专利名称：黑猩猩腺病毒疫苗载运体的制作方法腺病毒(Ads)包含在两栖动物、禽类和哺乳动物中发现的、具有无包被的二十面体衣壳结构的双链DNA病毒的大家族(Straus，Adenovirus infections in humans.In The Adenoviruses.451-498，1984；Hierholzer et al.，J.Infect.Dis.，158804-813，1988；Schnurr andDondero，Intervirology.，3679-83，1993；Jong et al.，J Clin Microbiol.，373940-39451999)。与逆转录病毒相比，腺病毒可以转导几个哺乳动物物种的许多细胞类型，包括分裂和非分裂细胞，而不整合到宿主细胞的基因组中。一般而言，腺病毒DNA一般是非常稳定的并保持游离(例如，染色体外)，除非发生了转化或肿瘤发生。此外，在容易进行临床级组合物的制药规模生产的良好定义的生产系统中，腺病毒载体可以繁殖到高产量。这些特征和它们被良好表征的分子遗传学，使得重组腺病毒载体成为用作疫苗载运体(carrier)的好的候选者。一般地，重组腺病毒载体的生产依靠使用能够补足腺病毒基因产物的功能的包装细胞系，所述功能已经被删除或被工程化为无功能的。目前，两种良好表征的人类C亚群腺病毒血清型(即，hAd2和hAd5)被广泛地用作大多数用于基因治疗的腺病毒载体的病毒主干的来源。也已经测试了复制缺陷性人类腺病毒载体作为用于递送各种免疫原的疫苗载体，所述免疫原来源于各种传染原(例如，病毒、寄生虫或细菌性病原体)和肿瘤细胞，包括肿瘤相关抗原(TAA)。在实验动物(例如，啮齿动物、犬和非人灵长类)中进行的研究表明，携带转基因的重组复制缺陷性人类腺病毒载体引发了针对转基因产物的体液和细胞介导的免疫反应，所述转基因编码来源于人类乳头状瘤病毒(HPV-16)的E6和E7癌蛋白(He，Z et al.，(2001)Virology，2703583-3590)、狂犬病病毒糖蛋白(Xiang，Z.et al(1996)Virolgy，219220-227)、Plasmodium falciparum的环子孢子蛋白Rodriguez E.etal.(1997)J.Immunol.1581268-1274)以及其他异源抗原的免疫原。一般而言，研究人员已经报道了，通过使用利用预计可引发免疫反应的高剂量重组腺病毒载体的免疫方案；或通过使用采用腺病毒载体的连续施用的免疫方案，所述腺病毒载体来源于不同血清型但携带相同的转基因产物用作强化免疫，在非人类实验系统中成功地使用人类腺病毒载体作为疫苗载运体(Mastrangeli，et al.，Human Gene Therapy，779-87(1996)。然而，预计的是，来源于遍在的人类血清型，例如2和5型的疫苗载运体将在人类群体中遇到先存的(pre-existing)体液和细胞免疫。因而，尽管已经在采用啮齿动物、犬和非人灵长类宿主的实验系统中成功地使用复制缺陷性重组人类腺病毒作为疫苗载运体，预计人类的先天和适应性免疫会显著地限制这些血清型作为疫苗载运体的实用性。这种预期是基于这一事实，包括2型和5型的C亚群腺病毒感染在人类群体中是地方性的。结果，作为自然感染的结果，大多数人类在生命的头五年内血清转变。因而，来源于在人类中天然感染并复制的病毒的载体，可能不是用作疫苗载运体的最优候选者。与使用人类腺病毒衍生载体相关的另一个问题是，用于繁殖重组病毒的生产方法产生被有复制能力的腺病毒(RCA)污染的载体成品的风险。这是起因于，来自重组载体和存在于E1补足辅助细胞系，例如人类293(Graham，F.L.et al，(1977)J.Gen.Virol.3659-72.)细胞中的腺病毒基因的重叠序列之间的同源重组。在为用于临床试验制备的载体成品中RCA的存在构成了安全风险，因为它可能促进复制缺陷性病毒的流动和传播。缺陷病毒的传播可能加重宿主免疫应答，并引起其他有害的免疫病理后果。(Fallux，F.J.，et al.HumanGene Therapy 91909-1917(1998)。因此，食品和药品管理局(FDA)和其他管理机构已经颁布了指导原则，其建立了对可能存在于用于临床用途的载体制品中的RCA水平的限制。加以RCA限制的意图是确保患者有限地暴露于用于临床试验的组合物中的复制性腺病毒。因而，存在着开发适用于哺乳动物宿主的腺病毒疫苗载运体的持续的需求，其是易于操作、可经受制药规模的生产和长期储存、在人类补足细胞系中能以高水平复制、高度的免疫原性、没有与人类腺病毒的常见血清型交叉反应的中和B细胞表位、符合管理机构颁布的安全RCA标准、并且其符合在适合人类使用的激发/强化(prime/boost)方案中使用。发明概述本发明涉及来源于黑猩猩腺病毒的重组复制缺陷性腺病毒载体和用于在人类E1表达细胞系中产生黑猩猩腺病毒载体的方法。本发明还提供了产生适用于人类的临床级载体成品的方法，和使用所公开的载体作为疫苗载运体来引发保护性和/或治疗性免疫反应的方法。本发明进一步提供了使用本发明的重组腺病毒来制备疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物被设计以递送编码免疫原的转基因和指导编码免疫原的转基因的表达。在一个实施方式中，本发明考虑使用所公开载体作为疫苗载运体用于疫苗的施用，所述疫苗包含编码来源于传染原的免疫原的转基因。在第二种实施方式中，本发明考虑使用所公开的载体来制备和施用癌症疫苗。在特定的实施方式中，本发明考虑制备和施用包含编码TAA的转基因的癌症疫苗。在一个方面，本发明公开了五种黑猩猩腺病毒(ChAds)的完整基因组序列，在此称为ChAd3(SEQ ID NO1)(附图5A-5K)、ChAd6(SEQ ID NO2)(附图6A-6K)、CV32(SEQ ID NO3)(附图7A-7K)、CV33(SEQ ID NO4)(附图8A-8K)和CV23(SEQ ID NO5)(附图9A-9J)。
ChAd3和ChAd6是根据在此公开的方法分离的新的腺病毒。ChAd3和ChAd6的基因组长度分别是37741和36648个碱基对。ChAd3六邻体基因(SEQ ID NO41)包含SEQ ID NO1的核苷酸(nt)19086-21965(不包括终止密码子)，ChAd3纤维基因(SEQ IDNO42)包含SEQ ID NO1的nt 32805-34487(不包括终止密码子)。ChAd6六邻体(hexon)基因包含SEQ ID NO2的nt 18266-21124(SEQID NO43)(不包括终止密码子)，它的纤维基因(SEQ ID NO44)包含SEQ ID NO2的nt 32218-33552(不包括终止密码子)。根据从全长六邻体肽的多重序列比对得出的序列同源性，ChAd3被分类入人类C亚群，ChAd6被分类入人类E亚群。
CV32、CV33和CV23腺病毒的基因组的长度分别是36,606、36,535和32,020个碱基对。CV32(Pan 6)(ATCC N.VR-592)、CV33(Pan7)(ATCC N.VR-593)和CV23(Pan 5)(Esoterix Inc.，)全都被确定为与人类Ad4(hAd4)(E亚群)相关(Wigand，R et al.Intervirilogy1989，301-9)。然而，根据六邻体序列比对，随后将CV32表征为与类似于hAd4相比更接近地类似于人类D亚群成员。
在第二个方面，本发明提供了根据在此公开的方法分离的21种其他黑猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82)的纤维基因和六邻体基因的核苷酸序列。
ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19的纤维基因核苷酸序列分别在附

图10-19中列出，在此称为SEQ ID NO6-15(SEQ ID NO6，ChAd20)；(SEQ ID NO7，ChAd4)；(SEQ ID NO8，ChAd5)；(SEQ ID NO9，ChAd7)；(SEQ ID NO10，ChAd9)；(SEQ ID NO11，ChAd10)；(SEQ ID NO12，ChAd11)；(SEQ ID NO13，ChAd16)(SEQ IDNO14，ChAd17)和(SEQ ID NO15，ChAd19)ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的纤维基因核苷酸序列在此称为(SEQ ID NO58，ChAd8)、(SEQ ID NO60，ChAd22)、(SEQID NO62，ChAd24)、(SEQ ID NO64，ChAd26)、(SEQ ID NO66，ChAd30)、(SEQ ID NO68，ChAd31)、(SEQ ID NO70，ChAd37)、(SEQ ID NO72，ChAd38)、(SEQ BD NO74，ChAd44)、(SEQ ID NO76，ChAd63)和(SEQ ID NO78，ChAd82)，并在序列表中列出。
ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19的六邻体基因核苷酸序列分别在附图21-30中列出，在此称为SEQ ID NO16-25(SEQ ID NO16，ChAd20)；(SEQ ID NO17，ChAd4)；(SEQ ID NO18，ChAd5)；(SEQ ID NO19，ChAd7)；(SEQ ID NO20，ChAd9)；(SEQ IDNO21，ChAd10)；(SEQ ID NO22，ChAd11)；(SEQ ID NO23，ChAd16)；(SEQ ID NO24，ChAd17)和(SEQ ID NO25，ChAd19)。
ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的六邻体基因核苷酸序列在此称为(SEQ ID NO97，ChAd8)、(SEQ ID NO99，ChAd22)、(SEQ ID NO101，ChAd24)、(SEQ ID NO103，ChAd26)、(SEQID NO105，ChAd30)、(SEQ ID NO107，ChAd31)、(SEQ ID NO109，ChAd37)、(SEQ ID NO111，ChAd38)、(SEQ ID NO113，ChAd44)、(SEQ ID NO115，ChAd63)和(SEQ ID NO117，ChAd82)，并在序列表中列出。
在第三个方面，本发明提供了根据在此公开的方法分离的21种其他黑猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82)的纤维蛋白和六邻体蛋白的氨基酸序列。
在此公开和要求权利的纤维蛋白称为(SEQ ID NO83，ChAd3)、(SEQ ID NO84，ChAd6)、(SEQ ID NO48，ChAd20)、(SEQ ID NO49，ChAd4)、(SEQ ID NO50，ChAd5)、(SEQ IDNO51，ChAd7)、(SEQ ID NO52，ChAd9)、(SEQ ID NO53，ChAd10)、(SEQ ID NO54，ChAd11)、(SEQ ID NO55，ChAd16)、(SEQ ID NO56，ChAd17)、(SEQ ID NO57，ChAd19)、(SEQ IDNO59，ChAd8)、(SEQ ID NO61，ChAd22)、(SEQ ID NO63，ChAd24)、(SEQ ID NO65，ChAd26)、(SEQ ID NO67，ChAd30)、(SEQ ID NO69，ChAd31)、(SEQID NO71，ChAd37)、(SEQ IDNO73，ChAd38)、(SEQ ID NO75，ChAd44)、(SEQ ID NO77，ChAd63)和(SEQ ID NO79，ChAd82)。附图20A-20G提供了比较在此公开和要求权利的纤维蛋白的氨基酸序列与以下纤维蛋白的氨基酸序列的比对C1(SEQ ID NO85)、CV68(SEQ ID NO86)、Pan5(作为选择称为CV23)(SEQ ID NO80)、Pan6(作为选择称为CV32)(SEQ ID NO81)和Pan7(作为选择称为CV33)(SEQ IDNO82)。
在此公开和要求权利的六邻体蛋白称为(SEQ ID NO122，ChAd3)、(SEQ ID NO123，ChAd6)、(SEQ ID NO87，ChAd20)、(SEQ ID NO88，ChAd4)、(SEQ ID NO89，ChAd5)、(SEQ IDNO90，ChAd7)、(SEQ ID NO91，ChAd9)、(SEQ ID NO92，ChAd10)、(SEQ ID NO93，ChAd11)、(SEQ ID NO94，ChAd16)、(SEQ ID NO95，ChAd17)、(SEQ ID NO96，ChAd19)、(SEQ IDNO98，ChAd8)、(SEQ ID NO100，ChAd22)、(SEQ ID NO102，ChAd24)、(SEQ ID NO104，ChAd26)、(SEQ ID NO106，ChAd30)、(SEQ ID NO108，ChAd31)、(SEQ ID NO110，ChAd37)、(SEQ ID NO112，ChAd38)、(SEQ ID NO114，ChAd44)、(SEQ ID NO116，ChAd63)和(SEQ ID NO118，ChAd82)。附图31A-31J提供了在此公开和要求权利的六邻体蛋白的氨基酸序列与以下六邻体蛋白的氨基酸序列的比较C1(SEQ ID NO124)、CV68(SEQ ID NO125)、Pan5(做为选择称为CV23)(SEQID NO119)、Pan6(做为选择称为CV32)(SEQ ID NO120)和Pan7(做为选择称为CV33)(SEQ ID NO121)。六邻体蛋白的多重序列比对容许技术人员进行与人类腺病毒血清型的建议分类一致的系统发生分析(Rux，J.J.，et al(2003)J.Virol.779553-9566)。
在可选择的方面，本发明进一步提供了21种其他的黑猩猩腺病毒分离物。包含ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17和ChAd19的样品根据布达佩斯条约作为原始保藏物于2003年12月12日保藏在欧洲细胞培养物保藏所(ECACC，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，UnitedKingdom)。指定了保藏物的登记号码03121201(ChAd4)、03121202(ChAd5)、03121203(ChAd7)、03121204(ChAd9)、03121205(ChAdl0)、03121206(ChAd11)、03121207(ChAd16)、03121208(ChAd17)、03121209(ChAd19)和03121210(ChAd20)。
包含ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的样品根据布达佩斯条约作为原始保藏物于2005年1月12日保藏在欧洲细胞培养物保藏所(ECACC，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，United Kingdom)。指定了这些保藏物的登记号码05011201(ChAd8)、05011202(ChAd22)、05011203(ChAd24)、05011204(ChAd26)、05011205(ChAd30)、05011206(ChAd31)、05011207(ChAd37)、05011208(ChAd38)、05011209(ChAd44)、05011210(ChAd63)和05011211(ChAd82)。
这些保藏物将根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款进行维持。这些保藏仅为了方便本领域技术人员而进行，而不是认可保藏是35 U.S.C.§112所需的。在授予专利之时，除了37 C.F.R.§1.808(b)规定的要求之外，对保藏的材料的公众可获得性的所有限制将被不可撤销地除去。
在其他方面，本发明还提供了复制缺陷性重组腺病毒载体，其能够感染哺乳动物细胞，优选的人类细胞，并指导编码的转基因产物的表达。如在此展示的，所公开的载体(vector)适合用做疫苗载运体(carrier)用于递送包含免疫原的转基因，针对所述免疫原的免疫反应是期望的。在特定实施方式中，本发明提供了能够在人类E1表达(即，包装)细胞系中高水平复制的重组复制缺陷性黑猩猩腺病毒载体。在一个实施方式中，本发明提供了能够在PER.C6TM细胞中复制的重组腺病毒。
一般而言，本发明包括的重组载体提供了能避开对腺病毒血清型的先存免疫的疫苗载运体，所述先存免疫是在人类群体中一般遇到的。更具体地说，本发明的重组载体包含载体主干序列，在此显示了其缺少与人类腺病毒衍生载体的常见血清型交叉反应的中和B表位。
本发明进一步提供了包括腺病毒部分和质粒部分的类群特异性的穿梭载体，其中所述腺病毒部分一般地包含a)病毒左末端(ITR和包装信号)、pIX基因的部分和病毒基因组右末端；和b)基因表达盒。采用了在指定为相同血清型亚群(即，A、B、C、D或E亚群)的腺病毒之间观察到的核苷酸序列同一性设计类群特异性的穿梭载体，并可用于操作在此公开的核苷酸序列，和/或用于克隆属于相同亚群的其他黑猩猩腺病毒，产生含有删除了E1区域的黑猩猩腺病毒基因组的腺病毒前质粒(pre-plasmid)。
