专利名称：双杀伤功能的重组腺病毒的构建及其在肿瘤治疗中的应用的制作方法 目前恶性肿瘤已成为一个严重威胁各国人民健康和生命的问题。据1997年5月世界卫生组织(WHO)在日内瓦发布的世界健康状况报告，1997年与二十世纪70年代肿瘤发病率相比上升了近30％，预测未来25年间，世界大部分国家患肿瘤的病人数量可能大大增加。到2005年，欧盟国家妇女肺癌将增加33％，男性前列腺癌将增加40％，全世界每年将有630万人死于各种肿瘤。我国同世界其他国家一样，近年来肿瘤的发病率有了较大增加，肿瘤在我国已成为仅次于心脑血管病的第二致死病因。当前我国大多数临床医疗单位仍沿用传统的手术切除、放、化疗法治疗恶性肿瘤。这些疗法对早期肿瘤可获得比较满意的效果，但对中晚期伴有远端转移的患者，则难以取得满意的疗效。因此癌症的治疗已成为世界医务工作者迫切需要解决的问题。近十余年来，随着免疫学、分子生物学及基因工程技术的飞跃发展，又诞生了第四种治疗癌症的新方法即生物疗法。该疗法大体分为三部分，即细胞因子治疗、体细胞治疗和基因治疗，但最具潜力的当属基因治疗。恶性肿瘤的基因治疗是指将同源性外源基因导入人体，最终达到直接或间接杀伤肿瘤细胞的目的。恶性肿瘤的基因治疗疗效的好坏，主要取决于两个方面一是载体，二是目的基因的有效性。可用于导入人体目的基因的载体有两种，其一是非病毒载体，其二是病毒载体。目前肿瘤基因治疗多用病毒载体，已报道的病毒载体多为经遗传修饰的病毒，如逆转录病毒(Retrovirus)、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)、单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus)、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、细小病毒(Parvoviruses)、甲病毒(Alphavirus)和辛德毕斯病毒(Sindbis Virus，SIN)等。在使用病毒载体时，以基因治疗病毒载体具备低毒、高效及大容量作为先决条件。本申请选用Ad5为载体，因为腺病毒与其它病毒载体相比有如下优点1)-宿主范围广，可感染人及多种哺乳动物，分裂期及静止期细胞均感染(细胞表面有CAR受体)；2)感染滴度高，在293细胞中rAd滴度可达107-109pFu/ml；3)安全性好，除Ad4，7，11，21和37型对人有致病作用及Ad12型对人细胞有潜在转化作用及动物致瘤作用外，其他型别感染人后均无明显症状。腺病毒疫苗在美国军队中已使用近三十年，证明是安全有效的；4)表达的大量外源蛋白活性接近翻译后水平成熟蛋白质，即有很好的磷酸化和糖基化；5)稳定性好，-80℃可保存多年，冻干后不需冷藏；6)应用方便，可口服、滴鼻气管、静脉、腹腔、皮下和肌肉多途径使用。既往的大量研究已证明，肿瘤的发生和发展是一个多阶段的复杂过程，往往涉及多种基因的异常。不同组织类型的肿瘤或同种肿瘤不同患者的基因异常情况也不尽相同。因此单靠一种基因很难达到广泛而有效的治疗效果。在这种情况下，通过向患者体内导入多种目的基因从多个环节控制肿瘤的发生、发展，确立联合多基因治疗策略才是最佳方案。因此在目的基因的有效性方面，除目的基因的靶向性外，还强调的一点是用同一载体插入串联连接或融合连接的两个或更多的基因，这样就相对降低了载体的使用量，从而降低了宿主对载体的免疫应答，而又能发挥多基因的联合作用，如2000年，美国学者Rogulshi KR等构建了含双自杀基因的腺病毒载体AdCDglyTK-5Fc/GCV系统，Kim等将TK及CD基因联合应用治疗肿瘤发现靶向性及放疗敏感性均比单一应用时高。而Adachi等把CD和UPRT两种基因联合应用于肿瘤治疗显示了抗肿瘤效果的协同作用。
