用于检测人乳头瘤病毒(hpv)的密切相关的血清型的测定法制作方法

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专利名称

用于检测人乳头瘤病毒(hpv)的密切相关的血清型的测定法制作方法
发明者

C·陈, H·J·派克, M·波特, G·A·理查特, R·A·麦克米兰
公开日

2012年12月12日
申请日期

2011年2月16日
优先权日

2010年2月16日
申请人

贝克顿·迪金森公司
文档编号

C12N15/37GK102822354SQ201180016387
关键字

hpv 乳头病毒检测用于
权利要求

1.ー种用于检测生物体的多个血清型在生物学样品中的存在或不存在的多重測定法，其中所述测定法检测比用于检测的通道更多的血清型，包括提供生物学样品；在使得探针和引物与靶序列退火的条件下，将所述生物学样品与至少3个寡核苷酸引物/探针组接触，每ー个寡核苷酸引物/探针组包含至少ー种被可检测地标记并且具有约10至约50的核苷酸序列长度的寡核苷酸探针和至少两种寡核苷酸引物，每ー种寡核苷酸引物具有约10至约150的核苷酸序列长度，并且其中每ー个引物/探针组至少对于生物体的特定血清型是偏向性的，其中第一和第二引物/探针组彼此是简并的，并且其中所述简并探针各自具有发射可在相同通道上被检测的信号的信号部分，并且其中第三引物/探针组相对于另外两个引物/探针组不是简并的，并且辨别第三血清型，所述第三血清型不是所述简并引物/探针组偏向干与其退火的血清型，并且其中所述第三引物/探针组具有以这样的波长发射信号的信号部分，所述波长与由所述简并探针的信号部分发射的波长相同或不同；如果存在的话，扩增靶序列；和监测标记的检測，作为所述探针组对所述靶序列的杂交的指示，从而指示HPV的至少ー种血清型的存在或不存在2.权利要求I的测定法，其中所述生物体为人乳头瘤病毒(HPV)3.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶选自SEQIDNO. 36-384.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 36，并且其中所述第三弓I物/探针组经构造用于辨别HPV血清型51并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第三引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 24-29的序列以及与SEQ ID NO. 24-29具有至少70%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型39并且不区分HPV血清型39与HPV血清型68，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 1、3和5的序列以及与SEQ ID NO. I、3和5具有至少70%的同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型68并且不区分HPV68血清型与HPV血清型39，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQIDNO. 2、4和6的序列以及与SEQ ID NO. 2、4和6具有至少70%同源性的序列5.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 37，并且其中所述第三弓I物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第三引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ IDNO. 30-35的序列和与SEQ ID NO. 30-35具有至少70%的同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型33并且不区分HPV血清型33与HPV血清型58，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 7、9、11、13和15的序列以及与SEQ ID NO. 7、9、11、13和15具有至少70%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型58并且不区分HPV 58血清型与HPV血清型33，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 8、10、12、14和16的序列以及与SEQ ID NO. 8、10、12、14和16具有至少70%同源性的序列6.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 38，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第三引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQ ID NO. 30-35具有至少70%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型56并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 17、19和21的序列以及与SEQ ID NO. 17、19和21具有至少70%同源性的序列；以及所述第二引物/探针组选择HPV血清型66并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 18、20、22和23的序列以及与SEQ ID NO. 18、20、22和23具有至少70%同源性的序列7.