专利名称：α-1蛋白酶抑制剂组合物、方法和试剂盒的制作方法API缺陷是相对常见的遗传病，其使受累个体易感肝脏疾病和/或肺气肿。称作蛋白酶抑制剂类型Z (PiZ)的最常见类型API缺陷作为常染色体隐性性状遗传，并且在大多数北欧和北美人群中大约1700个活产新生儿中有一例受影响。PiZ突变是导致单氨基酸替代的单核苷酸替代(谷氨酸342变成赖氨酸)。人API具有394个氨基酸，一个半胱氨酸残基，和3个糖侧链，总分子量为52kDa。单活性中心环(RCL)位于位置358-359上的Met-Ser序列。API的三级结构包含8个确定的α-螺旋(A-H)和3个大的β-折叠(A-C)。据认为，舍平类(serpins)通过不可逆的“自杀-底物”机制起作用。当舍平被蛋白酶切割时经历构象改变，由此RCL被切割并插入到Αβ-折叠的中心中，并且蛋白酶转位到分子的远端。该结构转变导致舍平的稳定化和蛋白酶三级结构的全面变形，这使其催化结构失活。据信，API的生物学活性会受例如化学修饰影响，包括分子间或分子内聚合作用、氧化作用、复合体形成和/或被非特异性蛋白酶切割。据认为，API的主要生理功能是抑制中性白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3。PiZ API缺陷个体中所产生的API在功能上是有活性的，尽管它们的特异性弹性蛋白酶抑制能力会降低。API合成的主要位点在肝脏，然而，它还在肝外细胞类型，包括巨噬细胞、肠上皮细胞和肠帕内特细胞中合成。API缺陷中肺损伤的发病机制是因为可利用的API活性的显著减少。已经发现，API构成超过90%的肺泡灌洗液内中性白细胞弹性蛋白酶抑制剂活性。因此，很明显，在许多API缺陷个体中所见的破坏性肺疾病是因为肺内弹性蛋白酶与API之间净平衡的混乱。反过来，中性白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3的不受抑制的活性导致肺结缔组织完整性的缓慢破坏。结缔组织的这种破坏导致过度膨胀和肺回缩力的降低，这导致呼出的空气流减少。吸烟因为引起API存在下的氧化失活而使问题恶化。当前，对于具有API缺陷相关病理学的个体的治疗选择是有限的。与API缺陷相关的肝脏疾病已经通过原位肝移植治疗。已经讨论了替换缺陷的API基因的体细胞基因治疗，但是仍没有成功使用。因此，仍然需要稳定的且提供在向受试者施用后具有所希望的API血浆生物利用率水平的API组合物。
本文在一个方面中提供组合物，包含(a) α 1_蛋白酶抑制剂(API);和(b)至少一种氨基酸。 在另一个方面中，本发明提供用于制备组合物的方法。在其它方面中，提供包含组合物的试剂盒。图I是显示在实施例I中表I中所示液体API制剂的聚集特性的图。图2是显示包含丙氨酸、蔗糖、或者蔗糖/丙氨酸的API制剂的聚集特性的图。图3是显示包含丙氨酸、甘露醇、或者甘露醇/丙氨酸的API制剂的聚集特性的图。图4是显示包含丙氨酸、蔗糖、或者海藻糖的API制剂的聚集特性的图。图5是显示氨基酸浓度对在40°C下孵育I周后API制剂聚集影响的图。图6是显示氨基酸浓度对在40°C下孵育2周后API制剂聚集影响的图。图7是显示包含丙氨酸和包含或不包含不同浓度氧清除剂的API制剂的聚集特性的图。图8是显示实施例6中所述API制剂在5 °C下的效能特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图9是显示实施例6中所述API制剂在5°C下浊度(NTU)特性的图“甘氨酸”指制剂I (API (50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图10是显示实施例6中所述API制剂在5°C下比活性特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图11是显示实施例6中所述API制剂在5°C下脱酰胺作用特性的图“甘氨酸”指制剂I (API (50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图12是显示实施例6中所述API制剂在5°C下聚集增加特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图13是显示实施例6中所述API制剂在5°C下聚集特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图14是显示实施例6中所述API制剂在5°C下寡聚体水平特性的图“甘氨酸”指制剂I (API (50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图15是显示实施例6中所述API制剂在5°C下单体水平特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图16是显示实施例6中所述API制剂在25°C下效能特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图17是显示实施例6中所述API制剂在25 °C下NTU特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图18是显示实施例6中所述API制剂在25°C下比活性特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图19是显示实施例6中所述API制剂在25°C下脱酰胺作用特性的图“甘氨酸”指制剂I (API (50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图20是显示实施例6中所述API制剂在25°C下聚集增加特性的图“甘氨酸”指制剂I (API (50mg/ml)/甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图21是显示实施例6中所述API制剂在25°C下聚集特性的图“甘氨酸”指制剂 I (API (50mg/ml)/ 甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂 2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸 / 蔗糖”指制剂 3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且 “NaCl ” 指制剂 4 (API (50mg/ml) /NaCl (250mM))。图22是显示API制剂在25°C下寡聚体特性的图。“甘氨酸”指制剂I (API (50mg/ml) /甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸/蔗糖”指制剂3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制剂4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。
图23是显示API制剂在25°C下单体特性的图。“甘氨酸”指制剂I (API (50mg/ml) /甘氨酸(250mM));“丙氨酸”指制剂2 (API (50mg/ml)/L-丙氨酸(250mM))丙氨酸/蔗糖”指制剂3(API(50mg/ml)/L-丙氨酸(125mM)/蔗糖(125mM));并且“NaCl”指制剂4(API(50mg/ml)/NaCl(250mM))。图24是pH和蛋白质浓度对于在40°C下API溶液中I周、2周和3周聚集的2D-等值线图。图25是40°C下I周、2周和3周的API溶液的pH和聚集相互作用图。图26显示pH对40°C下I周、2周和3周的API溶液中聚集的影响。图27显示蛋白质浓度对40°C下I周、2周和3周API溶液中聚集特性的影响。
发明详述本发明基于这样一个发现，即通过在组合物中还包含一种或更多种氨基酸制备相对稳定的包含API的组合物。在具体实施方案中，本发明包括适于提供API用于向受试者施用以起治疗或者预防作用的稳定的、包含API的药物组合物。与API相关(例如低于正常血浆API水平)以及本实施方案对其特别有用的病症和疾病的非限定性实例包括但不限于，肺疾病例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)(例如肺气肿)、肝疾病、血管疾病(例如颅内动脉瘤、动脉肌纤维发育不良、严重出血病症和高血压)、脂膜炎、眼疾病(例如前葡萄膜炎)、系统性坏死性血管炎和Wegener肉芽肿病。I.组合物在一个方面中，本发明提供一种组合物，包含(i)API ;和(ii)至少一种氨基酸。在一些实施方案中，组合物由API和至少一种氨基酸组成或者基本上由API和至少一种氨基酸组成。本发明的组合物可以以相对纯的形式提供。例如，在一些实施方案中，组合物可表征为制药级。组合物可以是固体、液体或者半固体形式。