本发明的总构思是使用两个自杀基因胞嘧啶脱氨酶基因(CD gene)和胸苷激酶基因(TK gene)及内皮抑素基因(ES gene)以九个甘氨酸的碱基序列为连接体构成CDglyES或TKglyES融合基因作为目的基因。借助重组病毒载体导入体内后可通过CD基因表达的胞嘧啶脱氨酶脱氨，转化无毒性的化疗药前体5FC为细胞毒性5FU，直接在局部杀伤瘤细胞；通过单纯疱疹病毒TK基因表达胸苷激酶将GCV/ACV转化成三磷酸GCV/ACV，其在细胞DNA合成中取代鸟苷三磷酸，抑制瘤细胞DNA聚合酶活性，抑制DNA链的延伸，使瘤细胞死亡；通过内皮抑素基因表达内皮抑素，抑制快速增殖的新生血管内皮细胞(对正常血管内皮细胞几乎无作用)从而抑制了肿瘤新生血管形成，切断肿瘤的氧气及营养物供应，使肿瘤细胞死亡，此即肿瘤的饥饿疗法；另外内皮抑素通过抑制新生血管形成尚能抑制亚临床转移灶形成及远端转移。
通过重组腺病毒载体同时表达自杀基因产物通过转化化疗药前体为化疗药直接杀伤瘤细胞和表达内皮抑素通过抑制血管内皮细胞，抑制血管形成阻断肿瘤的氧及营养供应间接杀伤瘤细胞，从两个途径杀伤瘤细胞。
转染了该重组腺病毒的瘤细胞能明显增加对放疗的敏感性，这样更易于与放疗联合应用大大增加总疗效。
本发明的目的是构建双杀伤功能的融合基因的重组腺病毒最终以两个途径杀伤肿瘤细胞。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下一、构建含CDglyES融合基因的重组腺病毒rAdCDglyES1.从已构建的E1和E3缺失的在E1区插入了CD基因的重组腺病毒rAdE1CMVCD中用PCR方法扩增CD基因，纯化鉴定后将其插入相同双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV构建成含CD腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV-CD。
2.从人新鲜肝癌组织中克隆内皮抑素基因首先从肝组织中提取总RNA，通过逆转录合成cDNA第一链，然后根据genebank的ES全序列合成上下游引物，用cDNA第一链为模板用PCR法扩增获得人内皮抑素基因，经琼脂糖电泳、酶切及测序，证实其序列长度为573bp，然后克隆到pEZZ18质粒构成pEZZ18-ES质粒。用构建的pEZZ18-ES质粒为模板，以加有与腺病毒穿梭质粒多克隆位点相应内切酶序列的ES上下游引物(ES上游引物带有9个glysen序列)，做PCR，获取能插入质粒的glyES片段。然后将获得的glyES基因片断插入含CD的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV-CD的CD基因下游，构成含CDglyES融合基因的腺病毒穿梭质粒pAdE1CMVCDglyES。
3、将pAdTrackCMVCDglyES质粒用Pmel酶切后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1通过电穿孔转移宿主菌Bj5183，在菌体内同源重组构成含CDglyES融合基因的重组腺病毒质粒pAdCMVCDglyES。
4、将pAdCMVCDglyES质粒用Pacl酶切成线性，用脂质体法转染293细胞，用GFP监控转染，7天后收获重组腺病毒rAdCDglyES。
二、构建含TKglyES融合基因的重组腺病毒rAdTKglyES方法与构建含CDglyES融合基因的重组腺病毒rAdCDglyES的方法相同，仅将CD基因换为HSV-I-TK基因。
下面结合具体的实施例对本发明的重组腺病毒Ad5中融合基因的单基因功能作进一步说明


下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1含CDgene腺病毒穿梭质粒的构建图2pAdTrackCMV-CDglyES构建流程3含CDglyES融合基因的重组腺病毒构建图4作用48小时，不同浓度AdlacZ对Hela细胞抑制率的比较图5作用48小时，不同浓度rAdCDglyES对Hela细胞抑制率的比较图6给药6天时不同组小鼠的肿瘤生长情况图7给药6天时不同组小鼠的肿瘤生长情况图8不同组小鼠瘤重变化对比图a(I组)为DMEM阴性对照；b(II组)为AdLacZ病毒对照；c(III组)为rAdCDglyES·实验一组；d(IV组)为rAdECDglyES·实验二组图9对照病毒AdLacZ、GCV作用后Hela细胞生长抑制率图a病毒浓度为0 TCID50/0.1ml；b病毒浓度为104TCID50/0.1ml；c病毒浓度为105TCID50/0.1ml；d病毒浓度为106TCID50/0.1ml。GCV作用48小时。