本发明的其他方面包括包含腺病毒疫苗载体和/或腺病毒前质粒载体的宿主细胞、生产所述载体的方法，包括将所述腺病毒疫苗载体导入表达腺病毒E1蛋白的宿主细胞中，并收获产生的腺病毒疫苗载体。在特定的实施方式中，本发明提供了生产复制缺陷性黑猩猩腺病毒载体的方法，包括将所公开的腺病毒载体之一导入表达腺病毒E-1的人类细胞，并收获产生的重组腺病毒。
本发明的另一个方面还提供了包含本发明的腺病毒载体的疫苗组合物。包含重组黑猩猩腺病毒载体的组合物可以单独施用或与其他基于病毒或非基于病毒的DNA/蛋白疫苗组合施用。它们也可以作为更广阔的治疗方式的部分来施用。这些组合物可以以预防性或治疗性的设置施用给哺乳动物宿主，优选人类宿主。如在此所示，单独地或以组合形式施用所公开的疫苗组合物，例如激发强化方式或不同血清型Ad载体的多次注射，引起哺乳动物中能够特异性识别由转基因编码的免疫原的免疫反应的诱导。
在此公开和要求权利的方法之一，包括向哺乳动物(是幼稚的(naive)或被激发以对目标抗原有免疫活性的)施用足够量的重组黑猩猩腺病毒载体，所述载体含有它的野生型E1基因的至少一个功能删除，带有包含启动子的序列，所述启动子能指导编码至少一个目标抗原的核苷酸序列的表达，其中施用所述重组抗体引发(或激发)抗原特异性免疫反应。
在一个实施方式中，本发明提供了设计以诱导针对传染原(例如，病毒或细菌性病原体或哺乳动物寄生虫)的免疫反应(预防性或治疗性的)的方法。在第二实施方式中，本发明提供了设计以在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，所述免疫反应将破坏对自体抗原，例如TAA的耐受性。本发明的这个方面考虑使用所公开的载体作为疫苗载运体用于制备和施用癌症疫苗。
根据以下对发明的详细说明，本发明的其他实施方式和益处将显而易见。
附图的简要说明附图1是概括了用于构建ChAd6穿梭载体(pARS ChAd6-3)的克隆策略的示意图。
附图2是说明用于在E.coli菌株BJ5183中通过同源重组克隆ChAd6病毒基因组的克隆策略的示意图。
附图3是说明各种ChAd6穿梭质粒的元件的示意图，包括pARSChAd6-3 GAG；pARS ChAd6-3 SEAP；pARS ChAd6-3 EGFP；和pARS ChAd6-3 NS MUT。
附图4是说明用于克隆ChAd6ΔE1表达载体的同源重组方案的示意图。
附图5A-5K提供了ChAd3的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
附图6A-6K提供了ChAd6的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
附图7A-7K提供了CV32的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
附图8A-8K提供了CV33的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
附图9A-9J提供了CV23的基因组核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
附图10提供了ChAd20的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO6)。
附图11提供了ChAd4的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO7)。
附图12提供了ChAd5的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO8)。
附图13提供了ChAd7的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO9)。
附图14提供了ChAd9的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO10)。
附图15提供了ChAd10的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO11)。
附图16提供了ChAd11的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO12)。
附图17提供了ChAd16的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO13)。
附图18提供了ChAd17的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO14)。
附图19提供了ChAd19的纤维基因的核苷酸序列(SEQ ID NO15)。
附图20A-20G提供了以下的纤维蛋白的氨基酸序列ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82，与来自C1(SEQ ID NO85)、CV68(SEQ ID NO86)、PAN5(也称为CV23)(SEQ ID NO80)、PAN6(也称为CV32)(SEQ ID NO81)和Pan7(也称为CV33)(SEQ ID NO82)的参考纤维蛋白序列的比较。
附图21提供了ChAd20的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ IDNO16)。
附图22提供了ChAd4的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO17)。
附图23提供了ChAd5的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO18)。
附图24提供了ChAd7的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO19)。
附图25提供了ChAd9的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO20)。
附图26提供了ChAd10的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ IDNO21)。
附图27提供了ChAd11的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ IDNO22)。
附图28提供了ChAd16的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ IDNO23)。
附图29提供了ChAd17的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ IDNO24)。
附图30提供了ChAd19的六邻体基因的核苷酸序列(SEQ IDNO25)。
附图31A-31J提供了ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的六邻体蛋白的氨基酸序列，与来自C1(SEQ ID NO124)、CV68(SEQ ID NO125)、PAN5(也称为CV23)(SEQ ID NO119)、PAN6(也称为CV32)(SEQ IDNO120)和Pan7(也称为CV33)(SEQ ID NO121)的参考纤维蛋白序列的比较。
附图32提供在此公开的人工序列SEQ ID NO26-40和SEQ IDNO45和46，包括寡聚物和引物的列表。
附图33是属于不同血清型亚群(即，C、E和D亚群)的ChAd载体的免疫断点(break-point)的图示。通过在用表达gag的ChAd3、ChAd11、ChAd20、CV33、CV68、ChAd6、ChAd9、ChAd10、CV32、ChAd4、ChAd7和ChAd16载体免疫的小鼠中进行滴定实验，测定引发可测量免疫反应的最低剂量。
附图34提供了在恒河猴中引发的CEA特异性T细胞反应的图示，所述恒河猴次序地用人类腺病毒载体(MRKAd5 RhCEA)、12周间隔后用黑猩猩腺病毒载体(CV33 RhCEA)免疫。通过IFN-γELISPOT分析评估免疫反应，数据说明了在不存在(DMSO)和存在恒河猴CEA C和D肽库的情况下孵化之后每百万个外周血单核细胞(PBMC)中斑点形成细胞(SFC)的数目。