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 36，并且其中所述第三弓I物/探针组经构造用于辨别HPV血清型51并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第三引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 24-29的序列和与SEQ ID NO. 24-29具有至少80%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型39并且不区分HPV 39血清型与HPV血清型68，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ I D NO. I、3和5的序列以及与SEQ ID NO. I、3和5具有至少80%同源性的序列；以及所述第二引物/探针组选自HPV血清型68并且不区分HPV 68血清型与HPV血清型39，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ IDNO. 2、4和6的序列以及与SEQ ID NO. 2、4和6具有至少80%同源性的序列8.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 37，并且其中所述第三弓I物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQ ID NO. 30-35具有至少80%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型33并且不区分HPV 33血清型与HPV血清型58，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 7、9、11、13和15的序列以及与SEQ ID NO. 7、9、11、13和15具有至少80%同源性的序列；以及所述第二引物/探针组选择HPV血清型58并且不区分HPV 58血清型与HPV血清型33，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 8、10、12、14和16的序列以及与SEQ ID NO. 8、10、12、14和16具有至少80%同源性的序列9.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 38，并且其中所述第三弓I物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第三引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQ ID NO. 30-35具有至少80%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型56并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 17、19和21的序列以及与SEQ ID NO. 17、19和21具有至少80%同源性的序列；以及所述第二引物/探针组选择HPV血清型66并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 18、20、22和23的序列以及与SEQ ID NO. 18、20、22和23具有至少80%同源性的序列10.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 36，并且其中所述第三弓I物/探针组经构造用于辨别HPV血清型51并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第三引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 24-29的序列和与SEQ ID NO. 24-29具有至少90%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型39并且不区分HPV 39血清型与HPV血清型68，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ I D NO. I、3和5的序列以及与SEQ ID NO. I、3和5具有至少90%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型68并且不区分HPV 68血清型与HPV血清型39，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ IDNO. 2、4和6的序列以及与SEQ ID NO. 2、4和6具有至少90%同源性的序列11.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 37，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQ IDNO. 30-35具有至少90%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型33并且不区分HPV 33血清型与HPV血清型58，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 7、9、11、13和15的序列以及与SEQ ID NO. 7、9、11、13和15具有至少90%同源性的序列；以及所述第二引物/探针组选择HPV血清型58并且不区分HPV58血清型与HPV血清型33，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自 SEQ ID NO. 8、10、12、14 和 16 的序列以及与 SEQ ID NO. 8、10、12、14 和 16 具有至少 90%同源性的序列12.权利要求2的测定法，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 38，并且其中所述第三弓I物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ I D NO. 30-35的序列和与SEQ IDNO. 30-35具有至少90%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型56并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 17、19和21的序列以及与SEQ ID NO. 17、19和21具有至少90%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型66并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQIDNO. 