专利名称：用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光pcr引物、探针及其试剂盒的制作方法自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典O010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠腺病毒和脱脚病病毒均属于二类，目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。小鼠腺病毒(Murine adenoviruses，简称MADV)在小鼠群中多呈隐性感染，但也可引起致死性疾病。这类病毒的带毒期和排毒期均较长，严重影响小鼠健康。小鼠是小鼠腺病毒的自然宿主，实验小鼠在笼内主要经粪便和尿液接触传播。不同毒株MADV，其毒力差异很大，MADV对不同年龄小鼠的易感性也不相同，临床表现多种多样。自然流行多由于感染 FL株引起，病鼠表现弓背、被毛粗糙、食欲下降等症状，新生乳鼠可死亡。K87株感染新生乳鼠和成年鼠均不发病，只是经粪便不断向外排毒并产生高滴度的抗体。裸鼠也可自然发生 MADV感染，但株型未定。用FL株接种乳裸鼠，可造成十二指肠出血和致死性消耗性疾病。小鼠脱脚病病毒也叫鼠痘病毒(poxvirus of mice，MPV)，能引起鼠痘。鼠痘多呈爆发性流行，致死率较高，常造成小鼠全群淘汰，危害极大。临床表现以四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征，故鼠痘病毒又称脱脚病病毒(ectromelis virus，以下将此病毒简称为EV)。该病在世界各地的实验室鼠群中广泛流行，在我国鼠群中呈散发性流行。药典规定的鼠源病毒检测方法有细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。 这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。而目前发展十分成熟的实时荧光PCR技术(Real-time FluorencePolymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。 Real Time PCR于1996年由美国Appliedbiosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过 Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定性定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团所发射的荧光信号被淬灭基团吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’_3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定性定量分析。实时荧光PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定性/定量，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。但迄今为止，使用多重实时荧光PCR技术同时对小鼠腺病毒和脱脚病病毒进行检测方面还未见有报道，同时一次性检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒更经济、省力、 快速。
为了解决现有小鼠病毒检测方法的不足，本发明提供了一种同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物、探针及其试剂盒，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。本发明的一个目的是提供用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物，其中，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO 1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO 2的下游引物组成的一对寡核苷酸；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQID NO 3的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO :4的下游引物组成的一对寡核苷酸。本发明的另一个目的是提供一种与上述引物配合使用的探针，其中，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO :5的核苷酸序列；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针具有序列表中的SEQ IDNO 6的核苷酸序列。其中，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针与特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针均为检测病毒的探针，后述提及处可简称为检测探针。优选地，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、ROX中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse或BHQl或BHQ2。优选地，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针与特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针可具有相同或不同的荧光报告基团。优选地，两种病毒的探针5’端均为FAM标记，3’端为TAMRA标记。优选地，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针5’端为JOE标记，3’端为TAMRA标记。本发明人设计了多对PCR引物和探针，经过长期大量的实验从众多引物对中筛选出了由上述上游引物和下游引物组成的引物、探针。小鼠腺病毒、脱脚病病毒的扩增目的片段大小分别为131bp、119bp。上述引物分别对小鼠腺病毒/脱脚病病毒具有高度的保守性，且与小鼠基因组不具有显著的同源性，使用上述引物、探针进行PCR扩增，可实现准确定性、定量检测。本发明的再一个目的是提供一种同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述提及的弓I物或探针。优选地，每个试剂盒中两种病毒的引物探针混合液的体积比为1 1;每种病毒引物探针混合液中，优选将浓度均为ΙΟμΜ的引物、探针按照上游引物下游引物探针体积比为111的比例混合成引物探针混合液。优选地，所述试剂盒还包括内标DNA标准品、内标DNA标准品的扩增引物和探针。 