附图35提供了用PAUPSEARCH(Wisconsin Package Version10.3，Accelrys Inc.)进行全长六邻体肽序列的多重序列比对和用TREEVIEW进行可视化和操作得出的人类和黑猩猩腺病毒的系统树。
附图36是响应于向预先暴露于hAd5的小鼠施用ChAd3和hAd5gag载体获得的免疫结果的图示。免疫后3周通过IFN-γELISPOT使用纯化的脾细胞评估细胞介导的免疫。
附图37是在用ChAd3hCEA和Ad5hCEA免疫的人类CEA转基因小鼠中引发的抗CEA CMI的动力学的图示。通过用CEA肽库刺激的PBMC的ICS评估CMI。结果表示为IFNγ+CD8+/总PBMC的％。
附图38 A-D是暴露于moi 50、250和1250的不同ChAd载体的不同人类初级细胞的感染效率的图示，所述ChAd载体表达EGFP并属于不同的亚群(B、C、D、E)。结果表示为荧光细胞/总细胞的％。
发明的详细说明如在整个说明书和附随的权利要求书中使用的，采用以下定义和缩写术语“盒”是指核酸分子，其包含至少一个要表达的核酸序列以及它的转录和翻译控制序列。改变所述盒，将使掺入了所述盒的载体指导不同序列或序列的组合的表达。在本发明的范围中，盒中存在的核酸序列通常编码免疫原。由于工程化的限制性位点存在于5′和3′末端，所述盒可以容易地插入、除去或用另一个盒替换。
术语“顺式作用元件”是指调节与它们连接的基因的核苷酸序列。存在于DNA中的顺式作用元件调节转录，转录成mRNA的那些能够调节RNA加工、转换(turnover)和蛋白质合成。
术语“载体”是指一些工具，通过它们能将DNA片段导入到宿主有机体或宿主组织中。存在着各种型式的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌体和粘粒。
术语“启动子”是指在DNA链上、RNA聚合酶能与之结合的识别位点。启动子与RNA聚合酶形成起始复合物来启动和驱动转录活性。通过活化序列例如增强子，或抑制序列例如沉默子，可以修饰所述复合物。
术语“药学有效量”是指重组腺病毒的数量，在特定施用途径中有效转导宿主细胞并提供足够的转基因表达水平以引发免疫反应。
术语“有复制能力的”重组腺病毒(AdV)是指具有完整的或功能上必需的早期基因(即，E1A、E1B、E2A、E2B和E4)的腺病毒。野生型腺病毒是有复制能力的。
术语“复制缺陷性”重组AdV是指一种腺病毒，由于已经被工程化以具有病毒复制所必需的基因产物的至少一种功能删除或完全删除，而变得不能复制。本发明的重组黑猩猩腺病毒载体是复制缺陷性的。
术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人类。
术语“序列同一性百分比”或“同一性”在核酸序列的上下文中是指当进行最大相关性比对时两个序列中的相同的残基。序列同一性比较的长度可以是在基因组的全长上(例如，约36kbp)，基因的开放阅读框的全长上，蛋白、亚基或酶上[参见，例如，提供腺病毒编码区域的框]，或至少约500到5000个核苷酸的片段上，是期望的。然而，在例如，至少约九个核苷酸、通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36个或更多核苷酸的较小片段之间的同一性也是期望的。类似地，可以对氨基酸序列，在蛋白的全长上或其片段，容易地确定“序列同一性百分比”。适当地，片段长度至少约8个氨基酸，并可以达到约700个氨基酸。在此描述了适合的片段的实例。
在默认设置下使用在此定义的这种算法和计算机程序，容易地确定同一性。优选的，这种同一性是在蛋白、酶、亚基的全长上，或在长度至少约8个氨基酸的片段上进行的。然而，同一性可以基于更短的区域，在所述区域上适合于放入同一的基因产物的用途。
一般地，腺病毒构建体、基因构建体通过参考其中含有的基因来命名。例如，“pChAd3 ΔE1gag”是指包含删除了E1区域的ChAd3黑猩猩腺病毒基因组的质粒构建体。在这个质粒中，E1区域被免疫原表达盒替代，所述免疫原表达盒包含处在人类CMV启动子控制下之后是牛生长激素多聚腺苷酸信号的HIV gag基因。类似地，pCV33DE1-E3 NSmut是指在此公开的第二种质粒构建体，其包含删除了E1和E3区域的CV33黑猩猩腺病毒基因组，所述E1和E3区域被免疫原表达盒替代，所述免疫原表达盒包含处在人类CMV启动子控制下之后是牛生长激素多聚腺苷酸信号的HCV非结构基因。
缩写“Ag”是指抗原。
在整个说明书中和在附随的权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的引用，除非上下文中明显地另外指示了。
腺病毒(Ads)是已经在几种禽类和哺乳动物宿主中鉴定的无包被的二十面体病毒。人类Ads(hAd)属于Mastadenovirus属，包括所有已知的人类和动物(例如，牛、猪、犬、鼠、马、猿和绵羊)来源的许多Ads。根据许多生物学、化学、免疫学和结构标准，包括大鼠和恒河猴红血球的血细胞凝集性质、DNA同源性、限制性内切酶裂解模式、G+C含量百分比和致癌性，将人类腺病毒分成六个亚群(A-F)(Straus，1984，In The Adenoviruses，ed.H.Ginsberg，pps.451-498，New YorkPlenus Press，and Horwitz，1990 In Virology，eds.B.N.Fields and D.M.Knipe，pps.1679-1721)。迄今为止，已经鉴定了51种不同的血清型，并根据它们的血细胞凝集性质和生物物理和生物化学标准分类成亚群。
腺病毒颗粒是二十面对称性的，取决于血清型，直径为60-90nm。二十面体衣壳由三种主要蛋白，六邻体(II)、五邻体基部(III)和隆突纤维(IV)以及许多微小蛋白(即，VI、VIII、IX、IIIa和IVa2)组成(W.C.Russel，J.Gen.Virol.，812573-2604(2000))。在人体中观察到的先存免疫性的一个方面是体液免疫，其可以引起特异于病毒蛋白的抗体的产生和存留。由腺病毒引发的体液反应主要地针对主要结构蛋白质六邻体、五邻体和纤维。
公开的报道已经证实了，包含针对多种血清型的抗体的滴度是常见的(Dambrosio，E.(1982)J.Hyg.(London)89209-219)，先存滴度的重要部分具有中和活性。对腺病毒的中和免疫性是型特异性的(type-specific)，特定血清型的腺病毒的感染仅赋予对该血清型的免疫性。一些报道已经表明，针对六邻体的抗体是最强烈的和最具中和性的(Toogood，C.I.A.，Crompton，J.and Hay R.T.(1992)J.Gen.Virol.73，1429-1435)。因此，合理的假定是，对型特异性中和作用负责的表位位于七个高变区内，所述高变区是通过对从不同血清型得出的六邻体序列进行比对来鉴定的。(Crawford-Miksza，L and D.P.Schnurr.(1996)J.Virol.701836-1844)。
已经通过不同的方法，包括免疫血清从处理的动物到幼稚动物的被动转移，证实了型特异性中和抗体的存在与用基于相同血清型的载体不能引发免疫反应之间的直接相关性。一般而言，对特定病毒血清型的先存体液免疫降低了载体施用的治疗效力。此外，施用基于特定病毒血清型的载体引发了针对该载体的、阻止相同血清型的重复施用的免疫反应。
在特定的实施方式中，本发明提供了一种绕过所述不利影响的方法，所述不利影响与对hAd的常见血清型的先存免疫性的后果有关。更具体地，本发明考虑使用以不在人类中传播的血清型为特征的黑猩猩腺病毒载体。因此，本发明提供了缺少与常见人类血清型的表位发生交叉反应的中和B细胞表位的腺病毒(Chad)载体作为疫苗载运体。
虽然已经报道了腺病毒特异性细胞介导的免疫性(CMI)可能是交叉反应性的，基于多种血清型的重复注射的疫苗接种研究表现了比基于单个载体的免疫程序更高的效率。这些实验进一步证明了疫苗目的的载体施用的主要局限是针对该载体的体液性先存免疫性。对使用人类腺病毒作为疫苗载运体有关的难题的可能解决方案包括，施用更高剂量的预测会遭遇先存免疫反应的腺病毒(例如，C亚群血清型)，和使用基于稀有人类血清型的载体。然而，使用更高剂量的疫苗增加了疫苗的成本和不希望的副作用的风险，临床前测试的结果表明人类的另外的血清型比hAd5和hAd6有更低的免疫原性。