18、20、22和23的序列以及与SEQ ID NO. 18、20、22和23具有至少90%同源性的序列13.一种用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的多个血清型的探针组，其包含至少3个寡核苷酸引物/探针组，每ー个寡核苷酸引物/探针组包含至少ー种被可检测地标记并且具有约10至约50的核苷酸序列长度的寡核苷酸探针和至少两种寡核苷酸引物，每ー种寡核苷酸引物具有约10至约150的核苷酸序列长度，其中每ー个引物/探针组至少对于HPV生物体的特定血清型是偏向性的，其中第一和第二引物/探针组彼此是简并的，并且其中所述简并探针各自具有发射可在相同通道上被检测的信号的信号部分，并且其中第三引物/探针组相对于所述第一和第二引物/探针组不是简并的，并且辨别第三血清型，所述第三血清型不是所述简并引物/探针组偏向干与其退火的血清型，并且其中所述第三引物/探针组具有以这样的波长发射信号的信号部分，所述波长与所述第一和第二引物/探针组中的探针的波长相同或不同14.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶选自SEQID NO. 36-3815.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 36，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型51并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述第三引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ IDNO. 24-29的序列和与SEQ ID NO. 24-29具有至少70%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型39并且不区分HPV 39血清型与HPV血清型68，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 1、3和5的序列以及与SEQ ID NO. 1、3和5具有至少70%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型68并且不区分HPV 68血清型与HPV血清型39，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 2、4和6的序列以及与SEQ ID NO. 2、4和6具有至少70%同源性的序列16.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQID NO. 37，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQID NO. 30-35具有至少70%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型33并且不区分HPV 33血清型与HPV血清型58，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 7、9、11、13和15的序列以及与SEQ ID NO. 7、9、11、13和15具有至少70%同源性的序列；并且所述第三引物/探针组选择HPV血清型58并且不区分HPV 58血清型与HPV血清型33，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自 SEQ ID NO. 8、10、12、14 和 16 的序列以及与 SEQ IDNO. 8、10、12、14 和 16 具有至少 70%同源性的序列17.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 38，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列以及与SEQ ID NO. 30-35具有至少70%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型56并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 17、19和21的序列以及与SEQ ID NO. 17、19和21具有至少70%同源性的序列；以及所述第二引物/探针组选择HPV血清型66并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 18、20、22和23的序列以及与SEQ ID NO. 18、20、22和23具有至少70%同源性的序列18.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 36，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型51并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 24-29的序列以及与SEQ ID NO. 24-29具有至少80%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型39并且不区分HPV 39血清型与HPV血清型68，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 1、3和5的序列以及与SEQ ID NO. 1、3和5具有至少80%同源性的序列；以及所述第二引物/探针组选择HPV血清型68并且不区分HPV 68血清型与HPV血清型39，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ IDNO. 2、4和6的序列以及与SEQ ID NO. 2、4和6具有至少80%同源性的序列19.