后述，所述内标DNA标准品的扩增引物和探针分别简称为内标引物、内标探针。优选地，所述内标DNA标准品为含序列表中SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的ρΤ easy-3质粒；所述内标DNA标准品的扩增引物是由具有序列表中的SEQ ID NO :8的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO :9的下游引物组成的一对寡核苷酸，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO 10的核苷酸序列。优选地，所述内标DNA标准品的浓度为2X IO7Copies/μ 1。优选地，所述内标探针与两种病毒检测探针共三种探针分别由相同的荧光基团标记或不同的荧光基团标记，但是至少内标探针的的荧光基团不同于检测探针的荧光基团。 优选地Taqman探针为Taqman-MGB探针BHQ1/BHQ2等。优选地，所述内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记，两种病毒的检测探针 5，端均为FAM标记，3，端为TAMRA标记。优选地，所述内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针5，端为JOE标记，3，端为TAMRA标记。 优选地，所述试剂盒还包括阳性DNA标准品。优选地，所述阳性DNA标准品的浓度为 2 X IO7Copies/μ 1。优选地，所述阳性标准品为含小鼠腺病毒和脱脚病病毒扩增目的片段的序列的 PMD18-T重组质粒。当所述试剂盒含有内标DNA标准品、内标引物、内标探针时，本试剂盒可进行定性或相对定量检测；当所述试剂盒只含有阳性DNA标准品时，可进行绝对定量检测；如所述试剂盒同时含有内标DNA标准品、、内标引物、内标探针和阳性DNA标准品，则本试剂盒不仅可进行绝对定量检测，同时因使用内标DNA标准品从提取步骤(而不只是荧光定量PCR过程)开始衡量了整个方法的可行性，实现了对整个反应体系进行质控。优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、阴性质控品、空白对照。其中，PCR扩增试剂为 2XTaqman PCR Mix。本发明的又一目的是提供一种使用上述提及的试剂盒同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测方法，其中，所述方法所述实时荧光PCR的退火温度为60 "C。优选地，本发明提供一种上述提及的试剂盒用于同时检测鼠源生物制品中小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测方法。优选地，所述多重实时荧光PCR的反应条件为50°C，2min ;95°C，IOmin ;95°C， 15s，60°C，lmin，共 40 个循环。优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，将所述内标DNA标准品十倍稀释成不同浓度的内标定量标准品，以所述内标定量标准品作为模板进行实时荧光PCR检测，得到内标标准曲线。优选地，所述方法还包括将所述阳性DNA标准品十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行多重实时荧光PCR检测，得到检测病毒的标准曲线。使用本发明试剂盒检测时，可以将进行两种病毒的单管同时检测，也可将异管同时检测。单管同时检测时优选扩增两种病毒和内标的探针均具有不同的荧光报告基团。优选地，所述内标探针5’端为VIC标记，3’端为TAMRA标记，特异性地扩增小鼠腺病毒的专用探针5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记；特异性地扩增小鼠脱脚病病毒的专用探针5’ 端为JOE标记，3，端为TAMRA标记。 本发明的还一个目的是提供上述提及的弓I物或探针、试剂盒或检测方法在检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒残留时的应用。优选地，本发明的目的是提供上述提及的引物或探针、试剂盒或检测方法在检测鼠源生物制品中小鼠腺病毒和脱脚病病毒残留时的应用。与现有检测方法相比，本发明提供的同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR检测试剂盒及方法具有以下优点1、简单快速现有的药典小鼠腺病毒检测方法为细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验，从生物学效应角度检测生物制品中小鼠腺病毒的潜在感染，需时长(1 4周时间)，而本发明从核酸角度对腺病毒和脱脚病病毒进行联合检测，操作更为简便快速，只需要6小时左右即可出结果，且对操作实验室环境要求不高，规避了以前抽检产品可能产生的漏洞，可在企业实现批批检测，进一步提高了生物制品质控质量；2、灵敏度高现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠腺病毒的潜在感染，其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理，残留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小，而本发明从病毒核酸角度进行检测，相对前述药典规定方法而言，提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光PCR同时检测鼠源生物制品中腺病毒和脱脚病病毒时，不仅可定性也可以准确定量，目标DNA在IO2 IO7浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达到20copies/y l(100copies/reaction)；3、重复性、准确性和特异性本发明中的引物和探针分别根据小鼠腺病毒、脱脚病病毒的同源性序列设计，设计时充分考虑各引物间的退火温度，是经筛选后得到的特异性引物和探针，且与小鼠基因组无同源性，检测特异性强，重复性好；4、回收率高本发明实时荧光PCR方法回收率均达到了 50%以上，是一种理想的可替代现有药典规定的检测方法；5、对整个反应体系进行质控使用内标DNA标准品从提取步骤(而不只是荧光定量PCR过程)开始衡量了整个方法的可行性，大大提高了本发明的准确性。 图1为多重实时荧光PCR检测小鼠腺病毒时的定量曲线；图2为多重实时荧光PCR检测小鼠脱脚病病毒时的定量曲线；图3为多重实时荧光PCR检测小鼠腺病毒时的标准曲线；图4为多重实时荧光PCR检测小鼠脱脚病病毒时的标准曲线。
本发明公开了一种用于同时检测小鼠腺病毒和脱脚病病毒的多重实时荧光PCR引物、探针，分别如序列表中SEQ ID NO1～6所示的寡核苷酸。含有上述引物及探针的多重实时检测试剂盒可一次性联合检测小鼠腺病毒和小鼠脱脚病病毒，具有快速简单、灵敏度高、特异性强且回收率高的优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。