在避免针对载体的腺病毒主干元件的宿主体液和细胞免疫反应的问题和最小化使用可能被有复制能力的腺病毒(RCA)污染的人类腺病毒衍生载体成品的风险的尝试中，已经表征和开发了几种非人类腺病毒作为疫苗载运体(Soudois，C.et al(2000)J.Virology，7410639-10649；Farina，S.F.et al(2001)J.Virology，7511603-11613；Cohen，C.J.et al(2002)J.Gen.Virology，83151-155.)。使用非人类腺病毒序列来绕过与先存免疫性有关的难题的前提基于这种观察结果，即针对常见人类腺病毒血清型的中和抗体不太可能交叉中和非人类病毒。然而，病毒和细胞因素的不相容性给大多数可选择的载体系统(牛、绵羊、犬)带来了实际的局限性，其特征在于必须在非人类细胞系中繁殖的缺点。
Wilson等已经公开了一报告，描述了基于黑猩猩腺病毒68型(CV68)C68的复制缺陷性载体的鉴定，所述腺病毒最初是从黑猩猩的肠系膜淋巴结分离的(Basnight，M.，et.al.(1971)Am.J.Epidemiol.94166-171.)，CV68被完全测序并发现在整体结构上类似于人类腺病毒(Farina，S.F.et al，J.Virol.75(23)11603-11613(2001))。病毒的基因组长度是36,521碱基对，已经描述为最类似人类腺病毒的E亚群，与大多数已经测序的人类Ad4开放阅读框有90％的同一性。CV68 ITRs的长度是130碱基对，存在所有主要的腺病毒早期和晚期基因。CV68的特征在于不在人类中传播(circulate)的血清型，其缺少与常见的人类血清型的表位交叉反应的中和B细胞表位。虽然黑猩猩腺病毒类似于人类腺病毒，但在人类中没有记录到针对黑猩猩血清型的交叉反应性中和免疫。(Farina，S.F.et al.J.Virol.(2001)75(23)11603-13)。
来源于CV68的重组载体被描述为足够类似于人类血清型以支持表达柯萨奇病毒(coxsackievirus)和腺病毒受体的细胞的转导(Cohen，C.et al.，J.Gen.Virol.83151-155(2002)。重要地，CV68的特征是与人类腺病毒足够的相似性水平以支持它在携带来自人类腺病毒5型的E1的293细胞中复制(Farina，S.F.et al.，J.Virol.75(23)11603-11613(2001)。此外，根据人类血清型5 E1的侧翼序列与CV68衍生载体序列的侧翼序列是非同源的这一观察结果，预计不会发生同源重组。因而，预计CV68衍生的疫苗成品(vaccine stocks)被RCA污染的可能性很低。
同一组研究者随后报道了，使用CV68衍生的腺病毒序列作为疫苗载运体用于在小鼠中诱导针对狂犬病病毒糖蛋白的抗体。通过用迷你基因(minigene)盒替换E1A和E1B基因产生了复制缺陷型的CV68。用含有E1删除、包含编码狂犬病病毒糖蛋白的转基因产物的腺病毒重组体(AdC68rab.gp)免疫的小鼠，发展出对狂犬病病毒的保护性免疫，并且对不然就是致死剂量的狂犬病病毒的攻击保持了抗性(Xiang，Z et al.，J.Virol.76(5)2667-2675(2002)。近来已经报道了表达密码子优化的、截短形式的HIV-1的gag的第二种CV68构建体在小鼠中诱导强有力的gag特异性CD8+T细胞反应。疫苗诱导反应显示了能提供对牛痘gag重组病毒攻击的保护(Fitzgerald，J.C.et al.，J.Immunol.1701416-1422(2003)。对用人类腺病毒血清型5预先免疫的小鼠使用CV68gag或Ad5gag载体进行实验性疫苗接种展现出，与通过CV68疫苗引发的相比，通过Ad5引发的更显著的gag特异性T细胞的降低和对病毒攻击的保护。C68gag疫苗效力的降低是由于Ad5特异性CD8+T细胞的交叉反应性(同上)。
一同考虑这个数据表明，猿衍生的复制缺陷性腺病毒载体与基于常见的人类血清型的载体相比更适合用作人类疫苗载运体。如在此所示，用人类Ad5强烈免疫的小鼠(附图36)可以用ChAd3-gag腺病毒载体进行免疫的实验结果表明，先存的抗人类Ad5免疫性不会降低ChAd载体引发的gag特异性CMI反应。这些结果与人类Ad5交叉反应性B和T细胞表位不存在于ChAd3或ChAd6载体中的结论相一致。
一般而言，非常好地表征了腺病毒基因组，尽管存在几种不同的血清型，在类似地安置了特定功能的腺病毒基因组的整体结构上存在某些普遍的保守性。在美国专利No.6,083,716(黑猩猩腺病毒载体)和PCT公开的申请WO 03/000851(快速筛选细菌转化体和新的猿腺病毒蛋白的方法)中提供了Wilson等公开的黑猩猩腺病毒C1和CV68的核苷酸序列，以及每个病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置，通过引用将其中的教导合并在此。
腺病毒基因组的每个末端都包含称为反向末端重复(ITR)的序列，其是病毒复制必需的。病毒还包含病毒编码的蛋白酶，其是加工某些结构蛋白所需的，所述结构蛋白是产生传染性病毒颗粒所需的。根据宿主细胞转导后病毒基因的表达顺序，描述了腺病毒基因组的结构。更具体地，根据转录是在DNA复制开始之前还是之后发生，将病毒基因称为早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期阶段，腺病毒的E1、E2、E3和E4基因被表达以使宿主细胞作好病毒复制的准备。通过删除病毒基因组的必需的早期区域1(E1)，病毒可以变为复制缺陷性的。Brody et al，1994 Ann N Y Acad Sci.，71690-101。在晚期阶段期间，接通了晚期基因L1-L5的表达，它们编码病毒粒子的结构元件。所有晚期基因都处在单个启动子的控制之下，编码的蛋白包括五邻体(L2)、六邻体(L3)、100 kDa支架蛋白(L4)和纤维蛋白(L5)，它们形成了新的病毒粒子，腺病毒DNA将被包裹在其中。取决于病毒的血清型，在单个宿主细胞中可以产生10,000-100,000个子代腺病毒粒子。最终，腺病毒复制过程引起细胞的裂解。
通过从公开的黑猩猩核酸序列中删除特定的核苷酸序列并插入来自其他DNA序列、对转基因的插入、表达和其他遗传操作有用的序列，构建了在此公开的复制缺陷性腺病毒载体。因此，在此描述的重组黑猩猩腺病毒可以含有来源于一种或多种黑猩猩腺病毒的腺病毒序列，或来自黑猩猩腺病毒和来自人类腺病毒的序列。可以重组地、合成地产生适合的多核苷酸序列，或可以从天然来源分离。适用于本发明的特定方面的腺病毒序列包括缺少与常见的人类血清型交叉反应的中和B细胞表位的序列。
至少，本发明的重组黑猩猩腺病毒(例如，载体)含有复制和病毒颗粒封装所需的黑猩猩腺病毒顺式作用元件，与至少一个免疫原表达盒组合。一般地，顺式作用元件侧翼于包含编码至少一个抗原的转基因的表达盒。更具体地，本发明的载体含有必需的腺病毒的顺式作用5′反向末端重复(ITR)序列(其起到复制起点的作用)、3′ITR序列、包装/增强子结构域和编码异源分子的核苷酸序列。无论所述重组载体是仅包含最小的腺病毒序列还是包含仅具有特定基因(例如，E1和/或E3或E4区域)的功能性删除的完整腺病毒基因组，本发明的载体包含黑猩猩腺病毒衣壳。
一般而言，在此公开的腺病毒载体包含复制缺陷性腺病毒基因组，其中所述腺病毒基因组不具有功能性E1基因，并包含免疫原表达盒，其包含a)编码至少一个免疫原的核酸，针对该免疫原的免疫反应是期望的；和b)与编码所述免疫原的核酸序列可操作连接的异源(即，对于所述腺病毒序列而言)启动子；和转录终止子。
更具体地，本发明提供了由重组腺病毒基因组组成的复制缺陷性载体，所述重组腺病毒基因组缺少选自由E1、E2、E3和E4构成的组的至少一个早期基因。在一个实施方式中，通过用免疫原表达盒替换、或破坏在此公开的腺病毒分离物(例如，ChAd3、ChAd6、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAdl9、ChAd20、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63或ChAd82)之一的E1基因来制备复制缺陷性载体。例如，可以通过删除/破坏ChAd3(SEQ ID NO1)或ChA6(SEQ ID NO2)的E1基因来制备载体。做为选择，复制缺陷性载体可以从在此公开的其他腺病毒分离物的任何一个来制备，包括ChAd3、ChAd6、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82或ChAd20。在其他实施方式中，本发明的复制缺陷性载体包含来源于已经被任选的工程化而缺少功能性E3基因的、在此公开的ChAds之一的腺病毒基因组。要理解的是，在此公开的黑猩猩腺病毒序列可以通过完全除去早期基因或通过使基因失效或无功能来变成复制缺陷性的。