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 37，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQID NO. 30-35具有至少80%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型33并且不区分HPV 33血清型与HPV血清型58，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 7、9、11、13和15的序列以及与SEQ ID NO. 7、9、11、13和15具有至少80%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型58并且不区分HPV 58血清型与HPV血清型33，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自 SEQ ID NO. 8、10、12、14 和 16 的序列以及与 SEQID NO. 8、10、12、14 和 16 具有至少 80%同源性的序列 20.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 38，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQID NO. 30-35具有至少80%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型56并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 17、19和21的序列以及与SEQ ID NO. 17、19和21具有至少80%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型66并且不区分HPV66血清型与HPV血清型56，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQID NO. 18、20、22和23的序列以及与SEQ ID NO. 18、20、22和23具有至少80%同源性的序列21.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 36，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型51并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 24-29的序列和与SEQID NO. 24-29具有至少90%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型39并且不区分HPV 39血清型与HPV血清型68，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. I、3和5的序列以及与SEQ ID NO. I、3和5具有至少90%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型68并且不区分HPV 68血清型与HPV血清型39，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQID NO. 2,4和6的序列以及与SEQ ID NO. 2、4和6具有至少90%同源性的序列22.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 37，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQID NO. 30-35具有至少90%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型33并且不区分HPV 33血清型与HPV血清型58，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 7、9、11、13和15的序列以及与SEQ ID NO. 7、9、11、13和15具有至少90%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型58并且不区分HPV 58血清型与HPV血清型33，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自 SEQ ID NO. 8、10、12、14 和 16 的序列以及与 SEQ IDNO. 8、10、12、14 和 16 具有至少 90%同源性的序列23.权利要求13的探针组，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 38，并且其中所述第三引物/探针组经构造用于辨别HPV血清型59并且相对于所述第一或第二引物/探针组不是简并的，其中所述引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 30-35的序列和与SEQID NO. 30-35具有至少90%同源性的序列；所述第一引物/探针组选择HPV血清型56并且不区分HPV 66血清型与HPV血清型56，其中所述第一引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQ ID NO. 17、19和21的序列以及与SEQ ID NO. 17、19和21具有至少90%同源性的序列；并且所述第二引物/探针组选择HPV血清型66并且不区分HPV66血清型与HPV血清型56，其中所述第二引物/探针组选自下列中的至少ー个选自SEQID NO. 18、20、22和23的序列以及与SEQ ID NO. 18、20、22和23具有至少90%同源性的序列24.