图10不同前体药物GCV、ACV作用于转染rAdTKglyES后Hela细胞抑制率比较图11rAdCDglyES 293细胞培养上清对ECV-304细胞的生长抑制率的比较
实施例1.rAdCDglyES中CD基因功能验证对含CDglyES融合基因的重组腺病毒rAdCDglyES的融合基因中CD生物活性进行了体内、外验证，已证实在表达的融合基因中，仍显示独立的CD酶活性。
A.体外实验方法1)生长良好的Hela细胞用0.02％EDTA消化；然后加入96孔板中，5000个细胞/孔，37℃5％CO2环境中培养成单层。
2)将仅含Lac Z的对照重组腺病毒AdLacZ和rAdCDglyES分别稀释成105、106和107TCID50/0.1ml，分别加入到单层肿瘤细胞的96孔板中，每孔0.1ml。每个稀释度每种病毒浓度做6孔，37℃5％CO2环境中培养12小时。
3)弃病毒液，用1640培养基洗细胞两次，继用细胞全培养液培养12-18小时。
4)将5-FC用细胞全培养液稀释成40、400、4000μmol/L，加入到上述96孔板中，每个固定浓度做6个复孔，37℃5％CO2环境中培养48小时。
5)每孔加入10μl 0.01M MTT，37℃5％CO2环境中培养45分钟。
6)弃上清，每孔加入DMSO 0.1ml，轻轻震摇5-10分钟，测OD570值，并按下述公式计算细胞生长抑制率 结果用AdLacZ作对照观察AdCDglyES中CD/5FC系统对人宫颈癌Hela细胞的体外抑制作用，结果如图4、图5和下表1所示表1.AdlacZ和rAdCDglyES作用48小时后对Hela细胞抑制率的比较表 ※上表中前药浓度单位为μmol/L；病毒单位为TCID50/0.1ml。
从上图、表中可看出，不带有目的基因的AdLacZ病毒48小时对Hela细胞抑制率仅为11％左右，其随前药浓度和病毒浓度增加变化不明显；而rAdCDglyES组48小时对Hela细胞抑制率接近60％，抑制率随前药浓度和重组病毒浓度增加而增加。这一结果证实了重组病毒所含融合基因有CD基因活性。
B.体内实验
方法(一)建立荷瘤T739近交纯系小鼠模型(接种L795小鼠腺癌细胞株)。
(二)观察rAdCDglyEs系统中CD/5FC体内抑瘤活性1.分组将小鼠随机分为4组，每组10只I组DMEM培基阴性对照组II组AdLacZ病毒对照组III组为rAdCDglyES/5Fc试验一组IV组为rAdCDglyES/5Fc试验二组另设20只小鼠为正常对照(即不荷瘤不治疗组)2.荷瘤后第三天始进行治疗1)I组每只小鼠瘤体注射DMEM 0.1ml。
2)第II组每只小鼠瘤体注射AdLacZ 0.1ml(浓度为106TCID50/0.1ml)。
3)第III、IV组每只小鼠瘤体均注射rAdCDglyES 0.1ml(浓度为106TCID50/0.1ml)。
3.在荷瘤后第三天开始给小鼠口服前体药1)第I组每只小鼠口服生理盐水0.2ml/天2)第II、III组每只小鼠口服5Fc 500mg/kg/天3)第IV组每只小鼠口服5Fc 1000mg/kg/天各组均连续服药11天4.荷瘤后第四天起，每天测量、计算各组小鼠的瘤体重量，计算方法为 瘤重＝A×B2/mg(A长径，B短径)，连续测量11天。
5.连续观察每组小鼠，直至其死亡。并记录每只小鼠生存天数。
结果(一)用药后第6天各组小鼠瘤体形态及重量(均值)的比较结果见图6、图7及图8。
从图6-8可见，对照I和II组小鼠给药至十一天时，小鼠瘤体平均重量达7000-8000mg，而两试验组小鼠瘤体重量仅为3700-4200mg，实验组与对照组相比，显示瘤体生长有极其明显的差异。