例如，组合物可以是液体制剂，包括但不限于水性溶液、水性混悬液、油混悬液等。备选地，组合物可以是冻干制剂、干粉末、固体颗粒等。其它实例包括但不限于胶体、乳剂、凝胶和软膏。在一个实施方案中，组合物是液体制剂，优选水性溶液。在另一实施方案中，组合物适宜制药用途，例如包含药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。在一个实施方案中，组合物是包含API、氨基酸和药学上可接受的载体的药物组合 物。如本文所使用“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何的和全部的溶剂、分散介质、包衣等。载体类型可以基于预期施用途径选择。在一些实施方案中，载体适宜通过但不限于静脉内、吸入、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内、或经皮方式的途径施用。药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液和用于制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在一些实施方案中，组合物是无菌的并且在一种或更多种制造和储存条件下是稳定的。组合物可以配制成为溶液、微乳剂、脂质体、或者其它有序结构。例如，无菌的可注射溶液可以通过过滤除菌制备。可以通过将API混合到包含分散介质的无菌媒介物中制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其优选从先前无菌过滤溶液提供包含API和氨基酸加上任何额外期望成分的粉末的组合物。示例性的稀释剂(例如用于组合物的稀释、重构等)可以包括，但不限于，无菌水、注射用制菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐溶液和Ringer溶液或右旋糖溶液。稀释剂任选包含防腐剂。所采用的防腐剂的量通过评价不同防腐剂浓度与API的兼容性和防腐剂功效测试确定。吸入治疗包括向呼吸道施用气溶胶形式的药物。气溶胶递送基于这样的概念，即如果分子是生物可利用时，则向占肺上皮95%的肺深部区(肺泡)的递送可以显著增强蛋白质跨上皮细胞膜的转运。液体气溶胶可以通过将API溶液喷雾产生。备选地，固体颗粒可以是从计量吸入器施用的在推进剂中混悬的粉末形式，或者仅作为从干粉末吸入器施用的粉末。例如，可以通过从溶液冻干(冷冻干燥)API、然后将冻干的药物磨成或研成用于肺施用的期望粒度大小分布来制备固体颗粒气溶胶。另一技术包括喷雾干燥，它是利用来自热气流(通常是空气)的热将通过连续液体给料的喷雾所产生的分散微滴蒸发的脱水过程。使用这些方法，包含API的组合物可以干燥成细颗粒，优选含有例如充当水替代剂的适宜的赋形剂类型和量。增压计量吸入器是目前本领域众所周知的。可以使用适宜向患者肺或鼻子应用药物的任何增压计量吸入器。可以选择气溶胶制剂和计量阀门以提供治疗或者预防有效量的API。A. API术语“API”，如本文所使用，旨在是广义的，除非另外明确说明。该术语指API的所有天然存在的多形体。该术语还包括API的功能片段、包含API的嵌合蛋白质或者其功能片段、通过API的一个或更多个氨基酸的相似替代所得到的同源物、和物种同源物。该术语还指其为重组DNA技术产物的所有API多肽，包括其为转基因技术产物的API。例如，编码API的基因可以以如此的方式插入到编码乳乳清蛋白的哺乳动物基因中，使得DNA序列在乳腺中表达，如例如美国专利号5，322，775中所述，其关于产生蛋白质性质化合物的教导通过引用并入本文。该术语还指通过本领域已知的方法，诸如例如固相肽合成化学合成的所有API蛋白质。该术语还指从血浆制备的API。该术语还指可以商业上得到的API。API可以对应于人或者非人API。在一个实施方案中，API是血浆来源的API。在另一实施方案中，API从Cohn级分IV-I糊制备。在另外的实施方案中，API从白蛋白耗竭的血浆级分、Cohn V沉淀物、或者预纯化的API制备级分制备。美国专利号6，974，792关于制备API的方法的教导通过引用并入本文。