一种用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的多个血清型的试剂盒，所述试剂盒包括至少3个寡核苷酸引物/探针组，每ー个寡核苷酸引物/探针组包含至少ー种被可检测地标记并且具有约10至约50的核苷酸序列长度的寡核苷酸探针和至少两种针对HPV生物体的特定血清型的寡核苷酸引物，每ー种寡核苷酸引物具有约10至约150的核苷酸序列长度，其中第一和第二引物/探针组彼此是简并的，并且其中所述简并探针各自具有发射可在相同通道上被检测的信号的信号部分，并且其中第三引物/探针组相对于另外两个引物/探针组不是简并的，并且辨别第三血清型，所述第三血清型不是所述简并引物/探针组偏向于与其退火的血清型，并且其中所述第三引物/探针组具有以这样的波长发射信号的信号部分，所述波长与由所述简并引物/探针组中的探针的信号部分发射的波长相同或不同25.权利要求24的试剂盒，其中所述第一和第二简并引物/探针组的简并引物/探针组的靶选自SEQ ID NO. 36-38之一26.权利要求24的试剂盒，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 36，并且所述第一简并引物/探针组包含SEQ ID NO. 1、3和5，并且所述第二简并引物/探针组包含SEQID NO. 2、4 和 627.权利要求24的试剂盒，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 37，并且所述第一简并引物/探针组包含SEQ ID NO. 7, SEQ IDNO. 15，以及SEQ ID NO. 9、11和13之一，并且所述第二简并引物/探针组包含SEQ ID NO. 8，SEQ ID NO. 15，以及SEQ ID NO. 10,12和14之一28.权利要求24的试剂盒，其中所述简并引物/探针组的靶为SEQIDNO. 38，并且所述第一简并引物/探针组包含SEQ ID NO. 17、19和21，并且所述第二简并引物/探针组包含SEQ ID NO. 18，SEQ ID NO. 20，以及 SEQ ID NO. 22 和 23 之一29.权利要求24的试剂盒，其中所述第三引物/探针组选自SEQI DNO. 24-26、SEQ IDNO. 27-29、SEQ ID NO. 30-32 和 SEQ ID NO. 33-3530.权利要求29的试剂盒，其中所述第三引物探针组辨别HPV血清型51并且选自SEQID NO. 24-26 和 SEQ ID NO. 27-2931.权利要求29的试剂盒，其中所述第三引物探针组辨别HPV血清型59并且选自SEQID NO. SEQ ID NO. 30-32 和 SEQ ID NO. 33-3532.权利要求29的试剂盒，其中所述第三引物/探针组的检测子探针的信号部分发射这样的波长，其与由所述第一和第二引物/探针组的检测子探针发射的波长相同33.权利要求29的试剂盒，其中所述第三引物/探针组的检测子探针的信号部分发射这样的波长，其与由所述第一和第二引物/探针组的检测子探针发射的波长不同

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专利名称：用于检测人乳头瘤病毒(hpv)的密切相关的血清型的测定法的制作方法用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的密切相关的血清型的测定法交叉參考相关申请本申请要求2010年2月16日提交的美国临时专利申请No. 61/304，941的提交日的权益，所述临时专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。序列表本申请包含已通过EFS-Web提交并且通过引用整体并入本文的序列表。于2011年I月31日创建的所述ASCII拷贝被命名为，用于检测HPV的相关血清型的序列表，其大小为7. 55千字节。发明背景已鉴定了超过80个类型的人乳头瘤病毒(HPV)。不同类型的HPV引起了从良性增生性疣至恶性癌症的广泛多样的生物学表型(关于综述,參见McMurray等人，Int.J. Exp, Pathol. 82 (I) : 15-33 (2001))。HPV6和HPVll是最常见的与良性疣相关的类型，然而HPV16和HPV18是与恶性病损最频繁相关的高风险类型。因此，临床样品中HPV的具体类型的确定对于预测发生HPV相关疾病的风险是至关重要的。几种基于核酸的方法已被用于鉴定和定量临床样品中的特定HPV类型，例如通过原位杂交、Southern印迹分析、杂交捕获或聚合酶链式反应(PCR)来检测病毒核酸。Hybrid Capture II (Qiagen, Inc. , Valencia, CA)测定法使用抗体捕获和非放射性信号检测，但仅检测给定组的HPV类型中的单个祀(參见,例如,Clavel等人，British J. Cancer80(9) : 1306-11 (1999)) ο此外，由于Hybrid Capture II测定使用RNA探针的混合物(针对高风险或低风险HPV类型的探针混合物是可获得的)，其不提供关于样品中检测到的具体HPV类型的信息，而仅指示高风险或低风险HPV的存在的阳性或阴性。类似地，许多基于PCR的方法通常包括扩增单个特定HPV靶序列，随后将所得的扩增子印迹至膜上，然后用放射性标记的寡核苷酸探针进行探測。其它方法通过使用商购可得的、能够PCR扩增存在于样品中的多个HPV类型的共有引物来利用不同类型的特定HPV基因之间的高同源性。随后使用类型特异性寡核苷酸探针来鉴定特定HPV类型的存在。參见，例如，Kleter等人，Journal ofClinical Microbiology 37 (8) : 2508-2517 (1999) ; Gravitt 等人，Journal of ClinicalMicrobiology38(l) : 357-361 (2000)。类似地，利用简并PCR引物的測定法利用了 HPV类型之间的同源性，从而允许检测更多的HPV类型(与利用特定引物组的方法相比较)。參见，例如，Harwood 等人，Journal of Clinical Microbiology 37 (11) : 3545-3555 (1999)。此类测定还需要另外的实验来鉴定具体的HPV类型。