(二)小鼠生存期的比较从荷瘤后第15天起，对照组小鼠开始死亡，各组小鼠平均生存期见下表2，从表2可看出，对照组小鼠平均生存期约为18天，而治疗组为23天。这一结果表明，荷瘤小鼠经rAdCDglyES/5Fc系统治疗后，明显延长了荷瘤小鼠的生存期，从体内证实了融合基因CDglyES具有CD活性。
表2各组小鼠生存期的比较

实施例2.rAdTKglyES中TK基因功能验证目的是证实含融合基因的重组腺病毒rAdTKglyES融合基因TKglyES具有TK生物活性。
方法体内外实验方法同实施例1，仅化疗药前体用GCV或ACV替换5Fc。结果体内实验结果如图9、图10和表3所示。
表3.Hela细胞经AdLaCZ(TCID50/0.1ml)、GCV(μmol/l)和rAdTKglyES(TCID50/0.1ml)作用48小时后细胞生长抑制率(％)

从表3、图9和图10可见，和CD表达产物一样，rAdTKglyES/ACV或rAdTKglyES/GCV系统作用Hela细胞48小时对Hela细胞的生长抑制率高达82％，而AdLacZ则仍在13％左右。体外证实了融合基因具有TK活性。
体内试验结果与实施例1非常类似，在此不重复描述。
实施例3.rAdCDglyES中ES基因功能验证内皮细胞抑制试验方法1.将生长良好的人脐静脉内皮细胞(ECV-304)用0.02％EDTA消化成单层细胞，用含有内皮细胞生长因子(ECGF)5mg/L的1640营养液稀释成2×108细胞/L，接种96孔板，除第一列只加营养液外，余孔每孔加0.2ml。37℃5％CO2环境中培养成单层。
2.吸去液体，第一列空白对照及第二列细胞对照加营养液，第3～5列加入只含CD基因的重组腺病毒rAd-CD原浓度细胞培养上清液，第6～8列加入6倍浓缩的rAdCDglyES细胞培养上清液，第9～11列加入原浓度的rAdCDglyES细胞培养上清液原液，每种每孔加入0.2ml，37℃5％CO2环境中培养48小时。
3.每孔加入MTT溶液20μl，继续培养4小时。
4.吸去液体，每孔加200μl DMSO，振荡混匀10分钟。
5.自动酶标仪测OD570，按以下公式计算抑制率 结果用rAd-CD重组腺病毒为对照，用ECGF处理后的快速增殖的ECV-304细胞为靶，观察rAdCDglyES对快速增殖的内皮细胞的抑制作用结果如图11和表4所示。
表4.rAd-CD和rAdCDglyTK细胞培养上清对ECV-304细胞的生长抑制率的比较n X SDrAd-CD supemant 9 24.2％ 9.7％rAdCDglyTK supemant 9 28.8％ 6.3％6×rAdCDglyTK9 78.7％ 1.8％F＝180.277 P＜0.01
从表4及图11可见，rAd-CD对经ECGF处理的快速增殖的ECV-304内皮细胞抑制率为24％左右，而经6倍浓缩的rAdCDglyES上清对该细胞的抑制率高达78％。这一结果证实了rAdCDglyES中的ES基因活性未受影响，表达融合蛋白具有内皮抑素活性。
rAdTKglyES中ES基因活性的验证结果同实施例3，在此不再予以重述。
注释本发明的双杀伤功能的重组腺病毒，已于2002年12月19日交中国典型培养物保藏中心保藏。
保藏号CCTCC-V202009株号0106符号rAd5CDglyES


双杀伤功能的重组腺病毒的构建及其在肿瘤治疗中的应用。它是以缺失E1的已构建的rAdCD、rAdTK及新鲜人肝癌旁正常组织为材料，分别行PCR扩增出CD、TK和ES基因片段，将CD－ES或TK－ES以融合基因的形式插入穿梭质粒(pAdTrack－CMV)，构成目的穿梭质粒(pAdTrack－CMVCDglyES或pAdTrack－CMVTKglyES)，再与腺病毒5型骨架质粒pAdEasy－1在细菌内同源性重组，获得重组腺病毒质粒，转染293细胞，获得二种双杀伤功能的重组腺病毒。所构建的重组腺病毒安全、稳定，能够从直接杀伤瘤细胞和抑制肿瘤新生血管形成，阻止瘤细胞远端转移间接杀伤瘤细胞两个途径杀伤肿瘤，是一种崭新的肿瘤基因治疗方法。