要理解的是，本发明包括了特征为具有修饰的载体，所述修饰例如破坏腺病毒表达一种或多种选定基因产物的能力的“功能性删除”。如在此使用的术语“功能性删除”宽泛地涵盖具有使特定基因产物无功能的效果的修饰。一般而言，功能性删除采取部分或全部删除腺病毒基因的形式。然而，技术人员将容易认识到，其他操作，包括但不限于进行引入移码突变的修饰也能实现功能性删除。例如，本发明的重组黑猩猩腺病毒载体可以通过导入一种修饰来成为复制缺陷性的，所述修饰被设计以干扰、或功能性删除所述病毒表达腺病毒E1A和/或E1B的能力。
公知的是，可以通过导入一种修饰来获得复制缺陷性腺病毒载体，所述修饰被设计以干扰、或功能性删除E2基因的组中一个或多个基因的表达。更详细地，可以通过钝化聚合酶基因、或前末期蛋白基因或DNA结合蛋白基因来构建复制缺陷性载体。此外，删除或钝化E4区域表达的基因是构建复制缺陷性黑猩猩Ad载体的可选择的策略。可以组合早期基因的删除或钝化来产生更为减毒的载体。做为选择，复制缺陷性ChAd载体也可以包含在其他病毒基因中的另外的修饰，例如晚期基因L1到L5。此外，可以通过组合获自不同血清型的六邻体和纤维基因来产生新的腺病毒疫苗载运体。六邻体和纤维基因混移(shuffling)策略的使用也将容许研究者改变ChAd的生物学性质和促进具有不同的趋性或具有新的血清学特征的载体的产生。
要理解的是本发明涵盖重组腺病毒载体，其包含了完整基因或其部分的删除，所述删除单独地或任意组合地有效破坏所修饰的基因的生物学活性。例如，尽管在此所示希望的是与E1基因的功能性删除相组合向载体中导入异源Ad5 E4序列，还是可以构建重组猿腺病毒，其具有E4区域表达的基因的功能性删除。做为选择，可以消除腺病毒延迟早期E3基因的功能；然而由于E3的功能不是重组腺病毒粒子的产生所必需的，不必将该基因产物重新放回以产生能够包装在本发明中有用的病毒的重组体。
在本发明的一个实施方式中，使用的复制缺陷性腺病毒载体是含有E1以及任选的E3的删除的黑猩猩C亚群腺病毒。例如，对于ChAd3，可以将适合的E1删除/破坏导入从bp 460到bp 3542的区域(参考SEQ ID NO1)。对于ChAd6，可以将适合的E1删除/破坏导入从bp 457到bp 3425的区域(参考SEQ ID NO2)。对于CV32，E1删除优选的从bp 456到bp 3416(参考SEQ ID NO3)；对于CV33，E1删除优选的从bp 456到bp 3425(参考SEQ ID NO4)和对于CV23，E1删除优选的从bp 456到bp 3415(参考SEQ ID NO5)。对于CV32和CV33，E3删除优选的分别为从bp 27446到bp 31911(参考SEQ ID NO3)；从bp 27146到bp 31609(参考SEQ ID NO4)。本领域技术人员可以根据序列同源性和多重序列比对容易地确定对于其他黑猩猩分离物的等同序列。
本领域技术人员将容易地认识到，为了构建删除E1的腺病毒载体，必需考虑载体主干的结构和包含转基因的核酸序列的组成来进行许多决定。例如，研究者必需确定E1删除的大小是否适应转基因的大小。如果不适应，则必需向载体的主干中导入另外的删除。
包含转基因的核酸序列可以是基因、或基因的功能部分，一般将以表达盒的形式存在。一般地，基因表达盒包括(a)编码感兴趣的蛋白或抗原的核酸；(b)与编码所述蛋白的核酸可操作连接的异源启动子；和(c)转录终止信号。所述核酸可以是DNA和/或RNA，可以是双链或单链的。为了在期望的宿主(例如，哺乳动物宿主)中表达可以对核酸进行密码子优化。
还必须考虑主干内要导入转基因的部位和转基因的方向来作出决定。更具体地，可以按E1平行(5′到3′转录)或反平行(相对于载体主干在3′到5′方向上转录)方向插入转基因。此外，需要鉴定合适的转录调节元件并与所述转基因可操作地连接，所述转录调节元件能够指导转基因在哺乳动物宿主细胞中的表达，载体是为所述哺乳动物宿主细胞准备用作疫苗载运体的。“可操作连接的”序列包括与被调节的核酸序列邻接的表达控制序列，和反式作用的、或在一定距离上来控制所调节的核酸序列的调节序列。
调节序列包括合适的表达控制序列，例如转录起始、终止、增强子和启动子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多聚腺苷酸信号；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列和任选的促进蛋白质分泌的序列。这些和其他常见的载体元件的选择是常规的，许多适合的序列对于本领域技术人员而言是公知的。(参见，例如，Sambrook et al.和其中引用的参考文献，例如，第3.18-3.26和第16.17-16.27页，和Ausubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1989)。
在特定的实施方式中，所述启动子是由真核RNA聚合酶识别的异源启动子(即，对于腺病毒序列而言)。在优选的实施方式中，所述启动子是“强”或“高效”启动子。强启动子的实例是即时早期人类巨细胞病毒启动子(Chapman et al，1991 Nucl.Acids Res 193979-3986，通过引用将其合并)。可以使用没有(CMV)或含有内含子A序列(CMV-intA)的人类CMV启动子，尽管本领域技术人员公认的是可以使用许多其他已知的启动子，例如强免疫球蛋白或其他真核基因启动子，包括EF1α启动子、鼠CMV启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、SV40早期/晚期启动子和β-肌动蛋白启动子。
可以用于本发明的启动子的进一步实例是强免疫球蛋白启动子、EF1α启动子、鼠CMV启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、SV40早期/晚期启动子和β肌动蛋白启动子，虽然本领域技术人员可以理解的是根据本发明的方法可以使用能实现预定宿主中的表达的任何启动子。启动子可以包含可调节序列，例如Tet操纵子序列。在试图抑制基因转录的情况中，例如提供了调节转录和表达的可能性的序列是有用的。
适合的基因表达盒还包含转录终止序列。优选的转录终止子是牛生长激素终止子。CMVintA-BGH终止子的启动子/转录终止组合是特别优选的，虽然也可以使用其他的启动子/终止子组合。如在此所示，50个核苷酸长度的牛生长激素终止/多聚腺苷酸信号(bGHpA)或短的合成多聚A信号(SPA)定义如下AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTGTGTG(SEQ ID NO26)。一般而言，例示了适合的终止序列。多聚A信号被插入到包含转基因的核酸序列之后和3′腺病毒ITR序列之前。
在此描述的重组腺病毒载体可以含有来源于一种或多种腺病毒株的腺病毒序列。适合的序列可以从天然的来源获得，或重组地、合成地、或通过其他遗传工程或化学方法产生。在特定的实施方式中，重组黑猩猩腺病毒是包含非黑猩猩腺病毒多核苷酸序列的嵌合重组体。适合的非黑猩猩腺病毒序列可以从人类腺病毒株获得。例如，可以用hAd5 E4(Ad5 nt 32816到nt 35619)或Ad5E4orf6(Ad5 nt 33193到nt 34077)(Ad5 GenBank登记NoM73260)替换天然的E4区域。
一般而言，由本发明的重组腺病毒载体递送的免疫原(抗原性分子)包括多肽、蛋白或酶产物，其由与一核苷酸序列组合的转基因编码，所述核苷酸序列提供了必需的调节序列来指导所述编码的产物在宿主细胞中的转录和/或翻译。转基因的组成取决于载体的预定用途。例如，如果免疫原性组合物是被设计以在哺乳动物宿主中引发特异于传染原的抗体反应或细胞介导免疫反应，则合适的是使用编码至少一个免疫原性产物的核酸序列，所述免疫原性产物预计为接受者赋予病原体特异性免疫。做为选择，如果所述组合物是制备用作癌症疫苗的，适合的转基因可以包含自体抗原例如TAA的免疫原性部分，其是根据引发足够效力的保护性免疫反应的目标来选择的，来破坏对特定TAA的宿主耐受性，和引发足以预防癌症的起始或预防肿瘤发展的、长期的(例如，记忆性)反应。因此，适合的免疫原性基因产物可以从感染哺乳动物宿主的多种病原体(例如，但不限于，病毒、寄生虫、细菌和真菌)获得，或从癌症或肿瘤细胞获得。虽然在此用特定集合的测试免疫原举例说明了本发明，要理解的是本发明不限于使用在此例示的抗原。更具体地，本发明考虑使用异源的和自体的抗原作为免疫原，包括但不限于TAA。