上述PCR法可与几个问题相关。例如，HPV类型之间反应效率的差异可导致ー些类型相对于其它类型的不成比例的扩增。此外，扩增的平衡被驱向以更高的拷贝数存在于样品中的那些类型，所述类型将消耗PCR反应组分，从而使得更不可能扩增含量较少的HPV类型。本领域中还描述了基于5’外切核酸酶荧光PCR测定(Taq-Man PCR)，其允许实时检测PCR产物和消除对放射性的需要。參见，例如，美国专利No. 5，538，848;Holland等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280(1991)。该方法利用标记的探针，其包含荧光报告分子(荧光团)和与PCR引物之间的靶DNA杂交的猝灭剂。荧光团的激发导致荧光团释放突光信号，该突光信号可被粹灭剂粹灭。可利用TAQ DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性检测扩增子，该酶在PCR引物的延伸过程中降解遇到的双链DNA，从而从探针释放荧光团。此后，荧光信号不再被猝灭，并且可利用自动化荧光计实时检测荧光信号的积累(其与靶DNA的量直接相关)。Taq-Man PCR测定法已被改造用于检测HPV类型。Swan等人(Journal of ClinicalMicrobiology 35(4) :886-891(1997))公开了，利用扩增LI基因的一部分的类型特异性HPV引物和类型特异性探针的荧光探针测定法。Swan等人的測定法在固定数目的PCR循环结束时測量(終点读取)，而非实时测量，荧光信号。Josefsson 等人(Journal of Clinical Microbiology 37 (3):490-96 (1999))报导了 Taq-Man測定法，该测定法结合用不同荧光染料标记的类型特异性探针，靶向El基因的高度保守的部分。通过利用特异性和简并引物的混合物来扩增多个HPV类型。Josefsson等人利用每个测定多达3种类型特异性探针，所述探针经设计用于检测来自不同HPV类型的El基因的部分。与Swan等人的測定法不同，Josefsson等人实时测量荧光的积累。Tucker 等人(Molecular Diagnosis 6 (I) : 39-47 (2001))描述了革巴向横跨 E6/E7联接处的保守区域的测定法。与Josefsson测定法相同,Tucker等人利用实时检测和类型特异性荧光探针。Tucker等人还利用多重PCR来在相同反应管中同时检测HPV靶序列和肌动蛋白或珠蛋白细胞基因座。HPV检测的ー个具体挑战是，存在许多临床关注的HPV类型。虽然用于HPV检测的多重測定法是已知的，但多重測定法受到用于检测的比色通道的数目限制。这些通道是不同波长的光(或波长范围或波段)。每ー个通道检测由发射特定通道波长的光的信号部分发射的信号。所检测的HPV类型的数目因而受到測定中不同的、可清楚检测的信号部分的数目限制。尽管开发了上述HPV測定法，但开发这样的多重測定法是有利的，所述测定法具有高度灵敏性和可重现性，并且与本领域公开的方法相比，需要減少的エ时。鉴于存在多种HPV类型，检测比測定法的检测通道更多的HPV类型是有利的。发明概述本发明涉及使用Taq-Man化学来同时检测比用于检测的通道更多的类型的HPV的实时PCR扩增。换句话说，在具有N个通道的測定中，被检测的HPV类型的数目为至少N+1。该测定法使用引物/探针组来检测所述测定法经构造用于检测其的每ー种HPV类型。在易于通过所述测定法检测的各种血清型中，包括例如HPV 33、39、51、56、58、59、66和68型。本领域技术人员将理解，可将本文中描述的探针/引物组与用于其它HPV类型(例如16、18和45)的其它引物/探针组组合。使用单个引物探针组来检测至少ー个类型。在使用Taq-Man测定法的PCR扩增的背景中，引物探针组为至少ー个正向引物、ー个反向引物和ー个探针。可利用一对引物探针组(其具有相对于彼此是简并的寡核苷酸序列)来选择至少两个类型。如本文中所使用的，“简并序列”为与不同的密切相关的类型的相同基因的相同基因座互补并且彼此具有少数序列变异(以使它们能够辨别所述两种类型)的两个寡核苷酸引物或探针。在本发明的一个实施方案中，简并引物探针组用于检测HPV 39和68型。引物/探针组靶向两种类型的E6基因上的相同基因座。靶长度为91个核苷酸并且示例于图I中。靶仅为完整E6基因的区段。HPV 39和68型的简并引物/探针组的靶为SEQ ID NO. 36。在优选实施方案中，两个探针的信号部分为，可作为CY5商购获得的花青染料标记物。在该实施方案中，非简并的引物探针组辨别HPV 51型。针对51型的引物/探针组也靶向E6基因，虽然在不同的基因座中。在优选实施方案中，用于该引物探针组的该探针的信号部分为FAM，其在下文中被特异性鉴定。在本发明的第二实施方案中，简并引物/探针组用于检测HPV 33和58型。所述引物/探针组靶向两种类型的E6基因上的相同基因座。靶长度为138个核苷酸并且示例于图2中。靶仅为完整E6基因的区段。针对HPV 33和58型的简并引物/探针组的靶为SEQ ID NO. 37。在优选实施方案中，用于两种探针的信号部分为FAM。在该实施方案中，非简并的引物探针组辨别HPV 59型。针对59型的引物/探针组也靶向E6基因，但不必是相同的基因座。在优选实施方案中，用于该引物探针组的该探针的信号部分为CY5，其在下文中被特异性鉴定。在本发明的第三实施方案中，简并引物/探针组用于检测HPV 56和66型。所述引物/探针组靶向两种类型的E6基因上的相同基因座。靶长度为79个核苷酸并且示例于图3中。靶仅为完整E6基因的区段。针对HPV 56和66型的简并引物/探针组的靶为SEQID NO. 38。在优选实施方案中，两种探针的信号部分为CY5。在该实施方案中，非简并的引物探针组辨别HPV 59型。针对59型的引物/探针组靶向E6基因。在优选实施方案中，用于该引物探针组的该探针的信号部分为CY5，其在下文中被特异性鉴定。在该实施方案中，用于HPV 59型的相同信号部分也用于HPV 56_66型。由于相同的染料位于相同的通道上，因此在该实施方案中，不能光学辨别HPV 59型与56_66 型。该实施方案涉及多重測定，其还利用针对另ー种HPV血清型的另ー个引物/探针组(简并的或有辨别カ的)(例如，针对HPV血清型33和58的简并引物/探针组)。