其在好氧条件下能显著地积累二羟基丙酮，最高达到170g/L，可实现工业化生产。