在一个实施方式中，本发明提供了免疫原性组合物(例如，疫苗)，用于诱导针对由传染原表达的抗原(即，免疫原)的免疫反应。例如，希望的是引发针对感染人类和/或非人类动物物种的病毒的免疫反应。病毒家族的实例包括小RNA病毒科(Picornaviridae)，其包括六个不同的属，例如口蹄病毒(Aphtovirus)、心脏病毒(Cardiovirus)、肠道病毒(Enterovirus)、肝病毒(Hepatovirus)、Parechovirus、鼻病毒(Rhinovirus)，针对所述病毒家族的预防性和/或治疗性免疫反应是希望的。小RNA病毒的实例是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseaseviruses)、脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis viruses)、脊髓灰质炎病毒(Polioviruses)、Coxackieviruses、人类肝炎A病毒、人类parechoviruses、鼻病毒，针对所述小RNA病毒的免疫反应是希望的。杯状病毒科(Caliciviridae)包括与人类中由病毒的Norwalk群引起的流行性胃肠炎和在动物中的其他综合症有关的不同的属，所述其他综合症如在兔中与兔出血病病毒有关的出血性疾病，或在猫中由猫杯状病毒引起的呼吸道疾病。
另一个病毒家族是星状病毒科(Astroviridae)，其包含从人类以及许多不同的动物物种分离的病毒，引发针对该病毒家族的免疫反应是希望的。人类星状病毒与胃肠炎和幼儿的腹泻有关。做为选择，给哺乳动物宿主赋予对病毒的披膜病毒科(Togaviridae)的成员的免疫性是希望的，其包括两个属甲病毒属(alphavirus)和rubivirus。甲病毒属与人类和兽类疾病有关，例如关节炎(即切昆贡亚热病毒(Chikungunya virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus))或脑炎(东方马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus)、西方马脑炎病毒(Western Equine EncephalitisVirus))。
风疹病毒提供了可选择的病毒目标，其是Rubivirus属的唯一成员，是与发烧和淋巴腺病有关的轻度皮疹疾病暴发的原因。当母亲在早期妊娠期间获得时，风疹病毒感染还与胎儿异常有关。黄病毒科(Flaviviridae)是另一个病毒家族，由三个属组成黄病毒属、pestiviruses和肝病毒属，包括重要的人类以及动物病原体。黄病毒属成员中的许多是节肢动物传播的人类病原体，引起各种疾病包括发烧、脑炎和出血热。登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河热病毒、蜱传播的脑炎病毒是主要的全球性或地域性(地方性)的病原体。Pestivirus属包括有主要是经济上的重要性的动物病原体，例如牛病毒性腹泻病毒、标准猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus)、边界疾病病毒(Border Disease Virus)。肝炎C病毒是肝病毒属的唯一成员，与急性和慢性肝炎有关。重组腺病毒表达的HCV蛋白可以引发保护性的和治疗性的免疫反应，限制在世界范围内影响17000万人的病毒感染的后果。
做为选择，来源于冠状病毒科(Coronaviridae)的成员的抗原可以由重组腺病毒载体表达以获得对感染的保护。通过用选自包括ChAd3、4、5、6、7、9、10、11、16、17、19、20、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的组的、表达一种或多种SARS-CoV蛋白的一种或多种黑猩猩腺病毒进行免疫，可以获得对严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-Co病毒)的保护，所述SARS-CoV蛋白无限制地包括核壳(N)蛋白、聚合酶(P)蛋白、膜(M)糖蛋白、刺突(S)糖蛋白、小包膜(E)蛋白或由该病毒表达的任何其他的多肽。包括狂犬病病毒的棒状病毒科(Rhabdoviridae)成员可以是表达病毒蛋白的重组疫苗的目标。
其他可能的目标包括Filoviridae家族，包含Ebola样病毒和Marburg样病毒属，与严重的出血热暴发有关；副粘病毒科(Paramyxoviridae)包含在人类中已知的最流行的某些病毒，如麻疹、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒和兽医感兴趣的病毒如新城疫和牛瘟病毒；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)包括流感A、B、C病毒；布尼安病毒科(Bunyaviridae)主要由节肢动物传染到脊椎动物宿主，包含重要的人类病原体，如里夫特山谷热(Rift valley fever)、SinNombre、Hantaan、Puumala病毒；沙粒病毒科(Arenaviridae)包含淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、拉沙热、阿根廷出血热(ArgentineHemorragic fever)、玻利维亚出血热(Bolivian Hemorragic fever)病毒；Bornaviridae科包含主要在马和绵羊中引起中枢神经系统疾病的病毒；呼肠孤病毒科(Reoviridae)包括轮状病毒，世界范围内的婴儿和幼儿中严重痢疾性疾病的最重要原因，可以感染人类和其他哺乳动物的环状病毒(蓝舌病、兽疫流行性出血病病毒)；逆转录病毒科(Retroviridae)，病毒的一个大组，包含重要的人类病原体如人类免疫缺陷性病毒1和2(HIV-1和HIV-2)和人类T细胞白血病毒1型和2型(HTLV1和2)，以及非人类慢病毒，例如感染绵羊和山羊的Maedi/Visna viruses，感染马的马传染性贫血病毒，感染牛的牛免疫缺陷病毒，感染猫的猫免疫缺陷病毒；多瘤病毒科(Polyomaviridae)包括小的DNA致癌病毒，典型病毒是分别感染小鼠和恒河猴的多形瘤和SV40(从人类患者分离了与SV40近相关的BK和JC病毒)；乳头状瘤病毒科(Papillomaviridae)由一组DNA病毒组成，所述病毒感染高等脊椎动物包括人类，产生疣和湿疣。乳头状瘤病毒感染与人类和动物中的癌症发展有关。人类乳头状瘤病毒与子宫颈癌、阴道癌和皮肤癌有关。疱疹病毒科(herpesviridae)包括一些亚科，在其中分类了许多人类和其他哺乳动物的重要病原体。抗原的适合的来源可以是但不限于单纯性疱疹病毒1和2，水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、细胞巨化病毒、人类疱疹病毒6A、6B和7、卡波西肉瘤相关疱疹病毒。抗原的进一步适合的来源是痘病毒科的成员，如猴痘病毒、Molluscum contagiusum病毒、天花病毒；肝炎B病毒，肝病毒科的典型成员，以及引起急性和/或慢性肝炎的其他病毒如肝炎delta病毒、肝炎E病毒。
本发明的腺病毒载体还适合于制备免疫原性组合物，所述免疫原性组合物被设计以在人类或动物中刺激针对非病毒病原体表达的蛋白的免疫反应，所述病原体包括细菌、真菌、寄生虫病原体。例如在此公开的载体可以用于制备针对，但不限于Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、Neisseria meningitis、Corynebacterium diphteriae、结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis)和麻风杆菌(leprae)，Listeria monocytogenes和Legionellapneumofila的疫苗。希望制备预防性或治疗性疫苗的真菌和哺乳动物寄生虫的实例包括白色念珠菌(Candida albicans)、烟曲菌(Aspergillus fumigatus)、Histoplasma capsulatum、Plasmodiummalariae、Leishmania major、Trypanosome cruzi和brucei、Schistosomahaematobium、mansoni和japonicum；Entamoeba histolytica，和已知与人类丝虫病有关的Filaria的许多种类。
癌症一般涉及编码多肽的基因的失调，所述多肽有助于维持细胞周期或控制细胞增殖(例如，生长因子、致癌基因、受体和肿瘤抑制物)。涉及癌症的许多基因的产物在各种各样的肿瘤细胞表面表达。在人类和动物癌症中已经鉴定了可被T和B淋巴细胞识别的多种肿瘤抗原。适用于抗癌疫苗试验的极大多数肿瘤相关抗原(TAA)被描述为“自体抗原”，因为除了在肿瘤细胞上表达之外，它们还在正常的组织上和/或在胎儿发育期间表达。目标人群对TAA的免疫耐受可以解释为什么许多癌症疫苗被证实是无效的。