用于该其它HPV血清型的信号部分不是CY5，并且以这样的波长发射，所述波长可检测地不同于Cy5的发射波长(例如FAM)。在其它实施方案中，用于HPV 59型探针的信号部分为FAM，其在光学上可与用于针对HPV血清型56和66的简并引物/探针组的CY5信号部分区分开。可选择的实施方案涉及测定法或探针组或试剂盒，其具有本文中描述的引物/探针组和简并引物/探针组的任何和所有组合。具体地，可将针对HPV血清型HPV 51或HPV59的任何引物/探针组与针对HPV血清型HPV 39_68、HPV 33_58和HPV 56_66的任何简并引物/探针组组合。特别涉及的是测定法或探针组或试剂盒，其将针对HPV 51的引物/探针组与针对HPV 39_68、HPV 33_58和HPV 56_66中的一个或多个的简并引物探针组组合。测定法或探针组或试剂盒，其将针对HPV 59的引物/探针组与针对HPV 39_68、HPV 33_58和HPV 56_66中的一个或多个的简并引物探针组组合。涉及这样的实施方案，其中用于探针的信号部分为相同的或不同的染料。由于涉及多重測定法，因此可将引物/探针组与经构造用于检测其它血清型的HPV的存在或不存在的其它引物/探针组组合。在其中用于简并引物/探针组的检测探针的信号部分与用于针对HPV血清型51或59的引物/探针组的信号部分相同的实施方案中，预期多重測定法可包括针对HPV的第4血清型(例如HPV 31、HPV 52、HPV 45等)的第四引物/探针组，并且预期第四引物/探针组具有与用于简并引物/探针组和HPV 51或59引物/探针组的检测子探针的信号部分不同的信号部分。此外，本文中还涉及多重測定法，其中在一个测定中组合两个简并引物/探针组。例如，在一个微孔中，可将用于检测HPV血清型33和58的存在的第一简并引物/探针组与用于检测HPV血清型56和66的存在或不存在的第二简并引物/探针组组合。在这些实施方案中，第一简并引物探针组的探针具有以这样的波长发射的信号部分，所述波长与用于第二简并引物/探针组的信号部分的发射波长可检測地不同。在该实例中，用于HPV血清型33和58的信号部分可以为FAM并且用于HPV血清型56和66探针的信号部分可以为CY5。除了上述信号部分外，探针还具有非荧光暗猝灭剂。适当的暗猝灭剂的一个实例为BHQ I (Biosearch Technologies),其适合于与FAM突光团一起使用。适当的粹灭剂的另ー个实例为BHQ 2 (Biosearch Technologies)，其适合于与CY5荧光团一起使用。信号部分的其它实例对于本领域技术人员来说是公知的并且在本文中未进行详细描述。如本文中所使用的，术语“引物”是指，当置于其中催化与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，能够用作沿着互补链的合成的起始点的寡核苷酸。这样的条件包括，在适当的温度下在适当的缓冲液(“缓冲液”包括作为辅因子，或影响离子強度、PH等的组分)中存在4种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂例如DNA聚合酶或逆转录酶。如本文中所使用的，寡核苷酸引物可天然存在于例如纯化的限制酶消化产物中，或可合成产生。引物优选为单链，以获得最大扩增效率。如本文中所使用的，“引物对”是指能够在核酸聚合酶存在的情况下參与核酸区段的PCR扩增以产生PCR扩增子的两条引物(正向引物和反向引物)。引物对包含的引物可以特异于相同的HPV基因，从而产生由来源于单个HPV基因的核苷酸序列组成的扩增子。或者，引物对包含的引物可以特异于在HPV基因组内彼此十分靠近的不同HPV基因，从而产生由来源于超过ー个基因的核苷酸序列组成的扩增子。如本文中所使用的，对于本发明的荧光团，“不同的成像光谱”意指，每ー个荧光团在特定测定中相对于使用的所有其它突光团以不同的发射峰(emission maxima)发射能量。具有独特发射峰的荧光团的使用允许同时检测，由特定測定中使用的多个荧光团中的每ー个发射的荧光能量。如本文中所使用的，对于本发明的寡核苷酸引物和探针，术语“有辨别カ的”意指，所述引物和探针对于单个HPV类型是特异性的。其包括特异于单个HPV类型但与其它HPV类型共有ー些同源性的HPV引物和探针。本发明的“有辨别カ的”引物和探针包括，在至少一个或更多个核苷酸上与其它HPV类型不存在3’同源性的那些寡核苷酸。在特定位置上对于特定HPV类型是独特的并且用于在比对中区分所述HPV类型与其它类型的此类残基称为“辨别碱基(discriminatory base)”。对于寡核苷酸，术语“有辨别カ的”不包括特异于超过ー种HPV类型的引物和探针，即，与超过ー种HPV类型共有完全同源性的引物和探针。在这一点上，本文中公开的简并引物/探针组不能区分针对其构造所述简并引物/探针组的HPV类型。例如，对于靶向HPV 39和68型的简并引物/探针组，针对HPV 39型的引物/探针组对于HPV 39型具有偏向性(相对于HPV 68型)，但不能区分HPV 39型与HPV 68型。因为简并引物/探针组不能区分HPV类型，因此探针优选具有相同的信号部分。由于測定法经构造用于确定这些HPV类型在聚集体中的存在或不存在，因此对于该目的，不必使用两个光学通道。此外，当将简并引物/探针组在单个微孔中与其它引物/探针组组合用于多重测定时，用于其它引物/探针组(有辨别カ的或没有辨别カ的)的信号部分可以相同或不同。用于测定的信号部分在很大程度上是设计选择的问题。当必需了解是否存在特定HPV类型吋，本领域技术人员将在相同微孔中使用相同的用于引物/探针组的信号部分。当了解这些类型中只要有一个类型存在就足够时，可在针对不同HPV血清型的引物/探针组上使用相同的信号部分。如本文中所使用的，“扩增子”是指，PCR反应的特定产物，其在核酸聚合酶和特定引物对存在的情况下通过PCR扩增包含核酸的样品而产生。扩增子可由来源于单个HPV类型的单个基因的核苷酸序列组成或扩增子可由来源于单个HPV类型的超过ー个基因的核苷酸序列組成。如本文中所使用的，“引物/探针组”是指，ー组与单个HPV类型的特定核苷酸序列杂交的寡核苷酸探针和成对寡核苷酸引物。