在另外的实施方案中，API是重组API。API的氨基酸和核苷酸序列和/或重组API的产生描述于例如美国专利号 4，711，848 ;4，732，973 ;4，931，373 ;5，079，336 ;5，134，119 ；5，218，091 ;6，072，029 ；和 Wright 等，Biotechnology, 9 :830 (1991)；以及 Archibald 等，PNAS，87 :5178(1990)中，每一文献关于API序列、重组API、和/或API的重组表达的教导通过引用并入本文。在一个实施方案中，组合物表征为包含具有大于90%纯度的API。在另外的实施方案中，API具有大于95%，优选至少大约99%的纯度。在一些实施方案中，组合物中所有API的至少大约50 %，示例性地大约50 %至大约100 %，大约60 %至大约90 %，大约70 %至大约80%是活性的API。在一个实施方案中，组合物包含治疗有效量的API。“治疗有效量”指在需要的剂量和时间阶段有效地达到期望治疗结果(诸如例如，与先天性API缺陷相关的肺气肿的减少或者抑制)的量。API的治疗有效量会根据因素例如疾病状态、年龄、性别、和个体受试者体重、和API引起受试者中期望反应的能力而改变。治疗有效量还可以是其中API的治疗有益效果大于任何毒性或有害作用的量。在另外的实施方案中，组合物包含预防有效量的API。“预防有效量”指在需要的剂量和时间阶段下有效实现期望预防结果(诸如例如，防止或者抑制与API先天性缺陷相关的肺气肿)的量。预防有效量可以如上对于确定治疗有效量所述确定。当确定API的治疗或预防有效量时要考虑的一个因素是接受治疗的受试者生物腔室中，诸如例如受试者下呼吸道或者上皮内衬液(ELF)中表达的功能活性API的浓度。当确定API的治疗或者预防有效量时还考虑的另一因素是API的药理学(例如药物动力学)。API的药物动力学指受试者血液中的API浓度或者水平。血液中API水平的药物动力学参数或量度包括曲线下面积(AUC)、Cmin(即波谷)、和Cmax。AUC是在固定的给药阶段内(例如8、12和24小时)受试者血液内API的总暴露。Cmin(即波谷水平)是在固定的给药阶段期间API的最低血液水平。Cmax是在固定的给药阶段内受试者血液内达到的API最高或者峰值水平。在一个实施方案中，施用的治疗或者预防有效量足以达到或者维持高于靶阈值水平的API血液(例如血浆)波谷水平。在一个实施方案中，靶阈值水平是至少大约10mg/dL，示例性地大约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、和 200mg/dL。在另一实施方案中，治疗或预防有效量足以达到或者维持至少大约50mg/dL的API血液波谷水平。在另外的实施方案中，API的治疗或预防有效量足以维持至少大约80mg/dL的血液API波谷水平。在一个实施方案中，组合物中API浓度是至少大约O. lmg/ml，示例性地至少大约O. 1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、和 1000mg/ml。在一个实施方案中，组合物中API的比活性是至少大约O. 05mg活性API每mg总蛋白，示例性地，至少大约O. 05,0. I、O. 2mg、0. 3mg、0. 4mg、0. 5mg、0. 6mg、0. 7mg、或更多活性 API 每 mg 总蛋白。在一些实施方案中，组合物中包含的API的浓度以重量百分比计(w/v)为至少大约I 示例性地大约I至大约60%,大约5至大约55%,大约10至大约45%,大约20至大约 30% (w/v) ο B.氨基酸应当理解，本文明确描述的氨基酸仅是为了说明的目的并且不旨在对可以根据本发明使用的氨基酸进行限制。本文没有明确描述的其它氨基酸可以基于所观察到的物理和化学特性容易地分类。此外，本文所描述的一些氨基酸已经就遗传编码的氨基酸而言进行了例证，然而，氨基酸无需局限于遗传编码的氨基酸，而且还可以包括遗传上非编码氨基酸。例如，氨基酸还可以包括天然存在的非编码氨基酸和合成的氨基酸(例如β-丙氨酸、羟脯氨酸)。还考虑了 L-对映体氨基酸(L-氨基酸)和D-氨基酸以及游离氨基酸形式和/或生理可接受盐形式和/或其混合物。表I列出了氨基酸的一些非限定性实例。表I.氨基酸
氨基酸~三字母码单字母码
甘氨酸 Gl^G
丙氨酸 Al^A
缬氨酸 ΠV
亮氨酸L
异亮氨酸I
甲硫氨酸 MetM
苯丙氨酸 PheF
色氨酸 TrpW
脯氨酸P
丝氨酸S
苏氨酸 ThiT半胱氨酸C
酪氨酸 TyrY
天冬酰胺 AsnN
谷氨酰胺Gl^Q
赖氨酸 LysK
精氨酸R
组氨酸 Hi^H


本发明提供包含API和至少一种氨基酸的组合物，特别是包含氨基酸的液体API制剂，以及与其相关的方法和试剂盒。当这些氨基酸掺入到API组合物中时使得API制剂稳定。