肿瘤抗原可以通过正常细胞基因的致癌突变体来产生，改变的原癌基因或肿瘤抑制物基因例如，Ras、p53或Bcr-Abl蛋白是可以刺激T/B细胞反应的改变的细胞蛋白的实例。肿瘤抗原可以是在肿瘤细胞中过量表达的正常细胞蛋白(酪氨酸酶、GP100、MART通常在黑素细胞中以低水平表达，在黑素瘤中过量表达)，或在肿瘤细胞中异常表达的正常细胞蛋白(MAGE、BAGE、GAGE在黑素瘤和许多癌中表达，但是在睾丸和胎盘中正常表达)。肿瘤抗原可以是致癌病毒的产物由宫颈癌表达的乳头状瘤病毒E6和E7蛋白；由EBV+淋巴瘤和鼻咽癌产生的EBV EBNA-1蛋白；在SV40诱导的实验肿瘤中的SV40 T抗原。癌胎抗原(oncofetal antigens)在癌细胞和正常发育的(胎儿)组织中高水平表达，但不在成年人组织中表达。癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)是良好表征的癌胎抗原的实例。
新近的证据支持了能引发免疫反应的TAA的存在，因而使这类抗原成为疫苗疗法的适合的免疫原。然而，作为一类抗原，TAA是非常不好的免疫原，在T细胞发育期间高度特异于TAA的T细胞不是被删除了就是被无反应化了。因此，预期的是，携带肿瘤的宿主对特定TAA的免疫反应是极其微弱的。由于破坏对目标TAA的宿主耐受性的内在需要，实验性的临床疫苗研究特别集中于开发能增强TAA特异性T细胞反应的免疫策略。一般地而言，有效的癌症疫苗必须克服免疫耐受性并且增强宿主的免疫反应到预防性和/或保护性的水平。在许多实验性疫苗研究中已经将抗肿瘤效果与对TAA的T细胞反应相关联。
在可选择的实施方式中，本发明考虑能用于诱导针对肿瘤抗原的免疫反应的免疫原性组合物(例如，癌症疫苗)。适合的组合物将含有包含编码肿瘤抗原的核酸序列的重组黑猩猩腺病毒，和生理学上可接受的载运体。在特定的实施方式中，盒的编码序列元件可以编码单个免疫原，例如，来源于自体抗原的免疫原性肽序列，例如肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，编码免疫原的核酸序列(例如，转基因)可以是为在特定哺乳动物物种中的表达优化了的密码子。在其他实施方式中，编码序列可以编码超过一个免疫原，例如一种或多种密码子优化的肿瘤抗原。例如，利用所公开的腺病毒载体的癌症疫苗可以编码自体抗原的组合，自体抗原例如HER2/neu、CEA、Hepcam、PSA，PSMA、端粒酶、gap100、Melan-A/MART-1、Muc-1、NY-ESO-1、存活蛋白、溶基质蛋白酶3、酪氨酸酶、MAGE3、CML68、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NY-CO-58、NY-BR-62、hKLP2、VEGF。
有效的癌症疫苗的开发需要鉴定能在接种的患者中引发抗原特异性免疫的策略和产生在主动免疫结束后能够留存的免疫反应。策略的成功将取决于针对目标抗原的可测量免疫反应是否与针对癌症的发生或复发的保护作用相关。已经显示了细胞介导的免疫和体液免疫的效应机制都能杀死肿瘤细胞。然而，来自实验系统的数据表明，抗原特异性T细胞是消除肿瘤细胞的最强大的免疫机制。效应T细胞对肿瘤特异性抗原(例如，TAAs)的识别预计可容许TAA象肿瘤排斥抗原一样起作用。公开的研究表明，刺激CD8+和CD4+辅助T细胞反应对于达到最优的肿瘤清除是重要的((Greenberg，P.D.(1991)Adv.Immunol.49281-355；Pardoll，D.M.et al.(1998)Curr.Opin.Immunol.10588-94)。临床反应(即，效力)已经与分泌干扰素γ的细胞毒性T细胞的增加相关联。分析方法的出现，例如在此使用的ELISPOT分析，以展现当前疫苗载运体的效力，容许研究者测量对免疫接种方式的T细胞反应，从而便于癌症疫苗的开发。
癌症疫苗可以是预防性或治疗性的。癌症疫苗的预防性用途的一般假定是，在携带肿瘤的受试者中TAA是极其弱的免疫原或功能上无免疫原性的。更具体地，在癌症免疫学领域，在患有癌症的患者中疫苗可以用作免疫疗法。因此，可以设计癌症疫苗来引发针对TAA的免疫反应，所述TAA由先存的肿瘤或恶性肿瘤表达。因而，在特定的实施方式中，治疗性癌症疫苗意图用于携带肿瘤的患者，其发展了对常规治疗方式的抗性，或在常规治疗后有发展出复发的高可能性。
腺病毒的高免疫原性使得腺病毒载体对用于疫苗载运体的情况是特别好的候选者，所述疫苗载运体被设计以破坏宿主对自体抗原的耐受性。在自体免疫疾病中首先描述的表位或决定簇传播的现象，已经与MHC I类和MHC II类限制性反应相关联，并与HER-2/neu蛋白特异性T细胞免疫的发展相关联。表位传播代表了对免疫原性蛋白的特定部分的免疫反应的产生，随后是免疫天然传播到存在于同一蛋白上的其他抗原决定簇。例如，Disis等在84％的患有过量表达HER-2/neu的恶性肿瘤的患者中观察到表位传播，所述患者被施用了疫苗，所述疫苗包含与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子混合的、来源于HER-2蛋白的可能的T辅助表位的肽(J.Clin.Oncol.(2002)20(11)2624-2632)。重要地，表位传播与HER-2/neu蛋白结构域反应的产生有关，并提示了有效地绕过了免疫耐受性的免疫。
适用于在此公开的腺病毒载体和方法作为癌症疫苗的目标的TAA应当具有许多特征。例如，目标TAA必须具有有利的表达分布型，意味着与正常组织相比，在肿瘤或恶性组织中它应当优先地表达或过量表达。此外，因为在肿瘤发生中起作用的TAA更有可能在癌症发展的不同阶段期间保留，适合的目标TAA还应当在肿瘤发展和转移的整个阶段保持。适合的目标TAA还应当在肿瘤内同质地表达。第三，适合的目标TAA必需不经受绝对的免疫耐受性。更具体地，必须有某些证据，可以识别感兴趣的TAA并对其进行应答的T细胞没有从宿主的T细胞库中完全地删除(Berinstein，N.L.，J.Clin.Oncol．29(8)2197(2002)。
癌胚抗原(CEA)具有许多特征，使它成为用作抗癌疫苗的目标抗原的吸引人的TAA。它是Ig超家族的成员，所述Ig超家族的特点在于有利的表达模式。它在超过50％的所有人类癌症中表达，并与肿瘤发生过程有关，这表明它的表达在整个癌症发展过程中可能是被选择的和保守的。此外，已经证明对CEA的免疫耐受性不是绝对的。公开的研究确定了，人类T细胞可以识别表达CEA的癌细胞，成为对表达CEA的癌细胞有活性的，并裂解表达CEA的癌细胞(Berinstein，N.L.，J.Clin.Oncol.29(8)2197(2002)。例如，用表达CEA的重组牛痘病毒免疫患者，结合随后的基于肽的体外刺激，产生了能裂解自体肿瘤的CD8+MHC限制性CTL(Tsang，K.Y.et al.J.Natl.Cancer Inst.，(1995)87982-990)。另外地，报道了手术后用重组CEA免疫结肠直肠癌患者诱导了针对CEA的弱的抗体和细胞反应(Samanci，A.，et al.(1998)Cancer Immunol.Immunother.47131-142.)。进一步的，向诊断患有结肠直肠癌的患者施用抗CEA抗独特型抗体，产生了抗CEA抗体和独特型特异性T细胞增殖(Foon，L，A.et al.(1995)J.Clin.Invest.，96334-342)。文献还表明，可以用几种不同的疫苗接种方法克服癌症患者中对CEA的耐受性(即，用重组CEA或重组正痘或禽痘-CEA病毒疫苗接种，施用抗独特型抗体，用CEA激动剂表位脉冲树突状细胞)。
CEA是癌胎糖蛋白(oncofetal glycoprotein)，其在正常胎儿结肠中表达，在正常的结肠粘膜中以小得多的程度表达。它还在大多数腺癌，特别是结肠、胰腺、乳房、肺、直肠和胃的腺癌中过量表达。许多结肠直肠癌症和一些癌瘤产生在血清中可测量的高水平的CEA，这使之成为最广泛使用的恶性肿瘤的血清学标记，特别是在患有结肠直肠癌的患者中。
提供了用于本发明的组合物和方法的适合的免疫原的第二种TAA是HER2/erb-2(也称为neu)原癌基因的产物。象CEA一样，HER2/neu具有有利的表达模式，并且不经受绝对耐受性。更具体地，在正常成年人各种组织，包括皮肤和乳房，和胃肠道、生殖道、和泌尿道的组织的上皮细胞中，检测到低水平的HER2/neu转录产物表达和185 kD的多肽产物；在胚胎发育期间在相应的胎儿组织中检测到更高水平的表达(Press et al.，Oncogene 5953-962(1990)。几个系列的证据暗示了在人类乳房、肺、前列腺、卵巢、子宫内膜