所述寡核苷酸组由下列组成(a)与HPV类型的核酸序列的第一位置杂交的正向辨别引物；(b)与在所述第一位置下游的所述HPV类型的核酸序列的第二位置杂交的反向辨别引物和(c)用荧光团和猝灭剂标记的荧光探针，其与所述引物之间的所述HPV类型的核酸序列的位置杂交。换句话说，寡核苷酸组由ー组能够起始特异于单个HPV类型的扩增子的合成的特异性PCR引物和与所述扩增子杂交的荧光探针组成。如本文中所使用的，“多个”意指两个或更多个。如本文中所使用的，对于寡核苷酸组、寡核苷酸引物或寡核苷酸探针，“特异性杂交”意指，所述寡核苷酸组、引物或探针与单个HPV类型的核酸序列杂交。如本文中所使用的，“基因”意指，參与产生多肽链的核酸区段。其包括翻译序列(编码区)以及5’和3’非翻译序列(非编码区)，以及单独的编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。为了描述本发明的实施方案，HPV基因组具有多个基因例如，L1、L2和 E1、E2、E4-E7。如本文中所使用的，“基因座”是指，染色体上性状基因存在的位置。术语基因座包括特定基因的等位基因的任ー个。其还包括来自不同HPV类型的同源基因。例如，检测HPV16和HPV6中的LI基因的PCR测定法是单基因座測定法，尽管检测来自不同HPV类型的序列。相反地，例如，检测单个HPV类型的LI基因和El基因的测定法是多基因座测定法，即使检测单个HPV类型。如本文中所使用的，“ HPV”意指人乳头瘤病毒。“ HPV”为用于指任何类型的HPV(无论是目前已知的还是以后描述的)的一般术语。如本文中所使用的，“荧光团”是指在用激光、钨、水银或氙气灯或发光二极管激发后以具有确定的光谱的光的形式释放能量的荧光报告分子。通过荧光共振能量转移(FRET)的方法，从荧光团发射的光可激发其激发光谱与所述荧光团的发射光谱重叠的第二分子。荧光团的发射能量至另ー个分子的转移猝灭了所述荧光团的发射。第二分子称为猝灭剂分子。术语“荧光团”在本文中可与术语“荧光报告分子”互換使用。如本文中所使用的，“猝灭剂”或“猝灭剂分子”是指，当与包含荧光团的荧光探针连接时能够接收由荧光团发射的能量，从而猝灭荧光团的发射的分子。猝灭剂可以是以光的形式释放接收的能量的荧光猝灭剂，或以热的形式释放接收的能量的非荧光猝灭剂，并且可沿着探针的长度在任何位置连接。如本文中所使用的，“暗猝灭剂”是指非荧光猝灭剂。如本文中所使用的，“探针”是指，因探针的至少ー个序列与靶区域或待检测的区域中的序列的互补性而能够与靶核酸中的序列形成双链体结构的寡核苷酸。术语“探针”包括连接或未连接荧光团和猝灭剂分子的上述寡核苷酸。术语“荧光探针”是指包含荧光团和猝灭剂分子的探针。如本文中所使用的，“ FAM”是指荧光团6-羧基-荧光素。本发明的其它实施方案使用结合HPV的E6/E7基因区域的不同的寡核苷酸序列。本文中描述的寡核苷酸具有能够结合靶核酸序列(及其互补链)的序列。还可单独地或组合地使用本文中描述的寡核苷酸，以通过扩增HPV E6/E7基因的核酸序列来帮助检測。在一个实施方案中，探针经设计用于对基因的靶部分进行Taq-Man >实时pcr測定。下文中描述了用于Taq-Man 实时PCR測定的3个简并探针组的实例(根据其寡核苷酸序列进行描述)。特别地，在其中第一简并引物/探针组是针对HPV 39和68型的第一实施方案中，偏向于HPV 39型的引物/探针组为SEQ ID N0S:1、3和5。偏向于HPV 68型的引物/探针组为SEQ I D NO. 2、4和6。SEQ IDNOS I和2都是Taq-Man正向引物并且彼此是简并的。SEQ ID NOS 3和4都是Taq-Man反向引物并且彼此是简并的。SEQ ID NOS 5和6都是Taq-Man探针并且彼此是简并的。针对HPV 33和58型的简并引物/探针组为SEQ IDNO. 7-16，其包括两组备选的反向引物序列，SEQ ID NO. 13和14是优选的。针对HPV 56和66型的简并引物/探针组为SEQ ID NO. 17-23。选择或辨别HPV血清型51的引物/探针序列为SEQ ID NO. 24-29。选择或辨别HPV 59型的引物/探针序列为SEQ ID NO. 30-35。下面表I中列举了上述所有序列。在下面的表中，〃D〃为检测子，〃FP〃为正向引物，〃RP〃为反向引物。表ISBQ IP NO. 名称_ mm.__寡核苷酸序列5#-3,_ISBQ ID NO: I GR39-68B6 FP2 iP￥ 39 16 Ta^Man CCACfAGCTCCATGCCMTC I__(39)正向引物SEQ ID NO: 2 GR39-6816 FP2 HPV 68 16 Tai-Mtn CCATfA6CTCCAT0CCMTC I__(68)正向引物SBQ ID NO: 3 GR39—6麵6 1P4 HPV 39 16 Tti-Msa CfAAfGTAGTTGCATACACCGi I(39)反向引物_ ISEQ ID NO; 4 GR39-68I6 1P4 IPf 68 16 Ttf-Maa CfAAfGTTefTGCATACACCGA I __(68)_反向引物__SEQ ID NO: 5 GR39-68D5 HPV 39 B6 Taq-Maii 6AGTAATATCGTAGCTCCCGTATTTT(39)探针JSBQ ID NO: 6 GR39.68D5 HPV 68 E6 Taq-Man GACTAATATCGTAGTTCCCGTATTTtI
__(68)_ 探针__
SBQ ID NO: 7 GR33-58FP2 HPV 33 16 Taq-Man TGTGCCAAGCATTGGAGACA I_[m_I正向引物__I

用于检测人乳头瘤病毒(HPV)的多个血清型的实时Taq-Man PCR测定法，其中检测的血清型的数目超过用于检测的比色通道的数目。将生物学样品与3个寡核苷酸引物/探针组组合，以便探针和引物与靶序列退火。每一个引物/探针组至少对于生物体的特定血清型是偏向性的。第一和第二引物/探针组彼此是简并的。第三引物/探针组相对于第一和和二引物/探针组不是简并的并且辨别第三血清型。第三引物/探针组具有以这样的波长发射信号的信号部分，所述波长与由简并引物/探针组中的探针的信号部分发射的波长相同或不同。扩增和检测靶序列(如果存在的话)。

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